A "programozott sejthalál" (apoptosis)

Az előadások a következő témára: "A "programozott sejthalál" (apoptosis)"— Előadás másolata:

1 A "programozott sejthalál" (apoptosis)
in vivo körülmények közötti kimutatását célzó peptid előállítása és jelzése 99mTc-radionukliddal   Szemenyei Erzsébet1, Tóth Géza1, Környei József 2 1MTA SZBK, Biokémiai Intézet, Szeged, 2Izotóp Intézet Kft. Budapest Őszi Radiokémiai Napok Eger 2004

2 Bevezetés Apoptózis: Programozott sejthalál. A természetes sejthalál egyik formája, a sejtek mindig ugyanazon a helyen és időben genetikailag meghatározott program szerint halnak el. Az elnevezés a régi görög nyelvből származik, ahol falevelek hullását jelentette. Az elhaló sejtek felszínén, a kettős membrán külső odalán megjelennek ezen sejtek felismerését lehetővé tévő molekulák, pl. a foszfatidil-szerin lipid-molekula.

3 Patrick Raynal, Harvey B. Pollard
Bevezetés Annexin V:           • Ca2+ és foszfolipid kötő fehérjék családjának tagja, antikoaguláns tulajdonságokkal           • Nagyrészt a plazmamembrán citoszol felőli részén található          • Az érett annexin V 320 aminosavból áll, kDa tömegű       • A fehérje négy ismétlődő rész, síkban ciklikus elrendeződésével alakul ki, az ismétlődő részek öt alfa-helikális szegmenst tartalmaznak Patrick Raynal, Harvey B. Pollard (1994) Biochimica et Biophysica Acta 1197,

4 Merrifield-féle szilárd fázisú peptidszintézis
Annexin V fragmentum szintézise Merrifield-féle szilárd fázisú peptidszintézis ANX13: 1. Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH /AQVLRGTVTDFPG-OH/ 2. Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-NH2 /AQVLRGTVTDFPG-NH2/ Alkalmazott gyanták, szintézis módszerek: 1. Merrifield-gyanta, Boc-kémia 2. 4-metil-benzhidril-amin gyanta, Boc-kémia A szintézis lépései: 1. Kapcsolás: 2 ekv. Boc-Xaa, 2 ekv. HOBt, 2 ekv. DCC, DCM 2. Védőcsoport eltávolítás: 50 % TFA/DCM, 10 % DIEA/DCM 3. A következő aminosav(ak) kapcsolása 4. Hasítás: HF(l), anizol, dimetil-szulfid, 0 ˚C

5 Analitikai adatok Peptidek Mr MS HPLC [M+H+] k`
AQVLRGTVTDFPG -OH , ,75 4,35 AQVLRGTVTDFPG -NH , ,68 3,17 Tiszítás: (RP-HPLC, gradiens elúció) Vydac 218TP1010 (C18) oszlop, Gradiens:15 %-40 % A /25 perc A: acetonitril, B: víz (0,1% TFA), 4 cm3/perc Analitikai tisztaság vizsgálata: (RP-HPLC) Vydac 218TP54 (C18) oszlop, Gradiens:15 %-40 % A /25 perc A: acetonitril, B: víz (0,1% TFA), 1 cm3/perc Tömegspektrum adatok: Reflex III MALDI-TOF Kitermelés: AQVLRGTVTDFPG -OH: 20,4 % AQVLRGTVTDFPG -NH2: 49,6 %

6 Stabilitás vizsgálat Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH, 12 hónap, -18 °C A vizsgálat kezdete Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-NH2, 12 hónap, -18 °C A vizsgálat kezdete Vydac 218TP54 (250  4.6 mm), 215 nm, gradiens: 15 %-40 % ACN/25 perc, injektálás: 50 μl

