Az elsődleges antigén – ellenanyag kapcsolódáson alapuló

Az előadások a következő témára: "Az elsődleges antigén – ellenanyag kapcsolódáson alapuló"— Előadás másolata:

1 Az elsődleges antigén – ellenanyag kapcsolódáson alapuló
preparatív és analitikai módszerek immunoszorbens (immunprecipitáció) ELISA immunoblot immunhisztokémia

2 Ellenanyag tisztítás antigén immunszorbensen
oszlop polimer gyöngyök oszlop töltelék affinity purifed antibody : a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják. rákötött antigének

3 tisztítandó ellenanyagok hozzáadása poliklonális ellenanyag
kötődés mosás elúció Antigén specifikus poliklonális ellenanyag

4 hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok
Fordítva is összeállítható a rendszer: Fehérje(antigén) tisztítás ellenanyag immunszorbensen oszlop polimer gyöngy Tisztítandó oldat felvitele oszlop töltelék Kötődés Mosás Elúció hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok Tisztított antigén

5 ELISA Enzyme Linked Immune Sorbent Assay ELISA plate (lemez)
lyuk avagy kút Különböző lemezek – speciális felület kezelés ellenanyag, peptid kötésre

6 felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok
enzyme linked immune sorbent enzim felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok ellenanyaghoz konjugált enzim

7 Az ELISA vizsgálatban az antigén mennyiségével arányos mértékű az enzimaktivitás
Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-elleanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay

8 Szekunder ellenanyagok
Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai (hatékonyság, érzékenység, kényelem, megbízhatóság, ár) Direkt módszer Indirekt módszer Jelzés Szekunder ellenanyagok Jelzés Primer ellenanyag Antigén

9 Enzim-antienzim rendszer
Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Enzim-antienzim rendszer PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz Enzimek A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyag Szekunder ellenanyag (faj v. izotípus specifikus) Primer ellenanyag Antigén

10 Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek
Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni (B7 avagy H vitamin) Egyszerű ABC Avidin Biotin enzimComplexek Jel felerősítése Avidin-enzim komplexek Biotin-enzim komplex Avidin Biotinált ellenanyag Antigén

11 Lásd a következő példákat.
A különféle direkt-indirekt, biotin-avidin rendszereket összekombinálva is használják. Lásd a következő példákat.

12 egyszerű indirekt ELISA lépései
Antigén specifikus elleanyag, vagy az antigén egyszerű kimutatásához Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával - rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid segítségével az antigén kitapasztása (coating avagy fedés) felesleges ellenanyagok kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges fehérjék kimosása felesleges antigén kimosása specifikus ellenanyagok hozzáadása Enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid

13 kombinált „szendvics” ELISA
Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok, vagy keverékek esetén is ez használható (pl. liquor). citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása felesleges konjugátum kimosása A nem kötődő anyagok kimosása felesleges fehérjék kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges ellenanyagok kimosása citokintartalmú minta hozzáadása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása

14 kompetitív ELISA Érzékenysége miatt szolúbilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez - A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás - Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés - Mosás - Kromogén anyagok hozzáadása

15 ELISA hibák Aspecifikus kitapadásból eredő hiba - akár közvetlenül
Az antigén mellett a plasztik felületre kitapadhatnak maguk az ellenanyagok is - akár közvetlenül - akár indirekten a színreakció ugyan az A fehérjék aspecifikus kitapadása csökkenthető: telítéssel/blokkolással detergens alkalmazásával

16 A kimutatás során használt kromogének karcinogén hatásúak lehetnek!
Elkészült ELISA lemezek A kimutatás során használt kromogének karcinogén hatásúak lehetnek!

17 Western blot módszerrel
Antigén azonosítása Western blot módszerrel Lépések: Minta előkészítés ( szöveti vagy sejtes) Gélelektroforézis Blottolás Jelölés Előhívás Felhasználás: fehérje keverékek egyes komponenseinek ellenanyag segítségével történő kimutatására

18 Western Blot Az egyik leggyakrabban alkalmazott olyan módszer a molekuláris biológiában amiben ellenanyagokat használnak SDS-PAGE gél  a minta fehérje komponenseinek elválasztása molekulatömegük alapján Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik Protein minta Standard Fehérje detektálás specifikus ellenanyag-epitóp kölcsönhatás alapján Western blot SDS-PAGE Membrán

19 Western Blot Segítségével egy adott fehérje jelenléte kimutatható a mintában Az egymástól elektroforézissel elszeparált fehérjéket /Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)/, membránra transzferálják Primer ellenanyagot (monoklonális vagy poliklonális) használnak a vizsgált fehérje kimutatásához Enzimmel (pl. torma-peroxidáz) konjugált szekunder ellenanyag segítségével mutatják ki a primer ellenanyag kötődését

