Élelmiszermikrobiológia

Az előadások a következő témára: "Élelmiszermikrobiológia"— Előadás másolata:

1 Élelmiszermikrobiológia
Bacillus és Clostridium nemzetség jellemzése

2 Spórás baktérium metszetének elektronmikroszkópos képe
Spórás baktériumok Spórás baktérium metszetének elektronmikroszkópos képe a baktérium sejt, ill. faj túlélését szolgálja kedvezőtlen környezeti körülmények között.

3 ENDOSPÓRÁS BAKTÉRIUMOK
Aerob/fakultatív anaerob endospórás baktérimok Obligát anaerob endospórás baktérimok Bacillus Clostridium

4 Bacillus nemzetség Elõfordulás
Mindenhol (talaj, víz, levegő, kültakaró, emberi vastagbél) Biológiai körforgalom – fehérje és szénhidrátbontás Morfológia 5-7 x1-2 mikron nagyságú pálcika ált. csillósak (kiv. B. anthracis) burkot nem képeznek (kiv. B. anthracis, B. subtilis, B. megaterium) spóraképzés (átmérője kisebb a baktérium átmérőjénél, ovális vagy kerek, centrális vagy paracentrális) Festõdés Gram+ spórafestések

5 Bacillus nemzetség Tenyésztés aerob, esetleg anaerotolerans
könnyen tenyészthetõk 4-49°C, 4,9-9,3pH, aw>0,95 Biokémiai tulajdonságok oxidatív szénhidrátbontás, fehérjebontás kataláz+, oxidáz-, nitrátredukció, lipáz-lecitináz+, zselatinelfolyósítás Antibiotikumok, illetve gátló hatású anyagcsere-termékek Antigénszerkezet sejtfalhaptének burkos Bacillusok - burokantigén (glutaminsavas polipeptid) Ellenállóképesség vegetatív alak – közepes (60°C, 15 perc) spóra - évtizedekig

6 Bacillus nemzetség Patogenitás obligát patogén: B. anthracis
szaprofita: antibiotikum-termelés, ételmérgezés Jelentőség B. anthracis – lépfene B. cereus – ételmérgezés B. subtilis – enyhe enterális tünetek B. larvae – méhek nyúlós költésrothadása B. thüringiensis - ízeltlábúakra pathogén - biológiai védekezés B. sterothermophilus - nagy hőrezisztencia B licheniformis – bacitracin, gyűrűs hexapeptid B. polymixa – polimixin, ciklikus oligopeptidek

7 Bacillus anthracis Előfordulás: Ü talajban, fertőzött anyagban
Morfológia: Ü   4-5 x 1-2 m pálcika, végük élesen levágott - rövid láncokat alkot Ü   burok (virulencia feltétele) % CO2 (szervezetben burkos) Ü   atrich Ü   spóra - levegő, 15 C, nedvesség (szervezetben spórát nem képez) A Bacillus anthracis spórás baktérium. A spórák rendkívül ellenállóak a környezeti hatásoknak. Pl. 10 perces forralás, vagy 2 órás 160 oC száraz hőkezelés szükséges elpusztításukhoz. Bacillus anthracis elsősorban növényevő állatok betegsége és az emberi fertőzések zöme állati eredetű, de emberről emberre is terjedhet. Például a XVI. században Közép-Európában kb ember halt meg anthrax járványban. Az emberi megbetegedések kb. 95%-a un. bőranthrax. Nemcsak a beteg állattal való közvetlen érintkezés során betegedhetünk meg. Az állatok bőréből, szőréből készült termékek (pl. ruhaneműk) is közvetíthetik a megbetegedést. Napjainkban a fejlett világban ez a megbetegedés rendkívül ritka, mivel jó állategészségügyi hálózat működik, az állatokat oltják (1930-as évek vége óta.), ill. az alapanyagok ipari előkészítése jobb. A fertőzött állat tetemét ("szőröstül-bőröstül") megsemmisítik.