7 CCANX13 szintézise, stabilitás vizsgálata
Cys-Cys-Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH /CCAQVLRGTVTDFPG-OH/ Alkalmazott szintézis módszer, gyanta: Merrifield-féle szilárd fázisú peptidszintézis, Boc-kémia, Merrifield-gyanta Analitikai adatok: Peptid Mr MS HPLC   [M+H+] k` CCAQVLRGTVTDFPG -OH , ,92 7,46 Kitermelés = 59,1 % Hővel szembeni stabilitás vizsgálata: 100 °C-on, fiziológiás sóoldatban hőkezelés nélküli 20 perc 1 óra

8 „Nitrido-jelzés” + + + 1. 2. -intermedier előállítása 15 perc SnCl2
TcO4- + szobahőmérséklet keverés 2. 99mTc-ANX13 -komplex előállítása 1 óra + + CCANX13 100 °C (Oldás: hidroxpropil--cikodextrin jelenlétében)

9 Vékonyréteg-kromatográfia
Analitikai vizsgálatok Vékonyréteg-kromatográfia 99mTc-ANX13-PCN-komplex ET-31 aceton 99mTc-ANX13-PCN-komplex Kieselgel 60, F254 EtOH:víz 1:1 Rf érték: 0,03 100% Rf értékek: 0,02 4,22% 0,66 95,78%

10 Analitikai vizsgálatok
3 4 99mTcN-intermedier Kieselgel 60, F254 EtOH:víz 1:1 99mTc-PCN-komplex Kieselgel 60, F254 EtOH:víz 1:1 Rf érték:(3) 0,15 100% 5 99mTc-ANX13-PCN-komplex Kieselgel 60, F254 EtOH:víz 1:1 Rf értékek:(4) 0,15 12,97% 0,71 87,03% Rf értékek:(5) 0,15 8,72% 0,73 91,28%

11 Analitikai vizsgálatok
6 7 99mTcN-intermedier ITLC-SA 0,3 M-os HCl-val telített BuOH 99mTc-PCN-komplex ITLC-SA 0,3 M-os HCl-val telített BuOH Rf értékek:(6) 0,15 27,53% 0,22 48,59% 0,49 4,71% 0,66 19,17% Rf értékek:(7) 0,15 13,99% 0,38 19,91% 0,50 4,84% 0,61 14,22% 0,67 47,05% 8 99mTc-ANX13-PCN-komplex ITLC-SA 0,3 M-os HCl-val telített BuOH Rf értékek:(8) 0,14 11,81% 0,49 41,72% 0,52 31,73% 0,55 14,74%

12 Összefoglalás Sikeresen előállítottuk a Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-OH és Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-NH2 peptideket. A stabiltás vizsgálatból kiderült, hogy az –OH végű forma stabilabb, ezért a további vizsgálatokat ezzel végeztük. Elkészítettük a nitrido-jelzéshez szükséges, két ciszteinnel kiegészített ANX13-at, ennek hővel szembeni stabilitás eredménye azt mutatja, hogy a jelzésnél alkalmazhatjuk az 1 órás reakcióidőt. A jelzési reakció után vékonyréteg-kromatográfiával kimutattuk, hogy nincs szabad 99mTcO4- a rendszerben. (ET-31, aceton) A további vizsgálatok azt mutatták, hogy intermedier sincs jelen. (Kieselgel 60, EtOH: víz 1:1) Ugyanakkor, ebben a rendszerben nem válik el egyértelműen a 99mTc-PCN-komplex és a 99mTc-ANX13-PCN-komplex. Egy újabb futtatórendszeren és lapon elvégzett vizsgálatokból egyértelműen látszik, hogy a jelzés sikeres volt. (ITLC-SA, 0,3 M HCl-val telített BuOH) Célunkat elértük, sikerült előállítanunk a 99mTc-ANX13-komplexet, amely jelentős előrelépés egy tervezett radiogyógyszer kifejlesztésének következő fázisához, a preklinikai vizsgálatok megtervezéséhez.

13 Köszönöm a figyelmüket!
Köszönetnyilvánítás Szeretnék köszönetet mondani munkatársaimnak: Tóthné Papp Évának és Papp Jánosné, Andreának valamint Rupert Anikónak és Paál Margitnak a hatékony segítségért. Köszönjük a Nemzetközi Atomenergia Ügynökség támogatását. Köszönöm a figyelmüket!