20 Megnövelt kemilumineszcencia /Enhanced chemiluminescence (ECL)/
H2O2 jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidálja a diacilhidrazidokat (pl luminol) Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával detektálható A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák (pl 6-hidroxi-benzothiazol) jelenlétében körülbelül 1000-szeresére növelhető (enhancer) Immobilizált proteinek Primer ellenanyag Fab Fc Torma- peroxidáz luminol H2O2 h Epitóp a protein felszínén luminol enhancer Detektálás H2O Szekunder ellenanyag Membrán

21 Immunhisztokémia Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban Immunfluoreszcencia fluoreszcensen jelzett ellenanyag FITC – fluoreszcein izotiocianát PE – fikoeritrin Immunoenzim módszer enzimmel konjugált ellenanyag P – peroxidáz PA – alkalikus foszfatáz (a szubsztrátból oldhatatlan, színes csapadékot képeznek)

22 IMMUNHISZTOKÉMIA Festés előtti metszet FIXÁLÁS METSZÉS Szövetminta
FAGYASZTÁS

23 Immunhisztokémia ABC Technika
Biotinált Enzim Avidin Szekunder antitest Primer antitest Tárgylemez Sejtek (sejttenyészetek) Szövetmetszet

24 Acute bronchopneumonia (hematoxilin- eozin festés)
Hisztokémia Acute bronchopneumonia (hematoxilin- eozin festés)

25 (CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)
Immunhisztokémia (CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)

26 Fluoreszcens immunhisztokémia
Anti-nukleáris autoantitestek SLE-ben (FITC)

27 Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC) Aktin mikrofilamentek kimutatása

28 Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt
Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt. A mitokondriumok kimutatásához egér IgG-t (anti–OxPhos Komplex V) és Alexa Fluor 555 festékkel konjugált kecske anti-egér IgG-t használtak. Az F-actin jelölése Alexa Fluor 488 festékkel konjugált phalloidinnel (gombatoxin) történt, a sejtmagot TO-PRO-3 jodiddal festették meg.

29 Peroxiszómák kimutatása fixált és permeabilizált endotél sejtben
(pulmonáris artéria). A peroxiszómák detektálásához peroxiszómális membrán protein 70 elleni monoklonális egér ellenanyagot és Alexa Fluor 488 festékkel jelölt kecske anti-egér IgG-t használtak. A mitokondriumokat MitoTracker Red festékkel jelölték meg a fixálás előtt; a sejtmag kimutatása DAPI festékkel történt.

30 Szerzett immunhiányos szindróma (Acquired Immune Deficiency Syndrome – AIDS)
Bizonyos betegségek az immunrendszer szupresszióját, vagy működésének zavarát okozhatják. A XX. század elején, amikor a tuberkulózis volt a legfőbb halálok, s a népesség 50%-a tuberkulin-pozitív volt, jól ismert volt az a tény, hogy egy egyidejű kanyarófertőzés az egyébként problémamentes TB-fertőzés hirtelen súlyosbodásához és halálhoz vezethet. A pontos mechanizmust mára tisztázták: az immunszupresszió hátterében az IL-2 szintézis csökkenése áll, miután a kanyaró vírus a makrofágok CD46 receptorához kötődött.

31 Az immunválaszra gátló hatást kifejtő mikroorganizmusok egy része a limfocitákat fertőzi.
A HIV (Human Immunodeficiency Virus) ijesztő példája annak, hogy milyen következményekkel jár, ha az immunsejteket egy mikroorganizmus megfertőzi és elpusztítja. A HIV receptora a T-sejtek felszínén lévő CD4 molekula. A CD4 molekula a makrofág típusú sejtek felszínén is expresszálódik, így a vírus ezeket a sejteket is képes megfertőzni. A klinikai lappangás ideje hosszú, általában több év. Ezalatt mind a CD4+ sejtek, mind a vírusrészecskék gyorsan pusztulnak és újratermelődnek. Amikor a CD4+ sejtek nagyobb arányban pusztulnak el, mint ahogy a szervezet képes lenne regenerálni őket, számuk olyan alacsony értéket vesz fel, hogy a sejtközvetített immunitás működésképtelenné válik. A sejtközvetített immunválasz hiányában a gazdaszervezet halálos kimenetelű opportunista fertőzések áldozatául eshet.

