Kiroptikai spektroszkópia

Az előadások a következő témára: "Kiroptikai spektroszkópia"— Előadás másolata:

1 Kiroptikai spektroszkópia
Összeállította: Pál Krisztina

2 Bevezető A kiroptikai spektroszkópiák jelentősége abban áll, hogy segítségükkel különbséget tehetünk enantiomerek között, vagy diasztereomerek közt. Polarimetria (optikai forgatás adott hullámhosszon), ORD /optikai rotációs diszperzió/ (optikai forgatás a hullámhossz függvényében) CD /cikuláris dikroizmus/ (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény abszorpciója közti különbséget méri a hullámhossz függvényében) Mindegyik technika az (optikailag aktív) anyag és a polarizált fény közti kölcsönhatás mérésén alapszik.

3 Optikailag aktív, királis anyag
Az olyan anyagokat, amelyek a poláros fény rezgési síkját elforgatják, optikailag aktív anyagoknak nevezzük. (A jelenséget kezdetben csak a kristályos anyagok szerkezetének aszimmetriájával hozták összefüggésbe). Arago, kvarckristály (1811) Biot, borkősav vizes oldat (1838) Pasteur, aszimmetria – optikai aktivitás ( ) Kekulé ( ), Le Bel és van't Hoff (1874); aszimmetrikus, tetraéderes C-atom Királis: tükörképével nem fedésbe hozható. Az egymással fedésbe nem hozható tükörképi szerkezetek olyan viszonyban vannak egymással, mint a jobb és bal kéz (a kéz görög nevéből - kheir - származik az ilyen szerkezetek királis elnevezése). Optikai aktivitás = forgatóképesség; királis molekulák nem racém halmaza optikailag aktív

4 Enantiomerek (1) Királis molekulák egymáshoz való viszonya
Egy enantiomer az egyike annak a két sztereoizomernek, amelyek egymásnak fedésbe nem hozható tükörképei (mint a jobb és bal kezünk; „ugyanazok”, de mégis ellentétei egymásnak). Szimmetrikus környezetben: azonos fizikai és kémiai tulajdonságok Aszimmetrikus környezetben: különböző tulajdonságok.

5 Enantiomerek (2) Azonos olvadás- és forráspont, törésmutató, oldhatóság, UV-látható, IR- és NMR spektrum. A különböző viselkedés királis ágenssel való kölcsönhatás esetén érvényesül: Királis oldószerekben oldhatóságuk különbözik Királis vegyületekkel különféleképp reagálnak (pl. diasztereomer képzés, rezolválás alapja) „Királis” fénnyel különféleképp hatnak kölcsön (Diasztereomerek: részleges tükörképei egymásnak; 1 vagy több aszimmetriacentrum abszolút konfigurációja eltér. Epimerek: csak egy aszimmetriacentrum abszolút konfigurációja más)

6 Kiralitás fajtái Centrális kiralitás Vonal kiralitás Anza kiralitás
Centrális kiralitás Vonal kiralitás Anza kiralitás Helikális kiralitás

7 A fény polarizációja Nem polarizált fény Síkban polarizált fény Az elektromágneses sugárzás (fény) egy haladó hullám, amely oszcilláló elektromos- és mágneses térből áll, melyek kölcsönösen merőlegesek egymásra. Általában az elektromos tér oszcillációja NEM egy fix (y,x) síkon történik. Ilyenkor a sugárzás NEM polarizált. y z x

8 Síkban polarizált fény előállítása
A polarizációs szűrő a polarizálatlan fényt síkban (lineárisan) polarizált fénnyé alakítja. Erre jó példa a Polaroid szűrő, mely hosszúkás molekulák párhuzamosan rendezett szálaiból áll. Csak a megfelelő irányban polarizált fénykomponens jut át a szűrőn (az erre merőleges komponens tökéletesen abszorbeálódik).   A vertikálisan polarizált komponens átjut. Polarizálatlan fény A horizontálisan polarizált komponens abszorbeálódik (nem jut át a szűrőn).

9 A lineárisan polarizált fény két cirkuláris komponense

10 Optikai forgatás A királis minta törésmutatója más a síkban polarizált fény két cirkulárisan polarizált komponensére (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény) nézve. nbal≠njobb Ebből következően a két cirkuláris komponens sebessége más és más, amint királis mintán haladnak át. n=c/v Eredmény: a síkban polarizált fény polarizációs síkja elfordul ( szöggel).