8 Bacillus anthracis Közegészségügyi vonatkozások
Bőranthrax: bőr apró sérülésein keresztül jut be a szervezetbe bőrpír, majd hólyag vérzéses bőrelhalás, fekély, később ennek helyén fekete pörk (a magyar népnyelv "pokolvar„) A folyamat szinte fájdalmatlan. Kísérő tünetek: rossz közérzet, mérsékelt láz. Amikor a kórokozó eléri a nyirokcsomókat, hirtelen szóródik az egész szervezetben, a szervekben vérzéses elhalás jön létre és súlyos toxicus shock képében gyorsan halálhoz vezető folyamat alakul ki. Tüdőanthrax: Belégzés útján spórával fertőződhetnek különösen a bőr- és szőrfeldolgozással foglalkozók. A tüdőben a fent részletezetthez hasonló elváltozás. A klinikai lefolyás két fázisú. A kezdeti tünetek légúti vírusfertőzésre hasonlítanak. (Mérsékelt láz, elesettség, száraz köhögés.) 2-3 nap múlva magas láz, vérköpés, nehézlégzés alakul ki. A szervezet oxigén hiány tüneteit mutatja. Bélanthrax: Gyakorlatilag a fenti folyamat játszódik le a belekben, amennyiben a baktériumot lenyeljük. (Pl. fertőzött húst eszünk.) A tünetek is ilyenkor hasi infekciónak megfelelően alakulnak: heves hasi fájdalom, vizes-, véres széklet, hashártyagyulladás (peritonitis) tünetei, láz mellett. A három forma közül a bélanthrax a legritkább. Bőranthrax: bőr apró sérülésein keresztül jut be a szervezetbe A behatolás helyén óra múlva bőrpír, majd hólyag alakul ki Ezt követően vérzéses bőrelhalás, fekély, később ennek helyén fekete pörk képződik. (a magyar népnyelv "pokolvar„) A folyamat szinte fájdalmatlan. Kísérő tünetek: rossz közérzet, mérsékelt láz. Amikor a kórokozó eléri a nyirokcsomókat, hirtelen szóródik az egész szervezetben, a szervekben vérzéses elhalás jön létre és súlyos toxicus shock képében gyorsan halálhoz vezető folyamat alakul ki. Tüdőanthrax: A Bacillus anthracis spórás baktérium. A spórák rendkívül ellenállóak a környezeti hatásoknak. Pl. 10 perces forralás, vagy 2 órás 160 oC száraz hőkezelés szükséges elpusztításukhoz. Száraz környezetben a spórák a levegőben szállhatnak. A tüdőbe jutott spóra, vagy baktérium ott hoz létre a fent részletezetthez hasonló elváltozásokat. A klinikai lefolyás két fázisú. A kezdeti tünetek légúti vírusfertőzésre hasonlítanak. (Mérsékelt láz, elesettség, száraz köhögés.) 2-3 nap múlva magas láz, vérköpés, nehézlégzés alakul ki. A szervezet oxigén hiány tüneteit mutatja. Majd a fentihez hasonló módon szeptikus shock képében halál jelentkezik. Várható letalitás: 50-90%. Bélanthrax: Gyakorlatilag a fenti folyamat játszódik le a belekben, amennyiben a baktériumot lenyeljük. (Pl. fertőzött húst eszünk.) A tünetek is ilyenkor hasi infekciónak megfelelően alakulnak: heves hasi fájdalom, vizes-, véres széklet, hashártyagyulladás (peritonitis) tünetei, láz mellett. A három forma közül a bélanthrax a legritkább. Várható letalitás: 50%.

9 Bacillus anthracis Közegészségügyi vonatkozások

10 Spóra A B. anthracis az élő szervezetben nem képez spórát.
A Bacillus anthracis ovális spórája a sejten belül helyezkedik el (endospora) centrálisan, vagy "subterminalisan" és a sejtetet nem deformálja. alkotó elemei: kromoszóma, fehérje szintetizáló és glikolízishez szükséges enzimek, kalcium-dipikolinát számos védőréteg vesz körül: spóramembrán, kéreg (cortex), köpeny (coat), exosporium. A spóraképzés utolsó lépéseként a spórát körülvevő sejt feloldódik. A baktérium az anthrax esetében általában a fertőzött állat ürülékével a talajba jut, ahol spóraként évtizedekig életképes marad. ("Elátkozott mezők.") Ha megfelelő közegbe kerül, mérete miatt alkalmas belégzésre. Amennyiben a külső feltételek ismét kedvezővé válnak, megindul az egy spórából egyetlen vegetatív sejt kialakulásához vezető germináció folyamata. Majd a kifejlett vegetatív sejtek osztódni, vagyis szaporodni kezdenek. Az kutatás tárgyát képezi, hogy milyen jelek indítják el a germinációs folyamatot és teszik a kórokozót ismét védtelenné. egy jellegzetes életformáról van szó, mely a baktérium sejt, ill. faj túlélését szolgálja kedvezőtlen környezeti körülmények között. Amennyiben a kb. 8 mikrométer hosszú tégla alakú kifejlett baktérium számára kevéssé válik a tápanyag, megindul a spóra képzés. (A B. anthracis az élő szervezetben nem képez spórát.) A Bacillus anthracis ovális spórája a sejten belül helyezkedik el (endospora) centrálisan, vagy "subterminalisan" és a sejtetet nem deformálja. Nem tévesztendő össze a sejtmaggal. Annál több alkotó elemet rejt magában (kromoszóma, fehérje szintetizáló és glikolízishez szükséges enzimek, kalcium-dipikolinát), melyet számos védőréteg vesz körül: spóramembrán, kéreg (cortex), köpeny (coat), exosporium. A spóraképzés utolsó lépéseként a spórát körülvevő sejt feloldódik. A baktérium az anthrax esetében általában a fertőzött állat ürülékével a talajba jut, ahol spóraként évtizedekig életképes marad. ("Elátkozott mezők.") Ha megfelelő közegbe kerül, mérete miatt alkalmas belégzésre. Amennyiben a külső feltételek ismét kedvezővé válnak, megindul az egy spórából egyetlen vegetatív sejt kialakulásához vezető germináció folyamata. Majd a kifejlett vegetatív sejtek osztódni, vagyis szaporodni kezdenek. Az kutatás tárgyát képezi, hogy milyen jelek indítják el a germinációs folyamatot és teszik a kórokozót ismét védtelenné.

