Előadást letölteni
Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon
KiadtaVince Németh Megváltozta több, mint 10 éve
1
Az élet keletkezése ELTE, Növényrendszertani és Ökológiai Tanszék
Dr. Kun Ádám, Ph.D. tudományos főmunkatárs okleveles biológus, okleveles vegyész Kedves Hallgatók! Ahogy az órán is jeleztem adatot és képletet nem kérdezek vissza. Tehát például kérdezhetem, hogy mire jó a formóz reakció, vagy, hogy prebiotikus körülmények között adenint, hogyan lehet előállítani, de a reakciók NEM kellenek. ELTE, Növényrendszertani és Ökológiai Tanszék
2
Bevezetés a biológiába
Müller Viktor: Az Élet definíciója Müller Viktor: Az immunrendszer Kun Ádám: Az Élet keletkezése Kun Ádám: Anyagcsere Fedor Anna: Genetika és evolúciógenetika Gedeon Gábor: Egyedfejlődés és szabályozás Gedeon Gábor: Egyedfejlődés Zachár István: Makrotaxonómia és replikátorok Garay József: Evolúció Czárán Tamás: Ökológia Fedor Anna: Neurobiológia Számadó Szabolcs: Kommunikáció és együttműködés Számadó Szabolcs: Kultúra Az előadások sorrendje még változhat.
3
Magamról Tanulmányok Kutatás (elméleti biológia)
Okleveles biológus, Okleveles vegyész PhD ökológia és elméleti biológia Kutatás (elméleti biológia) Klonális növények ökológiája Együttműködés evolúciója Élet keletkezése
4
Magamról Oktatás Bevezetés a biológiába (BSc) Evolúcióbiológia (BSc)
Biometria (BSc) Evolúcióbiológia és zoológia (MSc) Általános ökológia (MSc) Programozás biológusoknak (BSc-MSc)
5
Bevezetés a biológusságba
Kérdezzetek! Döntsd el, hogy „mi leszel, ha nagy leszel” Gyűjtsetek ismereteket Tudjatok angolul Kérdezzetek. Az oktatókat nem zavarja, ha a hallgatók az előadás alkalmával kérdeznek (ezt abban az esetben szokták csak elhárítani, ha az előadáshoz szorosan kapcsolódik egy gyakorlat, ahol a kérdés feltehető). Sőt, a kérdés jelzi az oktató felé, hogy a hallgatóság figyel és érdeklődik. Továbbá segít azonosítani az előadás kevéssé érthető részét. Ne felejtsétek, hogy az oktatók számára a tanított anyag triviális, míg nektek nem. Döntsétek el, hogy kutatók szeretnétek-e lenni, s hogy milyen témában. A kutatói léthez kell MSc, s később PhD (doktori fokozat). A doktori – s nektek már a mester – képzésre bejutáshoz sikeres felvételi kell. A doktorira bejutáshoz szinte kötelező, hogy TDK-n (Tudományos Diákköri Konferencia) vegyél részt, azaz 2. vagy 3. évesen érdemes elkezdeni valahol kutatni. Ne gondoljatok napi sok-sok órára, de el kell kezdened beleásni magadat egy témába, illetve kisebb kutatásokat végezni. Gyűjtsetek ismereteket. Amikor magasabb évfolyamokon dönthettek, hogy mit tanuljatok, akkor a választási kritérium ne az legyen, hogy „melyik a legkönnyebb”, hanem, hogy „melyikkel szerezhetem a legtöbb nekem fontos ismeretet.” Lehet, hogy ez most furcsán hangzik, de diplomázás után sokkal nehezebb rászánni magadat egy-egy ismeret elsajátítására (könyvből vagy drága tanfolyamokkal), mint az amúgy is kötelező tanulmányaid részeként. Tudjatok angolul. A tudományos szakirodalom angolul van. A szakirodalmat olvasnotok kell, s később angolul kell írnotok is. Ha nem tudtok angolul a szakmátokban sem tudtok előrejutni.
