IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA, SZEROLÓGIAI REAKCIÓK

Az előadások a következő témára: "IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA, SZEROLÓGIAI REAKCIÓK"— Előadás másolata:

1 IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA, SZEROLÓGIAI REAKCIÓK
(KOMPLEMENT MEDIÁLT LÍZIS, PRECIPITÁCIÓ, AGGLUTINÁCIÓ) (Az Ag-Ea kölcsönhatást követő másodlagos szerológiai reakciók)

2 C3 KONVERTÁZ C3b Antigén-ellenanyag komplex Mannóz Patogén felszín MBL
MASP-1/MASP-2 Szerin proteáz C4, C2 C3 B, D C1q, C1r, C1s Szerin proteáz C4, C2 C3 KONVERTÁZ C4a* C3a, C5a C3b TerminálisC5b – C9 Opszonizáció Kötődik a fagocita CR-hoz Immunkomplex eltávolítás Gyulladási peptid mediátorok Fagocita toborzás MAC Patogén/sejt lízis

3 A MAC pórust képez a lipid bilayer membránban
Élő és elpusztított baktériumok MAC a sejtfelszínen

4 Szérum komplement aktivitás titrálása
Y komplement fehérjék a humán szérumban növekvő mennyiségű humán szérum Szérum komplement aktivitás titrálása hemolízis

5 KONTROLL KÍSÉRLETEK Y Y Y Negatív kontroll Pozitív kontroll Hemolízis
hőinaktivált humán szérum fiziológiás sóoldat desztillált víz Y Y Y Negatív kontroll Pozitív kontroll Hemolízis (ozmolízis) Ülepedés Ülepedés

6 KOMPLEMENT KIMERÍTÉS Y 1 2 csökkenő mennyiségű anti-BSA ellenanyag
felülúszó csökkenő mennyiségű anti-BSA ellenanyag komplement a humán szérumban BSA anti-BSA ellenanyag KOMPLEMENT KIMERÍTÉS növekvő mennyiségű felülúszó növekvő mennyiségű felülúszó növekvő mennyiségű felülúszó

7 Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott (oldható) komplexei.
IMMUNKOMPLEX Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott (oldható) komplexei. A komplexképződés pillanatszerűen is lejátszódhat, egyensúlyra vezető folyamat. Nem azonos a precipitátummal! A precipitátum az immunkomplexekből fizikai-kémiai folyamatok során keletkező oldhatatlan csapadékot jelenti. Időigényes folyamat.

8 Precipitációs görbe EKVIVALENCIA ellenanyagtúlsúly antigéntúlsúly
sok csapadék kevés csapadék növekvő antigén mennyiség ellenanyagtúlsúly sok csapadék antigéntúlsúly kevés csapadék növekvő ellenanyag mennyiség

9 -valencia hőmérséklet pH sókoncentráció idő egyéb (pl. PEG)
Ekvivalenciát befolyásoló tényezők: -valencia (kapcsolatteremtő képesség) hőmérséklet (37оC ; 4 оC ) pH sókoncentráció idő egyéb (pl. PEG) IgM-pentamer IgA-dimer Oldékonyságot csökkenti, kedvez a csapadék-képződésnek

10 MÓDSZEREK Immundiffúzió: (lágy gélközegben)
- radiális egyszerű (ellenanyagot vagy antigént keverik a gélbe) - radiális kettős (mindkét komponens diffundál a gélben) Elektroforézis: - immunoelektroforézis (többkomponensű antigént elektroforetizálják, majd polivalens ellenszérummal reagáltatják.) - rakéta elektroforézis (ellenanyagot gélbe keverik, antigént elektroforetizálják) - két-dimenziós elektroforézis (elektroforetikus tulajdonságok alapján szétválasztott antigén frakciókat ellenanyag tartalmú gélen újra Turbidimetria (a fényszórással arányos fényintenzitás csökkenését méri) Nefelometria (a szórt fény intenzitását méri)

11 Immundiffúziós módszerek Radiális kettős immundiffúzió
jobb oldali 3 ábra: fent: 1 és 1 antigén azonos középen: 1,2,3 különböző antigének alul: 1 és 2 részben azonos, de a 2-n van legalább egy olyan epitop ami az 1-en nincs (ezért a „sarkantyú”) Radiális kettős immundiffúzió Antigének közös determinánsainak vizsgálata