11 Bacillus cereus Előfordulás:
talaj, víz, tej, melegvérűek bélcsatornája Morfológia: 3-5 x 1 m pálcika, - láncokat alkot burok nélküli, csillós baktérium, peritrich (kiv. B. cereus subsp. mycoides) hőrezisztens spóra, általában centrális Festődés: Gram+ Bacillus cereus differenciáló spórafestés Tenyésztés: igénytelen, fakultatív anaerob, Topt = 37 oC telepmorfológia: nagy, szabálytalan szélű R-telepek (CO2-jelenlétében is) pigmentet termelhet (Fe-t tartalmazó táptalajon piros v. zöld fluoreszkáló telepek) véres agaron -, ritkábban - hemolízis szelektív tenyésztés - PEMBA-agar

12 Bacillus cereus Biokémia:
glükózbontás savtermelés közben gáztermelés nélkül kataláz+, mannitot nem bontja, lecitináz+, foszfolipáz+, nitrátredukció Voges-Proskauer+ Ételmérgező törzsek: hemolizin, enterotoxin Antigénszerkezet: sejtfal - típusspecifikus poliszacharid - Ascoli-féle termoprecipitációs próbában keresztreakció Ellenállóképesség: vegetatív baktérium ellenállóképessége közepes, a toxin 60 °C-on inaktiválódik spórák rendkívül ellenállóak

13 Bacillus cereus Patogenitás:
fakultatív patogén, ételmérgezést okoz (nagy számban elszaporodva, 106/g) A talajból kerül az élelmiszerbe, érzékszervi elváltozást nem okoz. A betegségnek 2 típusa ismert: Nagy molekula súlyú fehérje okozza az első és jobban ismertet: alhasi fájdalom és hasmenés jellemzi, 4-16 óra inkubációs idővel, a tünetek óráig tartanak. Fertőzés forrása: húsfélék, levesek, szószok, zöldségek. Kis molekulasúlyú fehérje okozza a másodikat, amit hányinger és hányás jellemez, a szennyezett étel elfogyasztása után 1-5 órával. A tünetek 6-24 óráig tartanak. Fertőzés forrása: száraztészták, rizs. Hollandiában a második helyet foglalja el a B. cereus által okozott ételmérgezés. Az éttermi (főleg a kínai ételek) ételmérgezések előfordulása a legnagyobb. Ok: a zsírban sült rizs készítésénél a főtt rizst szobahőmérsékleten tartják az előkészítési szakaszban.

14 Bacillus cereus tenyésztése
Kimutatandó: tej, tejtermékek, tojás, tojáskészítmények, majonéz, mártások, saláták, fagylalt, tejalapú- csecsemő- és kisgyermektáplálékokban, diétás élelmiszerekben Szelektív tenyésztés: PEMBA-agar: mannit-tojássárga-polimixin-brómtimolkék (0,1-0,1 ml felületi szélesztés, vagy „3 lemez módszer”) h, 37°C Lapos, nagy, szabálytalan szélű R telepek Felülete gyöngyház fényű Feltisztult udvar veszi körül Mannit: nem bontja a mannitot Tojásárga: lipáz-lecitináz aktivitás Polimixin: B. polimixa által termelt antibiotikum, kísérőflóra gátlására Indikátor Bromtimolkék: savtermelés estén sárga lesz, nem termel savat, így kék, kékeszöld telepek lesznek fenolvörös: piros telepet képez. Bacillus cereus MYP agaron Staphylo-coccus