6
Bevezetés a biológiába
Az evolúciós gondolkodás biológián belüli univerzalitásának megmutatása Biológiai érdekességek tárgyalása A biológia különböző területeinek egymással való szoros összefüggésse (avagy miért tanulunk azt is) A biológiai vizsgáló módszereket bemutatása
7
A megfejtetlen rejtély: az élet keletkezése
Tudjuk, hogy van élet Ha találunk egy utat, akkor sem lehetünk biztosak benne, hogy azt az utat járta be az Élet A tudomány alapfeltevése: A metafizikainak nincs hatása arra amit vizsgálunk.
8
Életet teremteni egyszerű…
9
Életet „élettelenből” előállítani kevésbé...
10
Út az élethez – Az összetettség növekedése
Makromolekula Monomer Protosejtté integrálás Funkció szerzés
11
Indormáció hordozó templát
Funkció szerzés Kódolja Kompartmentalizál Anyagcsere Enzim Indormáció hordozó templát Membrán Monomert állít elő Replikál Monomert állít elő
12
A monomerek és makromolekulák prebiotikus szintézise
Funkció Monomer Makromolekula katalizátor (enzim) aminosav fehérje információ hordozó nukleotid (bázis, cukor) DNS / RNS membrán zsírsavak micella, lipid vezikulum Nem állítja senki, hogy rögtön a mai építőkövek jelentek meg az első élet felé tett lépésekben, bár az első élőlényben biztosan ezek voltak. Az élet keletkezése idejében a Földi körülményekre csak sejtéseink vannak. Ahogy arra később utalni fogok, a légkör összetétele mai napig nem teljesen lezárt viták tárgya. Először feltételezték, hogy a légkör erősen redukáló volt (metán (CH4), ammónia (NH3), hidrogén (H2)). Redukáló atmoszférában a szerves anyagok keletkezése valószínűbb (lásd később). További kutatások alapján enyhébben redukáló légkör tűnt valószínűleg (széndioxid (CO2), nitrogén (N2) és víz (H2O) kisebb mennyiségben szén-monoxid (CO) és hidrogén (H2)). Egy friss tanulmány azonban (Tian, Toon, Pavlov & De Sterck A hydrogen-rich early Earth atmosphere. Science 308: ) magas légköri H2 koncentrációt jósol, ami könnyebbé teszi a szerves anyagok keletkezésének megmagyarázását.
13
Molekuláktól az első sejtig
Aminosavak – Fehérjék – Enzimek Nukleotidok – DNS/RNS – Genetika alapjai Lipidek – Membárnok – Felszínek RNS Világ Információ replikáció - Eigen Paradoxona Az élet kódja: Transzláció A genetikai kód eredete Az utolsó közös ős - Az első protosejt
14
Aminosavak – Fehérjék - Enzimek
15
Aminosavak Minden aminosavban van egy amin csoport (NH3) és egy karboxi-csoport (COOH) (az ábrán feketék). Az aminosavak az oldalcsoportjukban térnek el (kékkel szedve). A narancs mezőben nem-poláris, hidrofób (víztaszító) oldalcsoportú aminosavak vannak, a többi aminosav poláris és hirdofil (vízkedvelő). A lila mezőben levő oldalláncok savasak (karboxi-csoport). A kék mezőben levő oldalláncok bázikusak (amin-csoport van az oldalláncban). A genetikai kóddal kódolt aminosavakon kívül számos más aminosav is található a fehérjékben, amelyeknek a legtöbbe a standard aminosavak módosítással jön létre. Ilyenek például az 5-hidroxi-lizin, a 3-hidorxi-prolin, N-formil-metionin, -karboxilglutaminsav.
16
Prebiotikus szintézis
Kiindulási anyagok elérhetőek prebiotikus körülmények között A szintézis útja elképzelhető prebiotikus körülmények között A két feltétel együttese messze nem triviális kihívás a szerves szintetikus vegyészek számára. Egy példa az adenin előállítására úgy kezdődik, hogy: 6-kloropurin és 1,2,3,4-tetrahydro-1-naphthylamine 1:1 izopropanolban levő elegyét reflux hőmérsékleten tartsd 20 óráig. Sem a kiindulási anyagok, sem a szerves oldószeres közeg nem elérhető prebiotikus körülmények között.
