Kapilláris elektroforézis Mikro-elektromigrációs technikák a laboratóriumi diagnosztikában Fehérje-diagnosztika - tanfolyam Pécs, 2006.09.27.

Az előadások a következő témára: "Kapilláris elektroforézis Mikro-elektromigrációs technikák a laboratóriumi diagnosztikában Fehérje-diagnosztika - tanfolyam Pécs, 2006.09.27."— Előadás másolata:

1 Kapilláris elektroforézis Mikro-elektromigrációs technikák a laboratóriumi diagnosztikában
Fehérje-diagnosztika - tanfolyam Pécs,

2 Elválasztástechnika Kromatográfia (1903) Михил Цвет
(Ultra)centrifugálás (1908 / 1926) Theodor Svedberg Elektroforézis (1930 / 1948) Arne Tiselius Tömegspektrometria (1897) Pécs,

3 Tiselius elektroforézis készüléke
Pécs,

4 Gélelektroforézis (urea jelenlétében)
Vasmentes és vassal telített transferrin minták. 6%T, 3%C; 100 V, 8°C. Futtatási idő 17 óra. Pécs,

5 Zónaelektroforézis kapillárisban urea jelenlétében
--- --- --- --- Pécs,

6 A kapilláris elektroforézis kezdete
Stellan Hjertén (1958) - „free zone electrophoresis” 1-3 mm kvarccső Franz Everaerts (1970-es évek eleje) – ITP (Kendall, 1923!) Rauno Virtanen (1974) - potenciometrikus detektálás, ZE F.E.P. Mikkers (1979) - zónaelektroforézis tefloncsőben J. Jorgenson (1981) - zónaelektroforézis, EOF ! Pécs,

7 Elektroforetikus rendszer
Hjertén, 1958 Pécs,

8 „Free zone electrophoresis” (Stellan Hjertén, 1967)
Pécs,

9 Az első „kapilláris elektroforézis” készülék
Pécs, Stellan Hjertén, 1967

10 A vándorlás sebessége elektromos térben
v sebesség m mozgékonyság, mobilitás (mobility) E elektromos térerő U alkalmazott feszültség l az elválasztó rendszer (ellenállással rendelkező) hossza Pécs,

11 Elektromos mozgékonyság (mobility)
Elektroforetikus vándorlás ideális (híg) oldatokban A vándorlás a töltés/tömeg hányadostól és a viszkozitástól függ Pécs,

12 Az elektroforézis közege
oldat  papír  gél  oldat Pécs,

13 A poliakrilamid mátrix előnyei
majdnem teljesen ideális, áramlásmentes közeg felbontó képessége nagy a diffúzió csökkentett viszonylag éles zónákban történik a komponensek vándorlása Pécs,

14 A szabad oldatban történő elektroforézis előnyöket eredményez, de „következményekkel jár”
elektroendozmózis Pécs,

15 Az elektromos kettősréteg az üveg felületén
Pécs,

16 Kettős réteg elektródok felületén kolloid részecskék felületén
Pécs,

17 Az endozmótikus áramlás mozgékonysága
a vákuum dielektromos állandója az oldószer dielektromos állandója viszkozitás „zéta potenciál” Pécs,

18 Elektroendozmótikus áramlás (endosmotic flow)
Pécs,

19 Az áramlási profil hatása a zóna-szélességre
A kialakuló folyadékáram dugószerű profilt mutat. Pécs,

20 Az endozmózis függése a pH-tól
Pécs,

21 Kationok és anionok vándorlása elektroozmózis jelenlétében
[cm2 V-1 s-1] (1 Tiselius egység = cm2V-1s-1) Pécs,

22 Zóna-elektroforézis elektroozmózis jelenlétében
+ EOF Pécs,

23 Pozitív, semleges és negatív komponensek elektroforézise
Benziltrimetilammónium kloridot (1), benzil-alkoholt (2), acetilszalicilátot (3), 4-hidroxibenzoátot (4) és benzoátot (5) tartalmazó mintaoldat elektroferogramja (Körülmények: kapilláris: 57 cm x 75 μm, térerősség: 263 V/cm, T=25C, =200 nm, puffer: 50 mM foszfát, pH=7,0.) Pécs,

24 Fedett kapillárisban a gélelektroforézishez hasonló körülmények
„Coated capillary” Metilcellulóz Nem keresztkötött poliakrilamid Szénhidrátok AZ EREDMÉNY  nincs elektroendozmózis ! Pécs,

25 A kapilláris elektroforézis gyakorlata
Automatizálható A kapillárist „kondícionálni” kell/lehet Kapilláris bevonat alkalmazható („coating”) Mintabevitel többféle módon lehetséges A tápegység detektorhoz közel eső pólusa földelt Változatos futtatási körülmények (környezeti paraméterek) puffer-adalékok Többfajta elválasztási elven működő rendszer Változatos detektálási módszerek (egy ponton, teljes hosszban) Kiértékelés, kalibráció Pécs,