15 Bacillus cereus biokémiai megerősítése
Azonosítás: ·        glükózbontás vizsgálata OF-táptalajon: glükózbontás savtermelés közben gáztermelés nélkül (sárga elszíneződés) (48 h, 37°C) – aerob és anaerob módon is bontja Gram festés – kékesfekete, láncokba rendeződött, kissé vaskos, rövid pálcák, melyek gyakran spórákat is tartalmaznak. A spórák a baktériumtestet nem domborítják ki. ·        lecitináz + (opaleszkáló udvar – Nagler-reakció), foszfolipáz + (gyönygyházfény) ·        nitrátredukció: 0,1% kálium-nitrát, (Griess-Ilosvay reagens  piros elszíneződés) ·        Voges-Proskauer +: V-P leves+KOH+kreatinin  rózsaszín elszíneződés Glükóz-fermentációs teszt -glükózos magasagarokat szúrásos technikával kell beoltani a kiválasztott telepek anyagával, és 30 °C-on 24 órán át inkubálni. A tápközeg sárga elszíneződése jelzi a glükóz-fermentációt. Voges-Proskauer-próba –A Voges-Proskauer leveseket a kiválasztott telepek anyagával be kell oltani, majd 30 C-on 24 órán át inkubálni. Ezt követően minden kémcsőből ki kell venni 1 ml tenyészetet, majd hozzáadni a 0,2 ml, a SOP-05-0 szerint elkészített kálium-hidroxid-oldatot és 0,6 ml 1-naftol-oldatot, valamint néhány kristály kreatint. Erős rázást követően az oldatot 1 órán át szobahőmérsékleten állni kell hagyni. Pozitív esetben piros színreakció tapasztalható. Negatív esetben a tápközeges csöveket további 24 órás inkubáció után újra meg kell vizsgálni. A nitrát-redukció vizsgálata - a nitrát-tápközeget tartalmazó csöveket a kiválasztott telepek anyagával be kell oltani, majd 30 °C-on 24 órán át inkubálni. Ezt követően a csövek anyagához 0,2-0,5 ml Griess-Ilosvay reagenst kell adni. A pozitív reakciót piros szín megjelenése mutatja. Amennyiben 15 percen belül nem alakul ki a piros szín, úgy a nitrogénné redukálódás kizárása érdekében kis mennyiségű cinkport kell a csövekhez adni. A piros szín kialakulása ebben az esetben negatív reakciót jelez. A tesztet lamináris box alatt kell végezni! A biokémiai tesztek eredményének megítélése - a B. cereus fermentálja a glükózt, Voges-Proskauer-pozitív, és a nitrátot nitritté redukálja.

16 Clostridium nemzetség
Előfordulás: talaj, víz, állatok és az ember bélcsatornája. Fontos szerep talajba került szerves anyagok lebontásában. Morfológia: 5-10 x 1-2 m pálcika peritrich csillósak, burkot nem képeznek (kiv. Cl. perfringens) aerob körülmények között spórásodnak átmérõje nagyobb a baktériuménál klosztridium-, plektridium-alak (a helyeződés és alak támpont a fajok identifikálásához) Festődés: Gram+ Ziehl-Nelsen féle spórafestés Spóra piros, vegetatív sejt kék. Tenyésztés: Anaerob (peroxidiokat nem tudja lebontani, O2 számukra sejtméreg) igénytelen, véresagaron hemolízis Topt = 37 °C (kiv. Cl. perfringens Topt = °C) szulfit-tartalmú szilárd és folyékony táptalajok Előfordulás: Anaerob rothasztás – biológiai körforgalom A mikroszkópos kenetben egyesével vagy szabálytalan halmazokban láthatók, egyikük-másikuk azonban hosszú fonalakat is képez. Morfológia: kloszter=orsó, ha centrális helyeződésű, plectron=dobverő, ha terminális vagy szubterminális helyeződésű

17 Clostridium nemzetség
Biokémia: anaerob egyes esetekben aerotolerans fermentatív szénhidrátbontás (sav- és gáztermelés) jellegzetes szénhidráterjesztési módja a vajsavas erjesztés kataláz-, VP- szulfitredukció proteolítikus enzimek (Cl. histolyticum, Cl. tetani, Cl. botulinum) exotoxin-termelés - fajmeghatározás lipáz+, lecitináz+ Antigénszerkezet: összetett (nagy hasonlóság az egyes fajok között) Ellenállóképesség: vegetatív baktérium - közepes spórás alak - rendkívül ellenálló Patogenitás: (állatról állatra nem terjed) gázödémás betegségek (gázgangréna) enterotoxémiák neurointoxikációk A fehérje és más nitrogén tartalmú anyagok lebontása gyakran kellemetlen szagú zsírsavak, ill. gázok képződésével jár. A spórák természetes viszonyok között beszáradt váladékokban, szövetnedvekben évekig életképessek maradnak. Többségük természetes lakói az állat vagy ember bélcsatornájának, s betegséget csak akkor idéznek elő, ha a a bélcsatornából vagy a talajból valamilyen okból szövetek közé jutnak és ott elszaporodnak, vagy ha a bélcsatornából toxinjaiknak módjuk van felszívódni. Gázödéma rendszerint sebfertőződéshez társul. A toxicitást kiegészíti a kórokozók extracelluláris enzimjeinek és erős CH-t bontó képességének lokális hatása. A fertőzött szövetek ödémássá válnak, elhalnak, s a CH-tokból és fehérjékből keletkező szerves savak és gázok miatt tapintásra sercegnek (gázödéma) Exotoxin termelése révén emberi kórokozó