11 Optikai forgatás (2)

12 Polarimetria: Az optikai forgatás adott hullámhosszon
/589nm (Na D-vonal)/

13 Optikai forgatás Általában specifikus forgatásként van megadva [], melyet adott hőmérsékleten (T) és hullámhosszon (, ált. 589 nm) mérnek (a minta adott koncentrációjú, adott oldószerrel készült oldatát alkalmazva). Megadása: []D25 = +65° (c=1.0, EtOH) +, óramutató járásával megegyező irány – , óramutató járásával ellentétes Tisztaság meghatározás: Mért specifikus forgatás* specifikus forgatás (Pl.: (+6,76°/+13,52°)*100=50%)

14 Optikai rotációs diszperzió (ORD)
Az optikai forgatást mérjük a hullámhossz függvényében. (diszperzió = a hullámhossz függvényében) Detektor: fotoelektron sokszorozó Polikromatikus fényforrás

15 ORD spektrum A csúcs és a vályú közti metszéspont hullámhossza jól egyezik az abszorpciós max –al.. Egyenletes lefutású görbe (ún. plain curve) - ha a királis molekulában nincsen kromofór (nincs elnyelés). Kromofórt tartalmazó királis minta esetén ún. Cotton effektus (anomália) rakódik a plain curve-re, ott ahol a minta elnyel.

16 Cirkuláris dikroizmus

17 Cirkuláris dikroizmus (2)
A síkban polarizált fény két cirkuláris komponense (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény) különböző mértékben nyelődik el (abszorbeálódik) királis mintán áthaladva. Összegük: Lineárisan polarizált fény Elliptikusan polarizált fény

18 CD spektrum Abal A CD spektrumban A-t, -t (egyezményesen bal-jobb) tüntetik fel a hullámhossz függvényében. (néha az ellipticitást (), a moláris ellipticitást []) AbalAjobb A /c·l (A=Abal-Ajobb) = bal-jobb Ajobb A l= nm, e- gerjesztés

19 Enantiomerek CD spektruma
jobb,(R)= bal,(S),  bal,(R)= jobb,(S)  bal, (R)- jobb,(R) = (R) =  jobb, (S)- bal,(S) =  (S) bal, (S)- jobb,(S)=  (S)=  jobb, (R)- bal,(R)=  (R) TÜKÖRKÉPI VISZONY

20 CD mérés (spektropolariméter)
LS (light source) M (mirror), S (slit), P (prism), SH (shutter) Minta (királis) Detektor: Fotoelektron sokszorozó CDM (CD modulátor, fotoelasztikus modulátor): Felváltva állít elő jobbra és balra cirkulárisan polarizált fényt L (lens), F (filter)

21 UV, ORD, CD összefüggése Ahol az optikailag aktív anyag elnyel: CD jel jelentkezik, míg az ORD spektrumban Cotton effektus. Ahol az anyag nem nyel el: nincs CD jel, ORD-ben plain curve.

22 A CD spektroszkópia alkalmazásai
Enantiomertisztaság meghatározás Abszolút konfiguráció meghatározás Indukált CD: akirális molekuláknak – királis molekulákhoz kötődve – CD jele indukálódik (komplexképződés tanulmányozása). Fehérjék tanulmányozása: másodlagos szerkezet, konformációs változások

23 Enantiomertisztaság (ee%) meghatározás
Ee(%): enantiomeric excess, (enantiomer túlsúly v. enantiomer tisztaság). A racém részen felüli túlsúly.

24 Enantiomertisztaság meghatározás CD (koncentráció független)
Anizotrópia-faktor (g-faktor): A CD spektrum intenzitása/az abszorpciós spektrum intenzitása. Enantiomerekre egyenlő nagyságú, ellentétes előjelű.

25 Az enantimerek megkülönböztetése, enantiomertisztaság [Miért fontos?]
Ma a gyógyszerek 40%-a királis hatóanyagú, sokat ebből racémként hoznak forgalomba. Az enantiomerek farmakokinetikája eltérő, rendszerint különböző receptorokon hatnak. Csak az egyik fejti ki a kívánt klinikai hatást, a másik vagy egyáltalán nem hat, vagy a nemkívánt hatásokért felelős

26 Racémként hozták forgalomba
Contergan-botrány (hatóanyag:thalidomide) Racémként hozták forgalomba A tájékoztató szerint jól használható köhögés, pánikbetegség, migrén ellen, pszichés traumák esetén nyugtatószerként. Nem terheli a máj anyagcseréjét, és a hányingert is csillapítja. Célcsoport: állapotos nők. Feltűnően sok gyermek született elhalt végtagokkal, szellemileg, testileg visszamaradottan.

27 (R)-izomer (S)-izomer
teratogén hatású hatékony szedatívum

28 Gyógyszerek enantiomerjeinek hatása
Salbutamol – asztmások gyógyszere: (R): bronchodilatáció, (S): szívdobogásérzés, vérnyomásemelkedés, tremor. Ibuprofen: (R): hatástalan, (S): lázcsillapító. Penicillamin: (R): toxikus, (S): krónikus artritis (izületi gyulladás) ellen – fájdalomcsillapító, tünetenyhítő.

29 Az abszolút konfiguráció meghatározás módszerei
(1): CD spektrumok összehasonlítása: Kérdéses vegyülethasonló, ismert térszerkezetű vegyület. (2): Tapasztalati szabály: Molekulaszerkezet és a CD sáv előjele közt teremt kapcsolatot. (pl. oktáns szabály) (3): A CD spektrum kvantumkémiai számítása és ennek összevetése a mért spektrummal.