12 Antigén koncentráció meghatározása radiális immundiffúzióval
Antigént tartalmazó lyuktól való távolság Az optimális arányt adó antigén koncentráció. IgG koncentráció mérése szérumból radiális immundiffúzióval. A standardok átmérője lehetővé teszi a kalibrációs görbe megrajzolását. A vizsgált szérum minta IgG koncentrációja a görbéről leolvasható: - T1 – IgG mielómás beteg szérumából; 15 mg/ml - T2 – hipogammaglobulinémiás beteg széruma; 2,6 mg/ml - T3 – normál szérum; 9,6 mg/ml A gyűrű átmérője IgG koncentráció (mg/ml) Radiális immundiffúzió: az antigén koncentráció és a precipitációs gyűrű méretének kapcsolata. A nagyobb koncentrációjú antigén (Ag1) a lyuktól messzebbre vándorolva éri el azt az egyensúlyi állapotot, ahol a megfelelő ellenanyag-mennyiséggel precipitátumot képez. Precipitációs gyűrű Antigén koncentráció

13 Immunelektroforézis Immunprecipitáció - - + + - +
polivalens immunszérum antiszérum - + szérumfehérjék Immunprecipitáció Az antigén-ellenanyag kapcsolódást követően képződő oldott immunkomplexeket szilárd fázishoz kötött anti- immunglobulin vagy protein A/G bakteriális fehérjék segítségével oldhatatlan formában izolálják. A szilárd fázishoz kötött immunkomplexek további elúciós lépések eredményeként, oldott állapotban visszanyerhetők. (lásd a következő szemináriumon/gyakorlaton)

14 Rakétaelektroforézis
A rakéta alakú precipitációs csúcsok magassága arányos az antigén koncentrációjával

15 Szerológiai módszerek alkalmazása
Immundiffúzió: pl: bakteriális, virális és gomba antigének jellemzésére - radiális egyszerű (Mancini-módszer): antigének mennyiségének összehasonlító vizsgálata, szérum fehérjék ( immunoglobulin izotípusok [IgM, IgG, IgA], akut fázis fehérjék, transzferrin, komplement komponensek) mennyiségi meghatározása különböző testfolyadékokban, ellenanyagok mennyiségi meghatározása - radiális kettős (Ouchterlony módszer): precipitációs ekvivalencia zóna becslése, precipitáló ellenanyagok relatív szintjének (titerének) meghatározása, állandó ellenanyag koncentráció mellett az antigén mennyisége is megbecsülhető Elektroforézis: - immunoelektroforézis: szérum fehérjék frakciókra való elválasztása, plazmasejt diszkráziák (mielóma multiplex, Waldenström makroglobulinémia, elsődleges amiloidózis) során képződő, monoklonális eredetű immunoglobulinok kimutatása - rakéta elektroforézis: antigén/ellenanyag koncentráció meghatározása - két-dimenziós elektroforézis: elektroforetikus mobilitás alapján szétválasztott frakciók (pl: szérum fehérjék) koncentrációjának meghatározása, szérum, vizelet, cerebrospinális folyadék fehérjeösszetételének kvantitatív és kvalitatív vizsgálata Turbidimetria: (érzékenység: 50 µg/ml) szérumban, liquorban nagy mennyiségben jelen lévő fehérjék vizsgálata Nefelometria: (érzékenység: 1 µg/ml) kis koncentrációjú szérum és liquor fehérjék, gyógyszer szintek mérése

16 Agglutináció típusai, gyakorlati alkalmazás
A vörös- és fehérvérsejtek valamint baktériumok sejtfelszíni antigénjeivel (legalább mikroszkópikus méretű antigének) reagáló ellenanyagok a sejtek összeállását, agglutinációját idézhetik elő. Fajtái: direkt: Ellenanyagok kötődését az antigénhez a sejtek összecsapódása kíséri (pl. AB0 vércsoport antigének) - főleg IgM indirekt : Az antigén determinánsok elrendeződése nem teszi lehetővé az direkt összecsapódást. DE! A sejtek összecsapódása a kötött ellenanyagok Fc részéhez kötődő második ellenanyaggal kiváltható (pl. D vércsoport antigén(Rh)) (IgG) passzív: Megfelelően kezelt vörösvértestekhez vagy latex részecskékhez haptének vagy antigének kapcsolhatók, és ezekre specifikus ellenanyaggal agglutinálhatók (rheumatiod arthritis). A szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM és IgG autoellenanyagok (RF) jelennek meg.

17 - reakció - reakció + reakció gyors ülepedés lassú ülepedés

18

19 ellenanyag (antitest)
Direkt agglutináció ellenanyag (antitest) vörös-vértest pl. AB0 vércsoport meghatározás

20 Az ABO vércsoportantigének szerkezete
O ANTIGÉN A ANTIGÉN B ANTIGÉN SZÉNHIDRÁT TÍPUSÚ ANTIGÉNEK A fenotípusok kialakulását kodominánsan öröklődő specifikus enzimek irányítják.