17
Miller-Urey kísérlet Aminosavak (glicin, szarkozin, alanin)
Metán (CH4) Ammónia (NH3) Hidrogén (H2) Víz (H2O) Elektromos kisülés A kémiai evolúció kutatásának mérföldköve volt Stanley Miller kísérlete (Stanley L. Miller (1953): Production of amino acids under possible primitive Earth conditions. Science 117: ), amely során kísérletesen állított elő szerves molekulákat prebiotikus körülményeket modellezve. A kísérletben erősen redukáló, metánt, ammóniát és vizet tartalmazó légkört tételezett fel. A rendszert vízzel (ősóceán) kiegészítve, energiaforrásként pedig elektromos kisülést alkalmazva azt a meglepő eredményt kapták, hogy az oldatban aminosavak és más szerves molekulák vannak. Az aminosavak jelenléte igazolt, azonban oligopeptiddé nehezen kapcsolódnak össze és akkor sem biztos, hogy az a mai szervezetekben „megszokott” peptidkötésen keresztül történik. A kísérletben a genetikai kód által kódolt 20 aminosavon kívül számos más aminosav is megjelent. A „természetes” aminosavak messze nem a leggyakoribbak. Továbbá például a lizin, arginin és hisztidin szintézise még nem megoldott. Az előbbiekhez hozzátartozik, hogy mostanában a légkörfizikusok erősen kétségbe vonják egy ősi redukáló légkör jelenlétét. Modelljeik alapján valószínűbb, hogy a légkör főleg CO2, N2 és H2O keveréke volt, kisebb mennyiségű CO és H2 jelenlétével. Így a fenti reakciókhoz a redukált szenet vagy a víz alatti hidrotermális hasadékokból, vulkánokból feltörő metán vagy az ásványi felszíneken végbemenő redoxi folyamatok szolgáltathatták. A hidrotermális hasadékok mellett – bár az óceán kémiai összetétele kedvez a szerves molekulák abiogén szintézisének – a magas hőmérséklet ( C) azonban túlságosan meggyorsítja a bomlást, ami lehetetlenné tesz bizonyos reakcióutakat és a makromolekulák felgombolyodása sem megy megfelelően végbe. Aminosavak (glicin, szarkozin, alanin)
18
Makromolekulák: Fehérjék
Peptid kötés Elsődleges szerkezet (szekvencia) Másodlagos és harmadlagos szerkezet (térszerkezet) Prebiotikus körülmények között nem állnak össze.
19
Miért kellenek enzimek?
Reakciók lassúak (pl. vízkilépés, CO2 megkötés) Gyorsabbnak kell legyen a lebomlásnál Térszerkezeti problémák Reakciók nem specifikusak (rengeteg mellékreakció is végbemegy) Nem sztereospecifikusak, racém keletkezik A kémiából tanultak alapján egy reakció sztöchiometriáját és a reagensek koncentrációját ismerve elképzelésünk lehet, hogy a reakció egyensúlya mely irányba van eltolva (az irreverzibilis reakcióknál extrém módon). Ezek után írjuk fel egy peptidkötés kialakulásának reakcióját: HOOC-R-NH2 + HOOC-R’-NH2 HOOC-R-NH-OC-R’-NH2 + H2O Vizes közegben a H2O koncentrációja igen magas, így a reakció spontán végbemenetele igen valószínűtlen. A térszerkezeti problémák illusztrálására gondoljunk abba bele, hogy sikeres reakció akkor történik, ha a reaktánsok egyszerre ütköznek, s az ütközés minden reaktáns szempontjából megfelelő irányban és helyen történik. Kémiai reakcióban kettőnél több molekula nem vesz részt (nincs hármas ütközést megkívánó elemi reakció), míg enzimreakcióknál ez nem ritka. A nagy molekuláknál véletlenszerű ütközést feltételezve igen valószínűtlen, hogy pont a megfelelő irányban találkozzanak. (Gondolatkísérlet: Van két szabálytalan alakú testünk, mindkettőn van egy-egy kis rész amelyek ha találkoznak a két test összetapad. Milyen gyakran fognak összetapadni, ha egyszerűen összedobom őket?) A reakciók nem specifikusságával kapcsolatban gondoljunk arra, hogy pl. peptidkötés kialakulhat egy aminosav –NH2 csoportja és egy glutaminsav oldalláncbeli karboxi-csoportja között is. Tehát két molekula reakciójának végterméke többféle molekula lehet.