26 A kapilláris elektroforézis készülék
2-100 mm „fused silica” kapilláris Állandó hőmérséklet ( °C) UV detektor Nagyfeszültségű tápegység 0-30 kV Minta és elektrolit-tartályok Pécs,

27 Kapilláris elektroforézis (1995)
Pécs,

28 Chip-kapilláris elektroforézis készülék (2005)
Pécs,

29 Kvarc-kapilláris és mikrochip
Pécs,

30 A detektálási módszerek érzékenysége
Direkt módszerek UV-látható fényelnyelés mol Fluoreszcencia mol Lézer-indukált fluoreszcencia (LIF) mol Amperometria mol Vezetőképesség mol Tömegspektrometria mol Pécs,

31 Az elektroforézis módszerei
Osztályozás az elválasztás elve alapján Pécs,

32 Az elektroforetikus elválasztás fajtái (1)
Zóna elektroforézis (ZE - CZE) Izoelektromos fókuszálás (IEF - CIEF) Izotachoforézis (ITP - CITP) Gélelektroforézis (PAGE - CGE) A vándorló komponensek töltés/tömeg (z/m) aránya alapján Az amfoter tulajdonságú komponensek izoelektromos pontja (pI) alapján előre megformált pH gradiensben A vándorló komponensek mobilitása (m) alapján SDS jelenlétében a molekulatömeg (m) alapján Pécs,

33 Az elektroforetikus elválasztás fajtái (2)
Micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC) Kapilláris elektrokromatográfia (CEC) A vándorló komponensek micelláris megoszlása alapján Az elektroendozmózis jelenlétében vándorló komponensek és a kromatográfiás álló fázis kölcsönhatása alapján Pécs,

34 Megfelel a nem-denaturáló gél-elektroforézisnek
Zóna elektroforézis (ZE - CZE) A vándorló komponensek töltés/tömeg (z/m) aránya alapján történő elválasztás Megfelel a nem-denaturáló gél-elektroforézisnek Pécs,

35 Zóna-elektroforézis elektroozmózis jelenlétében
+ EOF Pécs,

36 Szérum-elektroforézis
Normál szérum kapilláris zóna-elektroforézise és agaróz-elektroforézise Teljes fehérje-tartalom 70.6 g/l, albumin-tartalom 42.7 g/l. Kisérleti körülmények: 40 cm×50 μm kapilláris, 20 kV; 200 nm, 20 °C. A minta higítási aránya 1:50. Pécs,

37 Liquor-elektroforézis
Normál liquor kapilláris zóna-elektroforézise és agaróz-elektroforézise Teljes fehérje-tartalom 0.42 g/l, albumin-tartalom 0.23 g/l. Kisérleti körülmények: 40 cm×50 μm kapilláris, 25 kV; 200 nm, 20 °C. A minta nem volt higítva. Pécs,

38 Izoelektromos fókuszálás (IEF - CIEF)
Az amfoter tulajdonságú komponensek izoelektromos pontja (pI) alapján, előre megformált pH gradiensben történő elválasztás Pécs,

39 pH gradiens formálása amfolitokkal
amfoter tulajdonság szintetikus vegyületek keveréke (> 4000 féle molekula különböző izoelektromos ponttal) jó pufferkapacitás >0 vezetőképesség az izoelektromos pontnál Pécs,

40 Izoelektromos fókuszálás (isoelectric focusing)
Pécs,

41 Transzferrin-formák detektálása
280 nm-en a fehérjemennyiség detektálható, 460 nm-en a vassal telített fehérjemennyiség detektálható Az egyes transzferrin izoformák izoelektromos pontja közötti különbség kisebb, mint 0.3 pH egység Pécs,

42 Hemoglobin formák analízise izoelektromos fókuszálással
Hb variánsok normál Hb minta Hb minta diabéteszes betegtől Pécs,

43 Izotachoforézis (ITP - CITP)
A vándorló komponensek mobilitása (m) alapján történő elválasztás Pécs,

44 Izotachoforézis (isotachophoresis)
A vándorló komponensek a mobilitásuknak (m) megfelelő sorrendben vándorolnak az elválasztás után (azonos sebességgel) mzáró-ion < mC-komponens < mB-komponens < mA-komponens < mvezető-ion Pécs,

45 Uraemiás beteg széruma
izotachoforetikus koncentrálás nélkül nem vizsgálhatók a kóros mennyiségben felgyülemlő savak Pécs,

46 Micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC)
A vándorló komponensek micelláris megoszlása alapján, azaz a molekulák hidrofóbicitása alapján történő elválasztás Pécs,