30 Példa (1) (-)-2a, (2R, 3S) abszolút konfiguráció
Azonos sávelőjelek, azonos abszolút konfiguráció (-)-2a, (2R, 3S) abszolút konfiguráció Ismeretlen abszolút konfiguráció

31 Oktáns szabály (ketonokra) (2)
Amely térrészbe esik az atomok többsége, olyan előjelű lesz a CD sáv. Adott molekula-geometriához meghatározható a karbonil-csoport 300 nm körül észlelhető n→π* elektronátmenetéhez tartozó CD jel előjele. A molekula 3D modelljét úgy kell elhelyezni a koordináta rendszerben, hogy a karbonil csoport felezőpontja a 3 tengely metszéspontjával egybeessen.

32 Oktáns-szabály alkalmazása (2)
(+) Az atomok túlnyomó része (-) térrészbe esik, így ehhez a térszerkezethez negatív karbonil sáv tartozik. (Tengelyre eső atomok hozzájárulása 0). (-) (+) (-) Oktáns projekciós diagram

33 Oktáns-szabály alkalmazása (2)
(+) (-) 11b 2 stabil konformációban létezik, az egyikre negatív a másikra gyenge pozitív karbonil jelet jósol. Összegük: gyenge negatív jel (+)

34 Oktáns-szabály alkalmazása (2)
Pozitív Cotton effektus = Pozitív CD jel Negatív Cotton effektus = Negatív CD jel ORD spektrum (specifikus forgatás a hullámhossz függvényében)

35 Indukált CD Királis gazdamolekula vagy kötőhely (ciklodextrin, fehérje/enzim kötőhely, DNS) Akirális, kromofór vendégmolekula (színezékmolekula, hatóanyagmolekula). A bekötődő akirális kromofórt a királis környezet vagy szerkezetileg torzítja (királissá teszi) vagy az e-átmeneteit perturbálja  az akirális molekulának a királishoz kötődve CD-jele indukálódik.

36 Indukált CD cisz-parinársav (kromofór, akirális vendégmolekula) -laktoglobulin (királis host, látható tartományban nincs elnyelése) A cisz-parinársav (akirális, kromofór), a β-laktoglobulinhoz (királis) kötődik. A látható tartományban (cisz-parinársav elnyelési tartományában) CD jel indukálódik

37 Indukált CD 2 db akirális festékmolekula kötődik a fehérjéhez (anomális CD jel: ún. exciton-azt jelzi, hogy 2 festékmolekula kötödik egy fehérjekötőhelyen). Egyre több festékmolekulát hozzáadagolva, egyre nagyobb az indukált CD jel (egyre több festékmolekula kötődik a fehérjén). A CD jel az akirális festékmolekula elnyelési tartományában jelentkezik.

38 Fehérjék CD spektroszkópiai vizsgálata
Környezeti változások (pH, hőmérséklet stb.) → konformációs változás CD spektrum alakja érzékenyen tükrözi a fehérje konformáció változásait. A CD spektroszkópia jól használható (denaturációs vizsgálatok, fehérjekötődési vizsgálatok).

39 Másodlagos szerkezet Fehérjék esetében a távoli UV tartományban (180nm - 260nm) - az amid kromofóroktól kapunk jelet. nm közt a CD spektrum az amid csoportok egymáshoz képesti orientációjára jellemző → Ha más a másodlagos szerkezet, más a CD spektrum.

40 Tiszta másodlagos szerkezetek CD spektruma
-hélix -turn rendezetlen szerkezet -redő Ebben a tartományban ( nm) adott fehérje CD spektruma a „tiszta” másodlagos szerkezetek CD spektrumának lineárkombinációjaként írható.

41 Lineárkombináció Ismeretlen fehérje CD spektruma = referencia CD spektrumok lineáris kombinációja -hélix rendezetlen szerkezet -redő

42 Illesztés Referencia spektrumként: tiszta másodlagos szerkezetek CD spektruma (szintetikus polipeptidek). Vagy valós fehérjék. (Programok legalább 2, de max. 8 féle komponenst használnak).

43 Eredmény A mért CD spektrum alapján megkapjuk a vizsgált proteint alkotó másodlagos szerkezetek százalékos arányát. Másodlagos szerkezetek

44 rendezetlen szerkezet
-redő Mivel a három alap konformáció (-hélix, -redő, rendezetlen szerkezet) CD spektruma igen különbözik egymástól, kis, lokális konformációs változások is szembetűnő változásokat okoznak a CD spektrumban. -hélix -hélix -redő rendezetlen szerkezet

45 A ribonukleáz hődenaturációja
-hélix rendezetlen szerkezet Jobbra: 0.02% Ribonukleáz A, (0.001M HCl) CD spektruma 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 70, 80 °C-on. Balra: A CD-jel a hőmérséklet függvényében (222nm-en).

46 Köszönöm a figyelmet!