Génexpresszió szabályozása szintetikus oligonukleotidokkal

Az előadások a következő témára: "Génexpresszió szabályozása szintetikus oligonukleotidokkal"— Előadás másolata:

1 Génexpresszió szabályozása szintetikus oligonukleotidokkal
sejtmembrán fehérjék mRNS sejtmag Kromoszómális DNS oligonukleotid citolplazma Cél molekula: fehérje mRNS DNS oligonukleotid iránya a leolvasással megegyezõ v. kettõsszálú a leolvasással ellentétes a leolvasással megegyezõ RNS DNS duplex triplex köcsönhatás fehérje-DNS RNS-DNS hibrid/ RNáz H Hoogsteen féle triplex Gátlás transzkripciós szabályozás transzláció transzkripció

2 Triplex képződésének kölcsönhatásai
homopurin homopirimidin szekvenciáknál

3 Antiszensz oligonukleotidok lehetséges célszekvenciái a mRNS-en
exon-intron határhoz, slicing gátlás Az 5’ sapka régióhoz Transzlációs iniciációs régióhoz Génen belüli régióhoz Kapcsolódó oligonukleotidok Elsődleges hatásmechanizmus: Az endogén RNázH leemészti a DNS:RNS hibrid RNS szálát

4 Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer
B B 1 1 O H hordozó B 1 O O O O di-MeO Tr A c O O 2% DCA/DCM O O di-MeO Tr hordozó hordozó < 1 % Ac 2 O O H hordozó B 1 B 2 O O tetrazol di-MeO Tr O N újabb ciklus O P N N C O > 99 % B 2 B 2 O O O di-MeO Tr O O I 2 / H 2 O B di-MeO Tr O 1 B O 1 O O O O O P O O N C P O O O N C O O hordozó hordozó

5 Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer
B B 1 1 O H hordozó B 1 O O O O di-MeO Tr A c O O 2% DCA/DCM O O di-MeO Tr hordozó hordozó < 1 % Ac 2 O O H hordozó B 1 B 2 O O tetrazol di-MeO Tr O N újabb ciklus O P N N C O > 99 % B 2 B 2 O O O di-MeO Tr O O I 2 / CS2 B di-MeO Tr O 1 B O 1 O O O O O P O S N C P O O O N C O O hordozó hordozó

6 Oligonukleotid szintézis: H-FOSZFONÁT MÓDSZER
H lehet Me is Előny: az oxidációt elég a végén elvégezni, vagy – igény szerint – el sem kell  töltés nélküli molekula  Könnyebben átmegy a sejtfalon/membránon

7 PEPTID NUKLEINSAVAK (PNA)
Nincs cukorfoszfát gerinc, ehelyett peptid kötéssel összekapcsolt lánc van Specifikus Stabil PNA T10-Lys TTTTTTTTTT-Lys PNA SV40-Lys ATTTTCTTCATTTTTTCTTC-Lys Ma már külön könyv van a PNA- alkalmazásairól

8 MUTAGENEZIS - in vivo gének elrontására,vagy módosítására
Random mutagenezis találomra létrehozott mutációk mutagén anyagok: UV, kemikáliák, radioaktív sugárzás PCR: a hőstabil polimerázok átírási hűsége rosszabb mutagén törzsek transzpozon mutagenezis Irányított mutagenezis Adott helyen - deléciók inszerciók léterhozása - pont mutációk létrehozása

9 oriV: szűk gazdaspecificitás
Gének irányított szétroncsolása interpozon mutagenezis Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar2 Ar: antibiotikum rezisztencia Ar2 oriT ori Ar1 Ar2 vad típus mutáns poláris hatás

10 oriV: szűk gazdaspecificitás
Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélül Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar: antibiotikum rezisztencia oriT ori Ar1 vad típus mutáns poláris hatás ?

11 Gének irányított mutagenezise a dut/ung rendszer alapján
pontmutációk! Dut: dUTPase Ung: uracil-N-glikoziláz Ne épüljön be dezoxiuracil A DNS-be in vitro szintézis, Klenow

12 QUICK CHANGE MUTAGENEZIS (STRATAGENE)

13 FEHÉRJE TERMELTETÉS VAN GÉNÜNK: Legyen az prokarióta vagy eukarióta
természetes vagy szintetikus vad típusú vagy mutáns

14 FEHÉRJE TERMELTETŐ RENDSZEREK
PROKARIÓTÁK E. coli ismert, Bármilyen fehérje, feltéve, ha - nem túl nagy - nem túl kicsi - nem túl hidrofób - nincs túl sok cisztein benne szekréciós rendszere minimális Bacillus subtilis jól ismert, ha nem is annyira, mint az E. coli van szekréciós rendszere EUKARIÓTÁK emlős sejtvonalak minden fajta fehérje termeltethető bennük tranziens expressziós rendszerek viszonylag gyors, de korlátozott lehetôségek, stabil expressziós rendszerek hosszú, fáradságos optimalizálást igényel élesztő gyorsan szaporodó eukarióta sejtvonal, sok ismeretanyag viszonylag könnyű kezelhetőség poszttranszlációs modifikációk lehetősége