20
Racém, kiralitás Számos molekula királis, azaz két változata van, amely fedésbe nem hozható, hasonlóan a két kezünkhöz. A két enantiomer biológiai hatása eltérő lehet Racém monomerből nem lehet „rendes” polimert előállítani. D-alanin L-alanin Egy adott királis vegyület sztereoizomerei gyakran eltérő hatással vannak az élő szervezetre vagy a környezetre. Szerencsétlen esetben az egyik enantiomer hatása végzetes is lehet, például, az 1960-as években a terhesség kezdeti szakaszában nyugtatóként adott Thalidomid nevű gyógyszer mellékhatásaként több ezer torz csecsemő született. A szerencsétlenséget az okozta, hogy a racemátként forgalomba hozott gyógyszernek az (R) enantiomere nyugtató, de az (S) enantiomere teratogén hatású volt. Továbbá például a természetes L-aszparagin keserű, míg a szintetikus D-aszparagin édes. D-glükóz L-glükóz
21
Enzimek Katalizátor (gyors reakciók) Specifikus (kevés mellékreakció)
Sztereospecifikus Az enzimek ma leginkább fehérjék.
22
Enzimkatalízis Enzimkatalízis mechanizmusa
kulcs / zár mechanizmus indukált illeszkedés Az átmeneti állapotot köti a legjobban A kulcs – zár hasonlat azért is találó, mert az enzim egyrészről rendkívül jól illeszkedik a szubsztráthoz, de más metabolitokhoz nem (vagy sokkal kisebb mértékben). Egyes esetekben, pl. tRNS-aminoacil szintáz a pontosság, és a specificitás rendkívül fontos.
23
Nukleotidok – DNS/RNS – Genetika alapjai
24
Nukleotidok Nukleotid = nukleobázis + ribóz + foszfát
DNS/RNS alkotó elemei AMP A nukleinsavakat felépítő nukleotidokban egy ribóz vagy 2-dezoxiribóz molekulához kapcsolódik egy nukleobázis (adenin, guanin, timin, citozin vagy uracil), illetve egy foszfát csoport. Az RNS-ben a cukorváz ribóz, míg a DNS-ben ennek a 2-es szénatomon OH csoport fosztott változata, a dezoxi ribóz. A nukleotidok mindegyikének létezik dezoxi változata is, annak ellenére, hogy a DNS-ben uracil nincs (illetve az RNS-ben nincs timin). CMP UMP dTMP GMP
25
Cukrok Számos reakcióút kiindulásai Fő energiaforrás Cellulóz
Keményítő, glikogén DNS, RNS lánc váza D-glükóz
26
Formóz reakció A cukrok szintézise könnyen megoldható az úgynevezett formóz reakcióval, amelyben formaldehidből kiindulva egy bonyolult reakcióhálózatban mindenféle cukor jöhet létre, köztük ribóz is. A szintézis autokatalitikus, de a keletkezett cukrok elég instabilak. Továbbá a keletkezett cukrok mind kémiai felépítésüket, mind sztereokémiájukat tekintve elég vegyesek, és a biológiailag fontos cukrok – elsősorban a ribóz – egyáltalán nem fordulnak elő tömegesen az elegyben. Borát felszínen viszont a ribóz stabilizálható, s a reakció ezen irányban elvihető. Butlerov, A C. R. Acad. Sci. 53: Ricardo, et al Borate Minerals Stabilize Ribose A. Science 303: 196
27
Nukleobázisok Pirimidin bázisok Purin bázisok Citozin Uracil Timin
Adenin Guanin
28
Cianid polimerizáció A nukleinsavakban található bázisok közül az adenin, guanin, citozin és uracil abiogén keletkezését megfigyelték (bár a pirimidinek keletkezése egyes szerzők szerint kevéssé meggyőző), viszont a timinét nem. A szintézisben a hidrogén-cianid kulcsvegyület (Oró J. (1960) Synthesis of adenine from ammonium cyanide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2: ), az adenin felfogható HCN polimerként is. Feltehető, hogy a bázisok abiogén szintézise megoldható, de a nukleozidok képzése belőlük problémás. A bázisok és a cukor reakciója purinok esetében nagyon kis mértékben végbemegy, azonban pirimidinek esetében a nukleozidok keletkezése reménytelennek tűnik. A nukleozidok foszforilációja