47 Micellaképződés A felületaktív anyagok egy bizonyos koncentráció-érték felett micellákat képeznek. CMC - kritikus micella koncentráció (cSDS = 8 mM) „SDS” - > a dodecil-szulfát anionok micellákat képeznek, amelyekben a poláris oldószer felé helyezkednek el a szulfát-anion csoportok, és a micella magját az apoláris, hidrofób láncok alkotják Pécs,

48 Micellar elektrokinetic chromatography (Shigeru Terabe, 1985)
Micellákat tartalmazó elektrolitban a micellába belépő hidrofób komponensek, hidrofóbicitásuknak megfelelően rövidebb-hosszabb ideig a micellával együtt vándorolnak az elektromos térben. Pécs,

49 Töltéssel nem rendelkező anyagok elektroforetikus/elektrokinetikus analízise
A dodecil-szulfát micellák segítségével 14 mono- és diszaccharid elválasztása lehetséges nagy felbontással, mennyiségi analízis céljára is. A cukrok jelölve voltak a detektálhatóság érdekében Pécs,

50 Gélelektroforézis (PAGE - CGE)
Miután a kapillárisban nem szükséges hordozó mátrix, ezért a gélelektroforézist csak az ún. denaturáló formában alkalmazzuk molekulasúly meghatározásra, vagy DNS analízisre. Fehérjéket SDS jelenlétében a molekulatömeg (m) alapján lehet elválasztani a gél-pórusokon való átvándorlás akadályozottsága miatt Nukleinsavakat / oligonukleotidokat is molekulaméret szerint választhatunk el Pécs,

51 Gélelektroforézis Alkalmazott mátrixok és polimer hálózatok agaróz
keresztkötött poliakrilamid gél nem keresztkötött poliakrilamid kolloid oldata hidroxietil-cellulóz (HEC) hidroxipropil metil-cellulóz (HPMC) metil-cellulóz (MC) polivinil-alkohol (PVA) dextrán polietilén-glikol (PEG és polietilén-oxid (PEO) polivinilpirrolidon (PVP) Pécs,

52 Agaróz gél Pécs,

53 Poliakrilamid gél Pécs,

54 Lineáris polimerek használata elválasztásra
Pécs,

55 Polimer hálózatokon keresztül történő vándorlás ugyanúgy „akadályozott”, mint egy keresztkötött gél esetében, tehát a molekula méretétől függ Polimer oldatok alkalmazása automatizálhatóvá teszi a gél-elektroforézis Pécs,

56 A dodecil-szulfát láncok hatása fehérjemolekulákra és kölcsönhatása a molekulákkal
A fehérjemolekulák az SDS oldatban denaturálódnak és egyúttal a dodecilszulfát láncok a polipeptidlánchoz egyenletes „eloszlásban” hozzátapadnak. Ennek következtében a különböző polipeptidláncok mobilitása azonos lesz, mert egy kétszer olyan hosszú polipeptidlánchoz kétszer annyi dodecilszulfát lánc kötődik, így a z/m azonos lesz! Megjegyzések A teljes denaturációhoz a diszulfidhidak felbontása is szükséges! Ezt redukálószerekkel lehet elérni.) A polipeptidlánc „saját” töltését a nagy negatív töltés „eltakarja”! Pécs,

57 Fehérje-molekulasúly standardok polimer oldaton történő elektroforézise
Fluoreszcens detektálás a dodecilszulfát láncokhoz kötődő fluoreszcens festékkel Bioanalyzer (Agilent) Pécs,

58 Polinukleotid elektroforézis
A nukleinsavak töltés/tömeg-aránya gyakorlatilag azonos! Mobilitásuk „szabad”-oldatban azonos! Pécs,

59 DNS láncok vándorlása gélszűrő hatás esetén
Pécs,

60 Oligonukleotidok gél-elektroforézise
Pécs,

61 DNS szekvenálás elektroforézissel
Maxam-Gilbert módszer Sanger módszer GTCGATCG….. CTGGACTGT... Pécs,

62 DNS szekvenálás kapilláris elektroforézissel (genomics)
a szekvencia közvetlenül leolvasható az elektroferogram-sorozatról a négyféle „színű” jelöléssel, az egymásra vetített elektroferogramok közvetlen információt adnak Pécs,

63 Kapilláris elektrokromatográfia (CEC)
Az elektroendozmózis jelenlétében vándorló komponensek és a kromatográfiás álló fázis kölcsönhatása alapján történő elválasztás Pécs,

64 Kapilláris elektrokromatográfia
Pécs,

65 Kapilláris elektrokromatográfia
A vándorlást a kapilláris fal mentén, és az állófázison kialakuló elektroendozmózis biztosítja! Pécs,

66 Kapilláris elektrokromatográfiás álló fázisok
Az álló fázist vagy betöltjük a kapillárisba, vagy - in situ - a kapillárisban hozzuk létre a monomer oldatok beinjektálása után. A szelektivitást az álló fázishoz kötött ligandumokkal (pl. CD, fehérjék, stb.) lehet változtatni Pécs,