15 Escherichia coli ELŐNYÖK  óriási mennyiségű ismeretanyag
könnyű kezelhetőség, gyors növekedési sebesség, viszonylag olcsó médium nagy mennyiségű biomassza gazdaságos előállítása ismert szelekciós rendszerek legtöbb expressziós rendszer HÁTRÁNYOK  általában nem szekretál a sejten belül redukáló atmoszféra diszulfid hidak kialakulása gátolt az eukariota poszttranszlációs módosítások általában nem megvalósíthatóak nem alakul ki a megfelelő aktiv szerkezet, rossz folding

16 STRATÉGIÁK TÚLTERMELTETÉSRE
KONSTITUTÍV PROMÓTER INDUKÁLT TERMELTETÉS a fehérje a teljes növekedési fázis alatt expresszálódik nagy sejttömeg elérése után a fehérje visszanyerése nem igazán használatos, toxicitási problémák miatt a promoter represszált állapotban van a növekedés egy bizonyos fázisáig valamilyen indukcióval derepresszió további növesztés fehérje visszanyerése legáltalánosabban használt stratégia toxicitás sok esetben megoldható

17 PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS VEKTOR ELEMEI
SZF TSZE GS Pr  SD kódoló szekvencia TT -35 -10 STOP kodon UAAU UGA UAG TTGACAN17TATAAT START kodon AUG GUG UUG 5’ UAAGGAGGN(3-11) AR ORI Pr: promóter TT: transzkripciós terminációs szignál, SZF: szabályozó fehérje,, TSZE: transzlációt szabályozó elemek, SD: Shine-Dalgarno szekvencia, AR: antibiotikum rezisztencia, ORI: replikációs origo GS: gazdasejt

18 A génexpresszió szabályozása
transzkripció transzláció DNS RNS FEHÉRJE transzripciós szinten poszt-transzkcripciós szinten (mRNS degradáció, protein stabilitás, stb.)

19 Különböző faktorok relatív hatása a fehérje termeltetésre E. coli-ban
Promóter indukálhatóság kb x Gazdasejt kb x A mRNS 5’ struktúrája kb. 100 x Transzláció kb. 100 x növekedési sebesség kb. 50 x (mRNS stabilitás)

20 túltermeltetésnél: ne legyen nagyon magas a kópiaszám  toxikus fehérjék alapexpressziójának visszaszorítása “Runaway” plazmidok: indukálható kópiaszámú plazmidok

21

22 TRANSZKRIPCIÓ Iniciáció fehérje termeltetés során a legfontosabb
Elongáció mivel a gén belsejében van, nem manipulálható Termináció a transzkripció befejezése, a transzkripciós apparátus túlterhelésének elkerülésére

23 A transzkripció iniciációja prokariótákban
sigma faktor holoenzim ? /` NTD  CTD RNS polimeráz RNS polimeráz alegységek: , `, , ,  promóter 5’ 3’ 3’ 5’ k1 k-1 Ha k1 >> k-1, akkor a polimeráz holoenzim nagyon erősen kötődik a promóter szekvenciához, a polimeráz nehezen tudja elindítani a polimerizációs reakciót. Tehát a transzkript mennyisége csökken, habár in vitro a promóter és a holoenzim közötti kapcsolat erős. 5’ 3’ k2 k-2 5’ 3’ 3’ 5’ 5’

24 70 promoter szekvencia: -10 and -35 régiók

25 A tökéletes 70-függő promóter
UP elem -35 Ext. -10 D +1 AAATAAAATTTTTAAn..nTTGACAnnn…nnnTGnTATAATnnattA 14nt 4-6nt 4-6nt 17nt A s70 ismeri fel Az a alegység kötődik

26 Bakteriális  faktorok

27 Különböző gének expresszióját különböző szigma faktorok befolyásolják
tápelvonás, Stressz, Vasra éheztetés, sejtsűrűség, Felületi adházió Transzkripciós faktorok (Szigma) gén expresszió változás  Morfológiai & fiziológiás változások   Adaptáció / Védekezés Upon entry into stationary phase, bacteria undergo morphological and physiological changes in order to adapt and prevent cell damaging. These adaptations are accompanied by a switch in gene expression resulting form the action of different transcription factors. Among these factors involved in transcription regulation in stationary phase, there is sigmaS, an alternative subunit of the bacterial RNAP which accumulates in stressed cells or at the onset of stationary phase.