21 Donorválasztás az ABO-vércsoport antigének alapján
Ma már csak elvi lehetőség, rutinban kizárólag csoportazonos (AB0 és Rh) vér transzfundálható! - + + + - - + + - + - + - - - -

22 Indirekt agglutináció
pl. Rh vércsoport meghatározás

23 Vércsoport meghatározás
Ágy melletti gyorsteszt Microplate-s meghatározás Hagyományos csempés meghatározás Gélkártyás technika Gyorsteszt – lemezre szárított anti-A, B, D antitestekkel (agglutinációt figyelik) Csempés – tesztelendő vérhez folyékony antiszérum (agglutináció) (kétoldalas teszt , ha a beteg szzérumát is hozzáadják ismert vércsop. vérhez) mikroplét – beszárított antitestekkel (agglutináció) gélkártya – automatában használják, a hozzáadott vérből keletkező agglutinátum nem centrifugálható le a gélben

24 A Rhesus (Rh) vércsoportantigén (D)
FEHÉRJE ANTIGÉN extracelluláris tér citoplazmamembrán intracelluláris tér IgG típusú ellenanyag direkt agglutinációt nem vált ki (inkomplett ellenanyag), de emberi immunglobulinokkal reagáló 2. ellenanyaggal az agglutináció kiváltható indirekt agglutináció

25

26 Az agglutináció in vivo következményei
ABO inkompatibilitás intravascularis haemolysis (komplement mediálta hemolízis) Rh inkompatibilitás erythroblastosis fetalis (vvt-ek opszonizálása, majd MF –ok, granulociták általi fagocitózis) Rh profilaxis Ha az első Rh+ magzat születését követően 72 órán belül az anyai szervezetbe anti-D Ea-t juttatnak, megelőzhető az anyai ellenanyagok képződése.

27 Újszülöttek hemolítikus anémiája
Miért nem alakul ki az első Rh+ magzattal szemben immunreakció? - Mert csak a szülés kapcsán kerül elegendő antigénstimulust jelentő vvt az anyai keringésbe. (Immunogenitást meghatározó tényező az antigén mennyisége!) Van-e kivétel az előző szabály alól, miért van/nincs? - 20. hét utáni vetélés, amniocentesis, transplacentaris vérzéssel járó más szülészeti beavatkozás, ok: ld. előző magyarázat! Miért adunk anti-D IgG-t profilaktikusan? - Mert a bekerülő Rh+ vörösvértesteket azonnal eliminálja, mintegy „elrejti” az anyai immunrendszer elől. Miért véd az AB0-inkompatibilitás az Rh-inkompatibilitás következményeitől? - Mert az anti-A és anti-B ellenanyagok természetesen is állandóan jelen vannak (ezen antigének pl. a érendothelen, a bélbaktériumokon is kifejeződnek), és azonnal eliminálják az inkompatibilis vörösvértesteket. (maszkírozás, ld. előző magyarázat!) Miért ritkább az AB0-inkompatibilitásból eredő hemolítikus betegség? - Mert az AB0-antigének szénhidrátok, IgM izotípusú ellenanyagok termelődnek ellenük. Az IgM ellenanyagok nem jutnak át a placentán.

28 (diagnosztikai/indikátor módszer)
Passzív agglutináció (diagnosztikai/indikátor módszer) Rheumatoid arthiritis: a szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM autoellenanyagok (RF) jelennek meg. RF: reuma faktor

29 Passzív hemagglutináció gátlása oldott Ag-nel
Szerintem ezt sehol máshol nem ismerik csak itt a szemináriumon Oldott haptén vagy Ag gátolja az agglutinációt. pl. Monoteszt terhességi teszt: vvt-k felszínéhez hCG-t kapcsolnak és hormon specifikus ellenanyaggal váltják ki az agglutinációt. Ha ehhez a rendszerhez terhes nő vizeletét adjuk (oldott hCG!), akkor gátoljuk az agglutinációt.

30 Hemagglutináció ellenanyagok jelenléte nélkül?
(Nem immunológiai reakció!!!) Igen, virális fehérjékkel pl.: influenza, mumpsz pl. vírus ellenes ellenanyagok kimutatása Az agglutinációt gátló ellenanyagok a receptor kötést (sziálsav) is gátolják, tehát vírusneutralizáló sajátságúak

31 Gyakorlati alkalmazás
direkt agglutináció: pl. ABO vércsoport meghatározás tiphoid láz kimutatása Widal teszt (baktériumokat agglutinál a páciens széruma) indirekt agglutináció: pl. anti-D Ea jelenlétének kimutatása Coombs teszt passzív agglutináció: pl. rheumatoid arthritis kimutatása