18 Clostridiumok okozta kórképek

19 Clostridiumok okozta kórképek
Enterotoxémia=bélből felszívódó toxinok okozzák

20 Szaprofita Clostridium fajok
Cl. putrefaciens rothadásos folyamatokban való részvétel Cl. butyricum a tejben vajsavat, ecetsavat, butil-alkoholt, szén-dioxidot és hidrogént termel. A képződöttt savak hatására a tej megalszik, majd a nagy mennyiségű gáz az alvadékot szétszaggatja. A tejiparban igen káros, mert a sajtok vajsavas puffadását okozza, ilyenkor a sajt íze édeskés, émelyítő, csípős. Spórái túlélik a pasztőrözést Előfordul a földdel szennyezett siló takarmányban, szennyeződéssel kerül az élelmiszerbe Cl. tyrobutyricum ellentétben a Cl. butyricummal a laktózt nem, csak annak sóit tudja hasznosítani. Együtt a vajsavas puffadás okozói. Cl. sporogenes fehérjebontó,a sajtokban gáztermelés mellett rendkívül bűzös foltokat képez. Előfordul a talajban, a bélsárban, szennyeződéssel jut az élemiszerekbe

21 Mezofil szulfitredukáló baktériumok kimutatása
Azokat a Bacillaceae család Clostridium nemzetségébe tartozó, anaerob körülmények között növekvő mikroorganizmusokat értjük, amelyek adott feltételek mellett a szulfidot szulfittá redukálják. Szelektív tenyésztés: Víznél: DRCM (minta hőkezelése, membránszűrés, DRCM, véresagar) Húsoknál: SCA (Sulfite- Cycloserine-Azide) agaron, 37 °C, óra, anaerob viszonyok között. Megerősítés: Gram festés, Reverz CAMP teszt DRCM=D-glükóz-vas-citrát-nátrium-szulfit-húsleves A cikloszerin gátolja az egyéb, szintén jelenlevő baktériumflóra növekedését és azok a telepek, amelyek kifejlődnek, kicsik maradnak. DST agar Indikátortörzs (Streptococcus agalactae) Nyílhegy forma Cl. perfringesnél - -hemolízis

22 Clostridium perfringens jellemzői
Talaj, víz, szennyvíz por, ételek, fűszerek, ember és állat bélcsatornája Egyenes, burkos, nem mozgó (csilló nélküli pálca): 3-9 x 0,9-1,3 m Spóraképző, túlélheti a kedvezőtlen környezeti viszonyokat. (csak enyhén lúgos közegben spórásodik) A szénhidrátokat intenzíven fermentálja szerepet játszik a hús romlásában (glükózt bontja le sav- és gáztermelés közben). A hús szerkezete fellazul, szivacsossá válik, színe pedig lilásszürke lesz. A fehérjét nem támadja meg. A húsba kerülhet vágás előtt kíméletlenül bántak az állattal levágott állat bélrendszeréből későbbi tartóedényekből kezelőktől porból származó szennyeződésből Ételmérgezések áldozatainak közel 50%-a 2 hét után is hordozó marad.

23 Clostridium perfringens jellemzői
anaerob Topt = oC, Törzsek hőtűrő képessége magas (100 °C-on néhány perc), (spórája 5-10 perces forralás után elpusztul) A hőellenállás kémiailag reverzibilisen alakítható. Pl: Ca-acetát oldattal való kezelés hatására akár 5-10-szeresre lehet növelni, savas élelmiszerben tartva csökkenthető. GI=7 perc pH: 5,5-8,0; aw: 0,95 felett szaporodását 5%-os NaCl meggátolja vizes metilénkékkel kontrasztfestett tusfestésnél tokja színtelen szegély lecitináz+, lipáz-, kataláz- Exotoxint termel: főtoxinok (, , , ), melléktoxinok  A-, B-, C-, D- és E-csoportok Enterotoxin természetű fehérjét termel - enterotoxémia - multikauzális betegségek Könnyű szaporítani, de nehéz a spóraképzést indukálni Multikauzális = intenzív tartásban előforduló betegségek

24 Clostridium perfringens exotoxinjai
Cl. perfringens A - emberi gázflegmone (sebfertőzés) - ételmérgezés (rosszul hőkezelt húsfélék) hasi fájdalmak, hasmenés, belekben nagyfokú gázképződés - csirke elhalásos bélgyulladása Cl. perfringens B - bárányvérhas Cl. perfringens C - malacok, csirkék, ember fertőző elhalásos bélgyulladása - juh struck, Cl. perfringens D - juhok (szm, kecske) enterotoxémiája Cl. perfringens E - patogenitása nem bizonyított Piros -ételmérgező