32 A Pinkerton-család: fertőzött vér okozta tragédia
Esettanulmány: A Pinkerton-család: fertőzött vér okozta tragédia Benjamin Pinkerton az USA haditengerészetének századosa volt és Japánban teljesített szolgálatot. A szolgálati idő alatt feleségül vett egy japán nőt, aki 1987-ben két egészséges leánygyermeket szült. Négy évvel később született egy fiú is, aki szintén egészségesnek tűnt. A fiú öt hónapos korában megkapta a diftéria toxoiddal, valamint pertusszisz baktériummal és tetanusz toxoiddal (DPT), továbbá orális poliovakcinával végzett rutin immunizálást. Ezeknek az oltásoknak nem volt mellékhatásuk és a gyermek jól fejlődött. Hathónapos korában megbetegedett és fogyni kezdett. Súlyos, tartós hasmenés lépett fel, amely lázzal járt. Szájüregében szájpenész terjedt, és gyors egymásutánban kétszer esett át középfülgyulladáson. A haditengerészet kórházának orvosai többször vizsgálták a fiút és antibiotikum kezelést írtak fel, ami hatástalannak bizonyult. A fizikai vizsgálat eredményei: testhőmérséklet 38oC szájpenész a nyelv oldalsó felszínén és a száj belső oldalának nyálkahártyáján (candidiasis) pelenkakiütés, melyet szintén Candida fertőzés okozott belégzéskor mindkét tüdőfélben finom, szörtyögő zaj hallatszott

33 Laborvizsgálatok: normális fehérvérsejt-szám (6500/ml);
az egyes fehérvérsejtek aránya szintén normális volt (neutrofilek 62%; limfociták 30%; monociták 5%; eozinofilek 2%; bazofilek 1%); normális immunglobulin szintek: szérum IgG: 997 mg/dl (fiziológiás: mg/dl); szérum IgM: 73 mg/dl (fiziológiás: mg/dl); IgA: 187 mg/dl (fiziológiás: mg/dl); a limfociták vizsgálata során normális mennyiségű CD8+ T sejtet találtak, míg a CD4+ T sejtek aránya nagyon alacsony volt, mindössze 85/ml (fiziológiás: /ml); intradermális Candida antigén nem váltott ki késői típusú hiperszenzitivitási reakciót; a szérumban ELISA módszerrel és Western-blot technikával HIV elleni antitesteket mutattak ki

34 vége felé a magzat meghalt, s császármetszéssel kellett eltávolítani.
Míg Pinkerton százados jó egészségnek örvendett, felesége gyengélkedett és állandó hőemelkedésről és a nyaki nyirokcsomók duzzanatáról panaszkodott. Kiderült, hogy a fiúgyermek születése előtt két évvel a nő terhes volt. A terhesség vége felé a magzat meghalt, s császármetszéssel kellett eltávolítani. A nő jól viselte a műtétet, de a vérveszteség miatt vérátömlesztésre volt szükség, mely során 2 egység vért kapott. A gyermek egymás után két súlyos Pneumocystis carinii illetve Pseudomonas aeruginosa fertőzésen esett át. Súlyos köhögés alakult ki nála, amely során véres köpet termelődött (hemoptysis). Egy héttel később meghalt. A szülők AZT- (zidovudin) terápiában részesültek. A nő később szintén légzési elégtelenségben életét vesztette, míg a százados – magas HIV-antitest szintje ellenére – egyelőre tünetmentes maradt. highly active antiretroviral therapy – HAART a vírus életciklusának különböző pontjain különféle folyamatokra ható szerek kombinációja (triple cocktail) (proteáz inhibitorok, itegráz inhibitorok, „entry” inhibitorok, reverz transzkriptáz inhibitorok) lehetnek szinergista hatásúak is – kisebb dózis is elegendő, kevesebb mellékhatás

35 ELISA Western blot VIZSGÁLATI MÓDSZER VIZSGÁLT FEHÉRJÉK MINTA DETEKCIÓ
Anti-HIV IgG ill. IgM antitestek szérum (esetenként vizelet vagy nyál is) másodlagos (conjugate-) anti-IgG antitestekkel Western blot HIV burokfehérjék: gp41, gp120, gp160; Core: p17, p24, p6, ill. p7 A HIV-diagnosztika során elsőként mindig ELISA-módszerrel vizsgálják a mintákat. Pozitív eredmény (reaktív szérum) esetén két további vizsgálat szükséges (2. és 3. vizsg.). Ismételt reaktivitás esetén az egyén mintáját verifikálják: leggyakrabban Western blot - os mérést, vagy újabb ELISA - mérést végeznek. E felismerést követően a fenti módszerekkel ellenőrizték a szülőket is: mind az apa, mind az anya HIV-antitestre pozitívnak bizonyult.