A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK

Az előadások a következő témára: "A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK"— Előadás másolata:

1 A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK
RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK 1970 – A molekuláris biológia forradalmának kezdete A Haemophilus influenzae restrikciós endunuklázának felfedezése Három fő csoport I típus  Specifikus szekvenicákat ismer fel, de elvándorol a DNS-en (~ bázis) mielőtt az egyik szálat elhasítja, nukleotideokat szabadít fel (~75) a hasítás helyén. Egy másik endonuckleáz kell a második szál hasításához Pl. EcoK. Mg2+, ATP és SAM (S-adenosyl methionine) SAM kell hozzá

2 A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK
RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK II típus  Speciális célszekvenciát ismer fel és hasítja a DNS-t mindkét szálon a felismerési szekvenciában vagy annak környezetében pl. EcoRI Mg2+ kell Ez a típus az elterjedt III. típus  I és II. Kombinációja. Mindkét DNS szálat hasítja egy meghatározott távolságra a felismerési szekvenciától plHgaI Mg2+-t ésATP-t igényel

3 A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN
HASZNÁLATOS ENZIMEK RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK Enzim Felismerőhely hossza Felismerő-hasítóhely Forrás organizmus AluI 4 AG/CT Arthrobacter luteus HphI 5 GGTGAN8/ Haemophilus parahaemolyticus EcoRI 6 G/AATTC Escherichia coli BamHI 6 G/GATCC Bacillus amyloliquefaciens Ragadós végeket adó hasítások (sticky end) 5' túlnyúló Sal I 6 5' G TCGAC 3' 3' CAGCT G 3' Streptomyces albis 3' túlnyúló Kpn I 6 5' GGTAC C 3' 3' C CATGG 5' Klebsiela pneumonia Tompa végű hasítások (blunt end) Hae III 4 5' GG CC 3' 3' CC GG 5' Haemophilus aegyptus

4 Palindrom példák KIS EREK MENTÉN LÁP SÍK ÖLÉN ODA VAN A BÁNYA
RABJA JAJ BARANYÁBAN A VADON ÉLŐ KIS PÁLNÉT NEM KERESIK

5 FEHÉRJE TÚLTERMELTETÉS SZEMPONTJÁBÓL
Isoschisomers AtcI ' GGTAC/C 3' KpnI ' GGTAC/C 3' XmaI ' C/CCGGG 3' SmaI ' CCC/GGG 3' Kompatibilis véget adó enzimek SalI ' G/TCGAC 3' XhoI ' C/TCGAG 3' FEHÉRJE TÚLTERMELTETÉS SZEMPONTJÁBÓL KITÜNTETT ENZIMEK AflIII ' A/CPuPyGT 3' BspHI ' T/CATGA 3' NcoI ' C/CATGG 3' NdeI ' CA/TATG 3'

6 DNS METILÁZOK - dam metiláz (dezoxiadenin metiláz)
5’ GATC 3’ felismerő hely N6 pozícióban metilez adenin sok dam metiláz érzékeny enzim van pl. MboI, XhoI, egyenként ellenőrizni kell, érzékenység esetén - dam- törzs használata - nem érzékeny izoskizomer használata (ha van) (MboI - Sau3AI)

7 dcm metiláz (dezoxicitozin metiláz)
5’ CCAGG 3’ vagy 5’ CCTGG 3’, C5 pozícióban metilez - hasonlóképpen léteznek dcm metiláz érzékeny enzimek - megoldás ugyanaz, mint a dam esetén citozin Sok metiláz van még, hasonló felismerő kanonikus szekvenciával, mint a restrikciós enzimek pl. M. EcoRI metiláz

8 METILÁCIÓ FÜGGŐ RESTRIKCIÓS RENDSZEREK
- mrr 6 metiladenin esetén - mcrA m5CG szekvencia kell - mcrB Pum5C esetén METILÁZOK FELHASZNÁLÁSI TERÜLETE: DNS védelem hasítások ellen - laza specificitású helyek specificitás növelése (ha az egyik szekvencia tartalmazza a metiláz felismerő szekvenciáját (pl. HincII: GTPyPuAC, amiből GTCGAC a TaqI metiláz felismerőhelye, HincII metiláz érzékeny - metiláció függő restrikciós helyek előállítása

9 Polimerázok DNS függő DNS polimerázok RNS függő DNS polimerázok
Templátfüggetlen DNS polimeráz DNS függő RNS polimeráz 5’  3’ polimeráz aktivitás

10 DNS függő DNS polimerázok

11

12 DNS jelölés, nick transzláció

13

14

15

16 DNS jelölés, random priming
N: A,C,G,T (NNNNNN) denaturálás hibridizáció DNS polimeráz dNTP polimerizáció denaturálás Jelölt szálak

17

18

19 DNS függő termofil DNS polimerázok

20 Templát független DNS polimeráz

21 RNS függő DNS polimeráz

22

23 DNS függő RNS polimerázok

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33