25 Az enterotoxin tulajdonságai
Spóra-specifikus fehérje, termelése a spóraképzéskor történik. Az enterotoxin a spórával egyidejűleg szabadul ki a sporangiumból. A spóraképzés szempontjából kedvező körülmények az enterotoxin termelést is elősegítik. (Nagymennyiségű élő sejtet kell az élelmiszerrel elfogyasztani, legalább 106 /g és sporulálódik) A toxin hőérzékeny, biológiai aktivitását 60 °C-on 25 perc alatt elveszíti. Ellenáll tripszin, kimotripszin hatásának. Biológiai aktivitás – kötődés a bélbolyhokhoz. tapadás  befúródik a membránba  megváltoztatja az epiteliális sejtek áteresztőképességét  hatására a víz, Na+ és a Cl- felvétel visszájára fordul  sejt működésének megszűnése. Az ételmérgezés csak idős személyekre, vagy legyengült személyekre nézve lehet halálos.

26 Közvetítő élelmiszerek és szimptómák
Szennyezett ételek fogyasztása után általában 6-24 órával, leggyakrabban 8–12 órával jelentkeznek a szimptómák: Éles hasüregi fájdalmak, hasmenés (láz, hányás ritka) Idős és legyengült személyeket kivéve rövid lefutású Enyhesége miatt a valóságos elterjedtsége nem ismeretes Ételmérgezési járvány kerül csak napvilágra (előző nap elkészített hústartalmú ételek fogyasztásától – ezek az ételféleségek lassabban hűlnek le  jobban elterjedhetnek az ételmérgező változatok) Összes élelmiszer 6 %-ban találtak. Ezen belül a nyers húsok %-ban találtak endospórát. A kiskereskedelmi forgalomban előforduló főtt és fagyasztott élelmiszerek 50%-ban találtak vegetatív sejteket, 15%-ban endospórát.

27 Megelőzés Húsok hőkezelésénel (pl: sütés) a belső maghőmérsékletnél min 74 °C, vagy magasabb biztosítása. A nyers hússal érintkezésbe került eszközök tökéletes mosása és fertőtlenítése. Egyszer használatos, eldobható műanyag kesztyűk alkalmazása a kicsontozásnál, jégtelenítésnél vagy más hús-kezelésnél. A hús különválasztása a húslétől hűtés előtt. A hús főzés utáni gyors hűtése. Újrafelhasználás előtt, vagy közbenső tárolás után a hús és a húslé ismételt hőkezelése (átsütés, forralás stb.) min. 74 °C-on.

28 Clostridium perfringens szám meghatározás
Szelektív tenyésztés TSC (Tryptose Sulfite Cycloserine) agar + MUF anaerob viszonyok 37 °C 20h 2 mm átmérőjű, kerek, fekete telepek (1-150 db) MUF=4 metil umbelliferil foszfát

29 Clostridium perfringens, Clostridium tetani
Szulfittartalmú táptalaj, szürkésfekete, csipkézett szélű telepek

30 Megerősítő vizsgálatok
10 elkülönülő tipikus telep Zselatinbontás vizsgálata Zselatinos laktóz agar  szénhidrát bontás (37 °C 24h) sav és gáztermelés mellett, ezért sárga színű lesz felületén gázbuborékokkal, zselatin elfolyósítás (4 °C 1h) Nitrátredukciós próba és mozgásképesség vizsgálat Félfolyékony nitrát agar (37 °C 24h) nitrát redukció, nem mozog Tojássárga emulzió  lecitináz aktivitás Mindig lecitináz+, de foszfolipáz aktivitást nem mutat.

31 Clostridium botulinum
Gram +, anaerob, spóraképző pálca (terminális) Exotoxint termel  botulizmus szulfitredukció lipáz+, lecitináz+ (lecitináz-aktivitás a termelt exotoxinhoz kötött) glükózt fermentatív úton bontja (sav- és gáztermelés) -hemolizáló, kataláz-, Peritrich csillóival önállóan mozog A spórák túlélik a 3-4 órás forralást is. Az ember és az állat botulizmusa között nincsen járványtani összefüggés.

32 Clostridium botulinum
A mikroba és spórái széles körben előfordulnak a természetben. Megtalálhatók a megművelt és erdei talajban, a folyók, tavak és part menti vizek üledékében, a halak és emlősök béltraktusában, a rákok és a kagylók kopoltyúiban és zsigereiben. Minden olyan élelmiszer, amelyben a C. botulinum képes növekedni és toxint képezni és a feldolgozás nem gátolja a spórák túlélését, és utólagos hőkezelésre sem kerül sor az élelmiszer elfogyasztása előtt, a botulizmus veszélyét hordozhatja. Erős neurotoxint képez. Az exotoxin az ételekben termelődik, miközben a baktérium elszaporodik. (Cl. perfringensnél nagymennyiségű élő sejtet kell az élelmiszerrel elfogyasztani.) A spórák hővel szemben ellenállóak és képesek túlélni a nem megfelelő módon vagy minimálisan hőkezelt élelmiszerekben. Botulizmus hét típusa ismert (A, B, C, D, E, F és G) az egyes törzsek által képzett toxinok antigén-specifitása alapján. Az A, B, E, F és G típusok okozzák a humán botulizmust „Hurkamérgezést” A C és D típusok a legtöbb esetben állatoknál okoznak botulizmust.

