Fonalas fágok I. M13, f1 és fd fágok, genomjuk 98%-ban azonos  rekombinálnak egymással Az érett fágok genomja egyszálú cirkuláris DNS, a sejten belül:

Az előadások a következő témára: "Fonalas fágok I. M13, f1 és fd fágok, genomjuk 98%-ban azonos  rekombinálnak egymással Az érett fágok genomja egyszálú cirkuláris DNS, a sejten belül:"— Előadás másolata:

1 Fonalas fágok I. M13, f1 és fd fágok, genomjuk 98%-ban azonos  rekombinálnak egymással Az érett fágok genomja egyszálú cirkuláris DNS, a sejten belül: RF, replikatív forma  ez alkalmas genetikai manipulációkra A fág genomjának 90%-a 10 fehérjét kódol, nagyobb intergenikus régió a VIII és a III gének illetve II és IV gének között, regulátor funkció A fág a szexpiluson keresztül fertőz, a DNS (+) szál jut be a sejtbe  ebből lesz kétszálú replikatív forma perc, kópia Nem öli meg a gazdasejtet, csak lassítja a növekedést VIII fehérje a fő strukúr protein, 2700 kópia, a III. számú fehérje a filament végén néhány kópiában Az RF forma képződése után transzkripció, transzláció, Replikáció: II fehérje töréspontot idéz elő, DNS polimeráz I polimerizál WC papír modell. a II. fehérje vagdossa egységnyi darabokra V. fehérje: egyszálú DNS kötő fehérje, represszálja a II gén expresszióját  kópiaszám kontroll

2

3 A fonalas fágok életciklusa

4 Fonalas fágok II. Fonalas fágvektorok
A fág nem a sejten belül szerelődik össze, hanem a genom az V. fehérje a (+) szálhoz kapcsolódva vándorol a membránhoz, ott a DNS a membránon keresztüljutva beburkolódik a kapszid fehérjékbe Nincs szoros mérethatára a pakolódásnak Fonalas fágvektorok 500 bp a II és IV gének között nem kidobható: a (+) és (-) szál szintézisének iniciációját és terminációját befolyásolják,  független transzkripciós terminációs szignál inszerciók befolyásolják a fág replikációt, mutációk a II és IV génben kompenzálnak LacZ  komplementáció, nincs antibiotikum minireplikon kiugrása

5 Egy fonalas fág térképe

6

7 Epitóp könyvtár készítése, fág display vektorok
gVIII (vagy gIII) gén (NNN)x X : 6 vagy hosszabb

8 Egy példa: anthrax toxin inhibitor tervezése phage display technikával
Az anthrax toxin érése, patogenezise, potenciális célpontok A (PA63) heptamert felkötjük egy oszlopra

9 Egy példa: anthrax toxin inhibitor tervezése phage display technikával II.
TYWWLD ACCTATTGGTGGCTGGAT DNS izolálás, szekvenálás (NNN)x A (PA63)7 oszlopon kromatografáljuk elúció specifikus felkötődik átfolyó

10 Másik példa: monoklonális ellenanyagok előállítása pIII fág display technikával
Egy demonstrációs anyag a pIII alapú fág display technikára:

11 Fagemidek: fonalas fágok és plazmidok hibridjei

12 a középső, centrális régió eltávolítható
A  fágok általános felépítése  genetikai anyag: kb duplaszálú lineáris DNS  fertőzéssel jut a sejtbe,  nagy hatékonyság  két életciklus: - lizogén: a fág genetikai anyaga beépül a kromoszómába, a sejt túlél - lítikus: érett fág képződése során a sejtek lizálnak elpusztulnak  a végeken ragadós. ún. ’cos’ végek bal kar 20 kb centrális régió 14 kb jobb kar 9 kb cos a középső, centrális régió eltávolítható EcoRI BamHI SalI

13

14 A lambda fág életciklusa

15

16 Lambda fág példák Helyettesítő/ replacement vektorok
Inszerciós vektorok

17 A klónozás menete helyettesítő vektorok esetén
A pakolódás feltétele, hogy a rekombináns gemon mérete a vad típus méretének 79 – 105 %- a lehet.

18 Szelekciós elvek l fágok esetén
bepakolódási szabály: vad típusú l fág méretének %

19

20 Génátvitel transzdukcióval baktériumokban
bakteriális DNS-t is tartalmazó többnyire defektív fágok fág DNS intakt normál fág transzdukáló fág bakteriális fágfertőzés lizogén életciklus fág genom integrálódása a baktérium kromoszómájába a fág által hordozott bakteriális DNS beépülése rekombinációval

21 plazmidok és l fágok hibridjei
Kozmidok: plazmidok és l fágok hibridjei fertőzéssel bejuttatható plazmidok

22

23 Mesterséges kromoszómák:
BAC (bacterial artificial chromosome) vektorok

24 Mesterséges kromoszómák: YAC (yeast artificial chromosome) vektorok

25 GÉNEK ELŐÁLLÍTÁSÁNAK STRATÉGIÁI
Gének izolálása A megfelelő organizmus génkészletéből a kívánt régiót tartalmazó szakasz valamilyen módon való kinyerése elterjedtebb, általában gyorsabb, kevesebb munkát igényel (ha lehetséges) nem feltétlenül szükséges szekvencia információ, de nem árt, ha van a különböző organizmusok genom szekvenciái nagy segítséget jelenthetnek hátrány: kodon preferencia adott, nem tervezhető Gének szintézise Szintetikus oligonukleotidokból történő összeépítés kevésbé elterjedt a gén hosszától függően sok munkát igényelhet, a fehérje elsődleges szekvenciáját ismerni kell előny: tervezhető a biológia szabályainak figyelembevételével, az optimális kodon felhasználás a gazda sejthez igazítható, az optimális fehérje túltermeltetési tapasztalatok jobban kamatoztathatók