28 Két  faktor felépítése

29 riporter fehérje aktivitás  Western blot fehérje detektálása
A génexpresszió tanulmányozása különböző módszerekkel különböző szinteken fehérje érése transzláció transzkripció Enzim aktivitás mérés mRNS detektálása Riportergén riporter fehérje aktivitás  promóter aktivitás Western blot fehérje detektálása A vizsgált operon promóter

30 nem specifikusan kötődik
ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) I. más néven gél retardációs assay a DNS-t, amely feltételezhetően fehérjét köt, megjelöljük jelölés lehet végen, szálon belül, egyszálon, kétszálon, kötési kísérletben a DNS kétszálú! a DNS ne legyen től hosszú bp, minél hosszabb a DNS, annál több nem specifikus reackió történik lehet tiszta fehérje vagy fehérje populáció Natív poliakrilamid gél -: fehérje nélkül, +: fehérjével összekeverve DNS jelölés DNS kötő fehérje nem kötődik kötődik összekeverés nem kötődik kötődik nem specifikusan kötődik

31 ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) II.
a mobilitás eltolódás inkább a komplex méretét jellemzi, a kölcsönhatás errősségét nem a kölcsönhatás erősségét a nem kötöt DNS, és a kötésben levő DNS jelének intenzitása jellemzi minél kevesebb fehérje okoz erős jelet az eltolódott sávban annál erősebb a kölcsönhatás SUPERSHIFT ASSAY titrálás fehérje mennyiségre ha van tippünk, hogy milyen fehérje kötődik és van rá specifikus ellenanyagunk hozzáadott fehérje mennyiség nő  nem kötődik kötődik ellenanyag is kötődik a DNS - fehérje kölcsönhatás erősségéről ad felvilágosítást, nem a képződött mRNS mennyiségéről -: fehérje nélkül, +: csak fehérje hozzáadása, ++: fehérje és ellenanyag hozzáadása

32 DNázI FOOT PRINT I. DNS hossz 100 – 200 bp
DNS jelölés szigorúan a végén, szálspecifikusan mind a két jelölt szállal meg kell csinálni a kötési kísérletben a DNS kétszálú denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis Maxam-Gilbert létra DNázI hasítás DNázI * * G A+G C+T C D *

33 hiperszenzitív hely (HSH)
DNázI FOOT PRINT II. DNázI hasítás -: fehérje nélkül +: fehérje jelenlétében Maxam-Gilbert létra * * G A+G C+T C D- D+ hiperszenzitív hely (HSH) DNázI HSH * *

34 METILÁCIÓS INTERFERENCIA
DNS jelölés szigorúan a végén, szálspecifikusan a DNS-t Maxam-Gilbert szerint dimetilszulfáttal (DMS) metiláljuk mind a két jelölt szállal meg kell csinálni a kötési kísérletben a DNS kétszálú denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis piperidin hasítás MeG-nél Maxam-Gilbert létra Me Me Me * G A+G C+T C G G * G G G piperidin DMS G G G G Me csak a jelölt szálon szemléltetve

35 METILÁCIÓS INTERFERENCIA II.
piperidin hasítás MeG-nél Maxam-Gilbert létra modell: PM és NK mintázat K mintázat G A+G C+T C PM K NK * * tegyük fel, hogy ezek a G-k esszenciálisak a kötéshez DMS EMSA  K: kötött NK: nem kötött kivágás, izolálás   piperidin hasítás denaturáló PAGE PM: protein mentes

36 UV KERESZTKÖTÉS (CROSS LINKING)
Ismeretlen DNS kötő fehérjék molekulatömegének becslésére 1. A DNS szálat szálon belül jelöljük, és Br-dUMP-t építünk be (a Br-dUMP nem zavarja a kötődést) minta marker : Br MS? SDS-PAGE jelölt fehérje DNázI kezelés   EMSA UV fény kivágás, izolálás  a fehérje DNS komplex kötés kovalens lesz

37 A mRNS mennyiségének meghatározása
Northern-blot és hibridizáció reverz-transzkripció kapcsolt kvantitatív PCR korrekt, de belső összehasonlító standardokat igényel

38 In vitro transzkripció
Regulátor G mentes kazetta régió (3-400 bp) Promóter transzkripcionálisan aktív sejt vagy sejtmagi extraktum + ATP, CTP, 32P-UTP, a képződött radioaktív RNS analizise denaturáló PAGE-n. csak a fenti bp-os fragmentum fog látszani, a többi tartalmaz G-t  ezek transzkirpciója leáll mennyiségi becslés: denzitometriásan, vagy PhosphorImager-rel elsősorban transz szabályozó elemek hatásának vizsgálatára alkalmas

39 Riporter gének alkalmazása
Regulátor régió riporter gén (pl. lacZ) Promóter SEJT -galaktozidáz (LacZ) -galaktozidáz aktivitás mérés feltételezi, hogy nincs poszt-transzkripciós szabályozás, és az enzim specifikus aktivitása is minden mintára egyforma aktivitás mérés kiküszöbölése GFP: Green Fluorescent Protein, gerjesztve floureszkál a kapott aktivitást illetve szignált normálni kell a sejt vagy protein mennyiségére