33 Cl. botulinum törzsek tulajdonságai
Törzs (szerológiai típus) A B C D E F G Proteolitikus aktivitás + - +/- Előfordulás T V Minimális szap. hőm. °C 10 3 4 12 Maximális szap. hőm. °C 50 45 Minimális szap. pH 4, 7 4,7 4,8 Minimális aw 0,94 0,97 Spóra hőpusztulás D110-érték, perc 1,3-2,9 Sugárzási D-érték, kGy 1,1-1,5 NaCl tolerancia, % 5 8 6 Élelmiszermérgezési hajlam ++ Megkülönböztünk proteolitikus, illetve fehérjéket nem bontó törzseket=szacharolitikus A proteolitikus lebontja a kazeint és kénhidrogént termel. Utóbbiak a mannózt fermentálják A szaporodáshoz szükséges hőmérséklet felső határa kb. 50 °C 5°C-al a proteolitikus alatt. Alsó határ 10 és 3 °C Minimális szap. és toxintermelési pH 4,5 felett van. Ez különösen fontos, mivel ez határozza meg a 4,5 pH alatti élelmiszerek hőkezelésének méretezését. Csak nagyon magas vízaktivitás érték mellet hajlandó szaporodni. 0,94-0,97 között. A vízmegkötő anyag kémiai természete azonban befolyásolja a minimális szükségleti értéket. NaCl-ből 10% szacharózból 50% szükséges a szaporodás megakadályozásához. A konyhasó esetében ez a koncentráció jelentősen csökken egyéb tartósító ágensek jelenlétében.

34 Cl. botulinum törzsek biokémiai jellemzői
Biokémiai jellemzők Törzs (szerológiai típus) A B C D E F G H2S termelés + - Kazein hidrolízis Lipáztermelés Glukóz fermentáció -- Mannóz fermentáció Propionsav termelés

35 Cl. botulinum szaporodásának és toxintermelésének ökológiája
Nem szaporodik és nem képez toxint olyan közegben, melyekben más baktériumok nagy számban jelen vannak (többiek gyorsabban nőnek)  azokban az élelmiszerekben kell számolni vele, ahol az eredeti mikroflórát hőkezeléssel kipusztítottuk és ezt követően szennyeződtek Cl. botulinummal. Bacillusuk antagonistái a Cl. b.-nak. Tejben kialakulásuk ismeretlen Anaerob környezetben kell számolni vele (módosított gázterű, vagy vákuum csomagolt termékek) Magas savtartalmú élelmiszerekben nem kell szaporodással számolni. (pH<4,5) Alacsony hőmérsékleten nem tud veszélyt jelentő mértékben elszaporodni. A mérgezések ¾ része a nem megfelelő hőmérsékletű tárolás következtében alakul ki. 20 °C-on 1 nap, 4 °C-on 18 napra van szükség a toxicitás kialakulásához. A toxin képződés optimuma 30-31°C, aW<0,93 nem kell szaporodással számolni.

36 Clostridium botulinum
Botulinum toxint számos élelmiszerből kimutatták, mint pl. kukoricakonzerv, bors, zöldbab, levesek, cékla, spárga, gomba, érett olíva, spenót, tonhal, csirke és csirkemáj, és májpástétom, löncshús, sonka, kolbász, töltött tojás, gyümölcs, fűszerek, ezek főleg az A&B típusú toxint tartalmazták, míg a füstölt és sózott halak az E típust. Az érzékszervi elváltozásokat a fűszerek gyakran elfedik. (Európában eset/év között), Bár a botulizmusos megbetegedések viszonylag nem gyakoriak a megnyilvánulás nagy megbetegedési és halálozási arányt mutat. Magyarországon a megbetegedések a magán háztartásokban előállított vagy ott fertőzött étel, az esetek 80%-ban disznósajt és egyéb házihús készítmények fogyasztása után következett be. Angliában mogyorópüré készítménytől betegedtek meg sokan.

37 A botulizmus exotoxinok jellemzői
A termelt hőérzékeny toxin un. neurotoxin, az ideg-izom szinapszisokban az acetil-kolin képződését irreverzibilisen gátolja, ami petyhüdt bénuláshoz és fulladásos halálhoz vezet. A toxin a szervezetből lassan ürül, kumulációra hajlamos. Legmérgezőbb toxin: LD50: 1 ng/testsúly kg az embernél. Az A-típusú törzsek által termelt a leginkább mérgező. A toxinok az emésztőenzimeknek ellenállnak, a nem proteolitikus csoportba tartozó baktériumok toxinját a tripszin aktiválja, így az emésztőcsatornából felszívódva a keringésbe jutnak. A toxinok hőérzékenyek, 80°C-on 10 perc alatt inaktiválhatók. Az A típus Észak-Amerikában , a B típus Európában gyakoribb.