26 KÖNYVTÁRAK TÍPUSAI - genomiális
a teljes genomból készül, elvileg minden információt tartalmaz (pl. nem transzlálódó régió, szabályozó régiók, intronok) mind prokariótákból, mind eukariótákból - cDNS az aktívan termelődő mRNS-ekből készül csak az érett mRNS szekvenciáját tartalmazza (nincs intron szabályozó régió stb) csak eukariótákból expressziós a cDNS-eket ún. expressziós kazettába klónozzuk, ezáltal a kódolt fehérje (ha a mRNS kódol ilyet) aktívan termelődhet Követelmények a könyvtárakkal szemben - fedje le a teljes genomot, illetve mRNS populációt - ne legyen redundáns

27 in vitro pakolás: összekeverés l fágfehérje extraktummal
GENOMIÁLIS KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSÉNEK SÉMÁJA hasító helyek bal kar jobb kar centrális régió emésztés részleges vagy kb méretű teljes emésztés fragmentek bal kar jobb kar ligálás konkatamer in vitro pakolás: összekeverés l fágfehérje extraktummal A pakolódás feltétele, hogy a rekombináns gemon mérete a vad típus méretének 79 – 105 %- a lehet.

28 Genomiális könyvtár készítése kozmidban
SmaI c2RB 6.8 kb cos EcoRI BamHI HindIII ClaI Ampr ori Kmr Genomi DNS részleges emésztése Sau3A-val (a Sau3A kompatibilis véget ad a BamHI-gyel A 30 – 45 kb régió méret szerinti elválasztása BamHI- SmaI emésztés Ampr ori cos ligálás 30 – 45 kb-os fragmentek cos cos in vitro pakolás l fehérje extraktummal, fertőzés szelekció ampicillin rezisztens klónokra kozmid könyvtár

29 PARCIÁLIS GENOMI KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSE
csak akkor, ha van hibridizációs próbánk Előzetes Southern M A B A+B M C D C+D Preparatív gél elektroforézis A + B vektor A B hasítás A+B-vel defoszforilálás izolálás, Southern M A B 2. frakció ligálás részleges könyvtár

30 Southern blot és hibridizáció

31 Bakteriális shot-gun könyvtár készítése
E. coli transzformálás elektroporálás kromoszómális DNS nebulizátor 2-3,5 kb fragmentek végek tompítása defoszforilálás összetört DNS Preparatív gél elektroforézis

32 A KROMOSZÓMÁLIS SÉTA Cél Ismert marker 1. Ismert marker 2. 1. klón :
Eco RI Bam HI Hind III Pst I Sma 2. klón 3. klón 4. klón

33 A KROMOSZÓMÁLIS SÉTA II

34 A mRNS-ekkel szemben támasztott követelmények
cDNS könyvtár A mRNS-ekkel szemben támasztott követelmények  Integritás  A mRNS mérete, degradált-e Megoldás: denaturáló gélelektroforézis (várt méret kb, a többség kb)  Lehet-e teljes hosszúságú cDNS-t szintetizáltatni Megoldás: elõzetes reverz transzkripció jelölt nukloetidokkal elektroforézis  Lehet-e nagy molekulasúlyú fehérjéket in vitro szintetizálni Megoldás: in vitro transzláció jelölt aminosavakkal  A kérdéseses fehérjét tudjuk-e szintetizáltatni Megoldás: in vitro transzláció + immunoprecipitáció

35 A cDNS könyvtár mérete  A kérdéses mRNS előfordulási gyakorisága
különböző mRNS emlős sejtekben  nagy gyakoriságú %, pl. globin nem problematikus  kis gyakoriságú  0.5 % nagy könyvtárat kell készíteni, és a detektálás is gond N = ln(1-P) / ln(1-1/n) N: a szükséges klónok száma a könyvtárban, P: annak a valószínûsége, hogy a keresett klón benne legyen a könyvtárban, 1/n: az a mRNS frakció, ami 1 db keresett mRNS-t tartalmaz immunoprecipitált in vitro transzlált termék/ összes transzlált termék pl. 14 molekula/sejt,  1/n = 37000, P= 0.99, N=

36 Dúsítási eljárások Megoldás: dúsítás ( 1% alatt célszerű)
 mRNS méret szerinti elválasztása - elektroforetikus úton - sucrose grádiensen minden frakciót tesztelni kell immunoprecipitációval  cDNS méret szerinti elválasztása könnyebb, ponotsabb  Poliszómák immunoprecipitációja technikailag nehéz, és csak megbízható források esetén működik

37 cDNS-könyvtár készítése primer adapter módszerrel

38 cDNS-könyvtár készítése

39 cDNS könyvtár készítése: Okayama-Berg módszer I

40 cDNS könyvtár készítése: Okayama-Berg módszer II

41

42 Biotinilálás

43 Szubsztraktív hibridizáció
nem indukált minta, mRNS tisztítás indukált minta, mRNS tisztítás AAAAAAAAA 3' 5' TTTTTTTTT biotin reverz transzkripció B RnázH immobilizált streptavidin SA cDNS könyvtár csak indukált mRNS átfolyó cDNS, jelölés hibridizáció