67 Elektrokromatogram. Minta: cytochrome c tripszines emésztés után
Elektrokromatogram. Minta: cytochrome c tripszines emésztés után. Kisérleti körülmények: izokratikus elválasztás 25° és 55° fokon. Oszlop: 75 μm i.d. fused silica kapilláris, 30 cm, mozgó fázis: 40% acetonitrile, 50 mM foszfát puffer, pH 2.5; 230 kV; 214 nm/UV detektálás. Pécs,

68 Alkalmazások Pécs,

69 Kapilláris zóna-elektroforézis
szérum-elektroforézis / liquor / follikulus folyadék Kapilláris zóna-elektroforézis adalékanyag jelenlétében királis elválasztások ciklodextrinekkel királis elválasztás fehérjékkel affinitás elektroforézis Izoelektromos fókuszálás Gél-elektroforézis fehérje-profil analízis bakteriális fehérjék külső membrán-fehérjék Gél-elektroforézis chip-technikával „Cell-sorter” chip-technikával Pécs,

70 Myeloma multiplex, sclerosis multiplex
Pécs,

71 Szérum-elektroforézis
A módszer rutin-technika, egyszerre több kapillárisban Pécs,

72 MegaBace - 96 minta egyidőben
Pécs,

73 MegaBace kapillárisok
Pécs,

74 Királis elválasztás kapilláris elektroforézissel
Ciklodextrin befogadó gyűrűvel a vándorlási sebesség megváltozik, az enantiomerek egymástól elválnak Pécs,

75 Enantiomerek elválasztása
Hexobarbitál enantiomerek elválasztása fedett és kezeletlen kapillárisban Pécs,

76 CEC „continuous bed” HPLC CEC + nyomás
CEC és HPLC ligand-kicserélődéssel D,L Phe elválasztása hidroxiprolin-származék oszlopon CEC „continuous bed” HPLC CEC + nyomás Pécs, Electrophoresis 21 (2000)

77 Triptofán-származékok elválasztása zóna-elektroforézissel
triptofán metil-észter TME, triptofán etil-észter TEE triptofán butil-észter TBE Pécs,

78 Kapilláris elektroforézis transzferrin jelenlétében
Vándorlás elektromos térben egy fehérje zónán keresztül minta transzferrin minta a transzferrin zóna nem vándorol Háttérelektrolit: 10 mM MES, pH 6 fedett („coated”) kapilláris pI (Tf) = 6 Pécs,

79 A triptofán-észterek két-két komponensre válnak szét
Transzferrin jelenlétében az enantiomerek elektroforetikus vándorlása különbözik egymástól, amely specifikus kölcsönhatásra utal Pécs,

80 Az elválasztás mértéke függ a transzferrin zóna hosszától
TME TEE TBE mm 100 80 70 50 40 30 20 10 Zónahossz Pécs,

81 Labetalol optikai izomerek elválasztása
modellezéssel a kötőhelyek feltérképezhetők Pécs,

82 Fehérjék és endotoxinok kölcsönhatása
endotoxin hemoglobin 0 h 2 h endotoxin – hemoglobin komplex A lipopoliszaccharidok a fehérjékkel való kölcsönhatás alapján „láthatók”. A különböző komplexek jellemző elektroferogramot adnak Pécs,

83 „Chip”-ek 1998 1999 2000 2001 2002 RNA 6000 Nano LabChip
DNA 1000 LAbChip Protein 200 Plus LabChip Cell Fluorescence LabChip Pécs,

84 A kapilláris elektroforézis nagy kalandja
Pécs,

85 Injektálás chip-en Pécs,

86 Többszörös analízis, reakciók alkalmazása
Pécs,

87 Baktériumok fehérje-profilja gél-elektroforézissel
molekulasúly szerinti elválasztás folyamatos detektálás fluoreszcens festék alkalmazásával több minta egymás utáni elválasztása gyorsan összehasonlító kiértékelés Pécs,

88 Fehérje-profil analízis
Pseudomonas aeruginosa NIH Hungary törzs fehérje-profilja kapilláris chip elektroforézissel molekulaszűrő polimer oldaton keresztül vasat tartalmazó és vasat nem tartalmazó táptalajon való tenyésztés után Pécs,

89 Összehasonlító analízisek standardizált körülmények között
IgG minták és standard fehérjekeverékek (teljes analízisidő: 30 perc) Pécs,

90 Gél-kép konverzió A számítógép által konvertált kép / a standard fehérjék azonos pozícióban! Pécs,

91 Baktériumok fehérje-profilja
Pécs,

92 Sejt-analízis chip-en
Pécs,

93 CE - MS Electro-spray ionization Pécs,