38 A botulizmus szindróma
Tünetei Az étel elfogyasztása után óra múlva jelentkeznek Kezdetben émelygés, hányás, szédülés, fejfájás, fáradtság, gyengeség Idegrendszeri tünetek: tág, merev pupilla, kettős látás, beszéd- és nyelés zavar izom-paralízis végül légzési elégtelenségek és halál Mérgezés lefutása: 1-10 nap, néha hónapokig elhúzódik 35-65% halálozási arány Kezelés antitoxinnal, jó ha minél korábban alkalmazzák Az elnevezés a latin botulus=kolbász szóból származik.

39 „Csecsemő botulizmus”
Nem toxin kerül a szervezetbe, hanem élő Clostridium spóra. Kicsíráznak és toxint termelnek. Erre azért van lehetőség, mert a csecsemőknél még nem alakul ki a normál bélflóra, ami megakadályozná a szaporodásukat. Egy éves életkor előtt Szorulást, gyengeséget, légzési elégtelenségeket, néha halált okoz. Elégtelenül hőkezelt ételekkel bevitt spórák. Gyakori közvetítő a méz, amely 1-10%-ban tartalmaz spórákat, főleg A és B típusúakat.

40 Clostridium botulinum kimutatása
A Clostridium butulinum által előidézett ételmérgezés elsősorban a toxin kimutatásával történhet, mivel a baktériumot elég nehéz kitenyészteni. Húsmintából alaphígítást készítünk, Elődúsítás céljából Holman-levesekbe oltjuk, A minták felét a spórák aktivizálására és a vegetatív sejtek elpusztítása végett 80 °C-on 20 percig hőkezeljük. Inkubálás 35°C-on 2-5 napig, Zavarosodást mutató pozitív tenyészetekből átoltást végzünk félfolyékony szulfitredukciós agarba, majd 48 órán át inkubáljuk, Szürkülést, feketedést mutató telepeknél azonosító próbákat kell végezni. A toxin kimutatására kísérleti állatoltást végeznek (fehér egér) A laboratóriumban a botulinum toxin kimutatásával foglalkozó személyeket toxoid védőoltásban kell részesíteni.

41 Óvintézkedések Clostridium botulinum ellen
A C. botulinum szaporodását nyers vagy pasztőrözött állati eredetű élelmiszerekben gátolni lehet a következő tényezők kombinációjával: a tárolási hőmérséklet (minimális szaporodási hőmérséklet: A és B típusnál: 10 ºC, E típusnál: 3.3 ºC, F típusnál: 4 ºC), a pH-érték (a szaporodáshoz szükséges minimális pH-érték: 4.7) Az alacsony pH csökkenti a spórák hőellenállását, savanyított élelmiszereknél nem kell vele számolni. Legyen 4,5 alatt. a szaporodáshoz szükséges minimális vízaktivitás érték C. botulinum A és B típusnál >0.93, E típusnál > Célszerű 0,91 alatt tartani Hústermékekben a pácolás során adagolt nátrium-nitrit hatására a botulinum toxin képződésének valószínűsége csökken. (156 mg/kg nitrit a konzervekbe) A spórák elpusztításához 2,52 percnyi 121,1 ºC-os hőkezelés szükséges. Az élelmiszereket olyan körülmények között kezelik hővel, vagy vetik alá besugárzásnak, amelyek a spórák 12 nagyságrendű csökkenését eredményezik Az élelmiszeripari üzemekben a GMP, GHP és HACCP rendszerek átfogó alkalmazásának megfelelő védelmet kell nyújtania a fogyasztók részére.

42 Clostridium tetani spóra terminálisan (plektridium alak)
Erősen hőálló: 100 °C-on 15, 115 °C-on 5 perc szigorúan anaerob szénhidrátokat nem fermentálja Tetanospasmint (neurotoxin), tetanolizint (hemolitikus) és fibrinolizint (proteolitikus) termel tetanusztoxin formalinnal aktív immunizálásra alkalmas anatoxinná alakítható Patogenitás: tetanusz (merevgörcs, farkasgörcs) - emlősöknél talajfertőzés sebfertőzés, Ru - recésátfúródás invázív képessége igen kicsi  toxémia (gátolja a kolin-észteráz enzimet) Tetanospasmin – az ideg-izom szinapszisokban az acetil-kolin lebomlását gátolja azáltal, hogy blokkolja a mediátort bontó kolin-észteráz enzimet, ami merevgörcshöz vezet.