vízmentes közegben jó kitermeléssel megtörténik (bár a megfelelő formájú foszfor jelenléte prebiotikus körülmények között kérdéses), de a foszforiláltság foka változó és mindenféle izomer keletkezik. A nukleotidok nagyon kis mértékben összekapcsolódnak, de a szükséges 3’-5’ foszfodiészter kötés mellett a 2’-5’ és a 5’-5’ is kialakul. Zubay, G. and T. Mui (2001). "Prebiotic synthesis of nucleotides." Origins of Life and Evolution of the Biosphere 31: Orgel, L. E. (2004). "Prebiotic adenine revisited: eutectics and photochemistry." Origins of Life and Evolution of Biospheres 34(4):
29
Genetika kémiai alapjai: Bázispárok
A C-G és a A-U(T) bázispárok hidrogéngidakkal kapcsolódnak Minden esetben egy nagyobb térigényű bázis (G v. A) van szemben egy kisebb térigényű bázissal (C v. U/T) DNS / RNS kettősspirál Megjegyzem, hogy RNS molekulában a kanonikus (G-C és A-U) párokon kívül a G-U pár is kialakul. Az RNS molekulák is képesek kettős spirál kialakítására (egyes helyeken az olvasható, hogy erre csak a DNS képes). Kettős RNS szálú vírusokban található ilyen. Az RNS kettőshélix szerkezete kissé más, mint a DNS hélixxé.
30
Genetika kémiai alapjai: Alternatív bázispárok
Kémiailag sokféle bázis elképzelhető 3 hidrogénhíd alakulhat ki A hidrogénhidak akceptor/donor jellege alapján 8 bázispár képzelhető el (16, ha a méretet is figyelembe vesszük) Alternatív bázispárokért lásd Steven A. Benner (2004) Understanding nucleic acids using synthetic chemistry. Accounts of Chemical Research 34(10):
31
Makromolekulák: Oligonukleotidok
40-50 tagú oligomerek montmorillonit agyag felszíneken előállnak Montmorillonit vulkanikus hamuból keletkezik Perris, J. P Montmorillonite catalysis of mer oligonucleotides: laboratory demonstration of potential steps in the origin of the RNA world. Origins of Life and Evolution of the Biosphere 32, Montmorillonit = Na0.2Ca0.1Al2Si4O10(OH)2(H2O)10
32
Lipidek – Membárnok - Felszínek
33
Lipidek Glicerin + zsírsavak + foszfátcsoport
Hidrofil fej és hidrofób farok Telített vagy telítetlen zsírsavak Prebiotikus körülmények között a hosszú egyenes zsírsavak keletkezése nehézkes. Néhány telített zsírsav: Laurinsav (dodekánsav; C12:0): CH3(CH2)10COOH Mirisztinsav (tetradekánsav; C14:0): CH3(CH2)12COOH Palmitinsav (hexadekánsav; C16:0): CH3(CH2)14COOH Sztearinsav (oktadekánsav; C18:0): CH3(CH2)16COOH Arachidinsav (eikozánsav; C20:0): CH3(CH2)18COOH Néhány telítetlen zsírsav: Alfa-linolénsav, ALA (oktadekatriénsav, C18:3 ω-3): CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH Dokozahexaénsav, DHA (C22:6 ω-3) Eikozapentaénsav, EPA (C20:5 ω-3) Linolsav (oktadecéndiénsav, C18:2 ω-6): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH Arachidonsav, AA (eikozatetraénsav, C20:4 ω-6): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)3COOH Olajsav (oktadecénsav, C18:1 ω-9): CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH Erukasav (dokozénsav, C22:1 ω-9): CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11COOH Eszenciális zsírsavak Az eszenciális zsírsavak többszörösen telítetlen vegyületek, melyek között van omega-6 zsírsav (a linolsav) és omega-3 zsírsav (alfa-linolénsav, ALA) is. Ezek nélkülözhetetlenek az emberi táplálkozásban, mert nem tudja őket a szervezet előállítani. Az emberi test képes szintetizálni telített, vagy omega-9 egyszeresen telítetlen zsírsavakat, de nem képes kettős kötéseket vinni az omega-3 illetve az omega-6 helyekre, ezért az ilyen zsírsavakat kívülről kell pótolni. (Ezért ezeket "F-vitaminnak" is nevezik.)
34
Membrán kialakulás A micellák és membránok autokatalitikusan kialakulnak Ön-összeszerelődés (self-asembly) A sejtmembrán foszfolipidekből áll.
35
Felületek A felületek előnyösek termodinamikailag
Katalitikus aktivitásuk lehet Az ásványi felszínek védhetnek az UV sugárzástól Az ásványi felszínek elősegíthetik a homokiralitást „Szegény ember” kompartmentalizációja
36
Kompartmentalizáció A lipid membrán fontos, mert így elérhető, hogy a belső és a külső környezet eltérjen: Fontos anyagok benntartása (aminosavak, ATP) H+ grádiens pH, sókoncentráció Transzport szükséges! H+ gradiens kialakulása H transzporterek nélkül is lehetséges, lásd Chen I.A. & Szostak J.W. (2004) Membrane growth can generate a transmembrane pH gradient in fatty acid vesicles. PNAS 101:7965
37
Az élet építőkövei A monomerek és makromolekulák prebiotikus szintézise
Funkció Monomer Makromolekula katalizátor (enzim) aminosav fehérje ? információ hordozó nukleotid (bázis, cukor) ? DNS / RNS membrán zsírsavak ? micella, lipid vezikulum
38
In vitro evolúció
39
In vitro evolúció Az evolúció megértése
Alkalmazható (eladható) molekulák kialakítása Genetikai diverzitás előállítása Szelekció Mutáció Szelekció
40
Genetikai diverzitás A diverzitással (hány különböző molekulát tesztelek) növekszik annak a valószínűsége, hogy megtalálom, amire szükségem van Mutáció: Véletlen, célzott, rekombináció Hibára hajlamos PCR (polimerase chain reaction)
41
Szelekció (indirekt) SELEX – Systemic evolution of ligands by exponential enrichment. Ligandok szisztematikus evolúciója exponenciális dúsítással.
42
Mesterséges evolúcióval előállított enzimek
SZINTÉZIS v. VÉLETLENSZERŰ MOLEKULÁK SZELEKCIÓ Affinity chromatography Filter binding Gel mobility shift Imunopercipitation EVOLVÁLÓDOTT MOLEKULA SOKSZOROZÓDÁS mutagenic PCR
43
Katalizátorok szelekciója
Szelekció kötés alapján (indirekt). A átmeneti állapotnak megfelelő (vagy azzal analóg) molekula kötésére szelektálunk. „Azt kapjuk, amire szelektáltunk, nem amit szeretnénk.” Ez nem katalizálásra szelektál
44
Katalizátorok szelekciója II
Közvetlen szelekcióval olyan molekula, kell, ami: Felismeri a szubsztrátot Kialakítja a terméket Gyorsítja a reakciót Többször használható
45
In vitro kompartmentalizáció
46
Módszer Előállítják a génkönyvtárat
Összekeverik gén expressziós masinériával 1010 csepp/ml, 1 gén/csepp A cseppből a termék és a gén sem juthat ki, azok kapcsoltak Oliver J Miller, Kalia Bernath, Jeremy J Agresti, Gil Amitai, Bernard T Kelly, Enrico Mastrobattista, Valérie Taly, Shlomo Magdassi, Dan S Tawfik & Andrew D Griffiths Directed evolution by in vitro compartmentalization. NATURE METHODS 3(7)
47
In vitro kompartmentalizáció
48
Szelekció flouresszencia alapján
A terméknek floureszcensen aktívnak kell lennie
49
Mikrofluidika Apró cseppekben végeznek minden.
A cseppek manipulációja megoldható. Csepp kialakítás Csepp kettőbe vágása / összeolvasztása Cseppek rendezése
50
Ajánlott irodalom John Maynard-Smith és Szathmáry Eörs: Az evolúció nagy lépései. Scientia, Budapest, 1997 Bálint Miklós: Molekuláris biológia I-II. Műszaki könyvkiadó, Budapest, 2000 Ádám Veronika (szerkesztő): Orvosi biokémia. Semmelweis, Budapest, 1996
Hasonló előadás
© 2024 SlidePlayer.hu Inc.
All rights reserved.