Mikrobák mennyiségi meghatározása

Az előadások a következő témára: "Mikrobák mennyiségi meghatározása"— Előadás másolata:

1 Mikrobák mennyiségi meghatározása
Készítette: Nagy Flóra biomérnök, doktoráns

2 Mit ismerünk eddig? Mi a hátránya? Baktériumok túl kicsik
Élesztők, penészgomba spórák és konídiumok számolására alkalmazzák Nem különböztethetők meg az élő és holt sejtek

3 Gyakorlatban hol van szükség élőcsíra-szám meghatározásra?
Élelmiszerek élőcsíra-száma (limit, amit nem szabad átlépni) Élelmiszerromlás 99%-át mikrobák okozzák anyagcsere termékeik degusztáló hatásúak, de lehetnek toxikusak is vagy allergének Milyen nagyságrendben vannak jelen? Ivóvíz

4 Gyakorlatban hol van szükség sejttömeg meghatározásra?
Fermentációs ipar: nem mindegy, hogy mennyi oltóanyagot használunk és a folyamat során is ellenőrizni kell a sejttömeg gyarapodását. Mit termeltethetünk? például: Antibiotikumok B12 vitamin Aminosavak Enzimek Alkohol

5 Hígításos lemezöntéses élőcsíra-szám meghatározás
Lényege: a vizsgálandó közegből kitenyésztjük a feltételezetten ott jelenlevő élő mikrobákat Mindent sterilen kell előkészíteni! Adott közegből hígítási sort kell készíteni (azonos mértékű hígítások egymás után) Alkalmazható a felületi szélesztés is, de mi a belekeveréses módszert használjuk

6

7 Kitenyésztés (inkubálás)
Megjelennek a telepek (kolóniák) Baktériumok: 1-2 nap (húslé agar) Gombák: 3-4 nap (maláta agar) A meghatározás elve: 1 élő sejtből 1 telep fejlődik ki A táptalajon kifejlődött telepeket megszámoljuk, az adott hígítást figyelembe véve visszaszámolunk a kiindulási minta sejtszámára.

8 Mikroba telepek (kolóniák) táptalaj felületén lemezöntés (szélesztés) után
Mikroba keverékek elválasztására is használható ez a módszer (pl. törzs tisztításra, izolálásra)

9 Hibalehetőségek A sejtek összetapadhatnak, nem egyenletesen oszlanak el a hígítás során Az eredmény megadása: db élő sejt/ml helyett: CFU/ml Colony Forming Unit = Telepképző egység Hiba csökkentése: a hígító folyadékban detergens alkalmazása, pl. Tween 80, Na-szulfolaurát

10 Hibalehetőségek Miért követünk el hibát, ha csak a legnagyobb hígításból számolunk? Megfelelő hígítás: között legyen a telepek száma a lemezen Pontos munkához: Párhuzamos mérésekre is szükség van Nem feltétlenül elég három hígítás

11 MPN módszer Most Probable Number =
= legvalószínűbb élőcsíra-szám módszere, más néven: határhígításos eljárás Hígítási sor, mint a hígításos lemezöntésnél Kitenyésztés, de az eredmények meghatározása matematikai statisztikai módszerrel történik, ezért párhuzamosok készítése kötelező Akkor pontos az eredmény, ha az utolsó hígítási tagban már nem voltak élő csírák

12 Fenolvörös pH indikátor
Kulcsszám: 332- x10 = 110 = 1100 320- x100 = 9,3 = 930 200- x1000 = 0,91 = 910 Legvalószínűbb élőcsíra-szám ≈1000 db/ml. Ez egy valószínűségi érték, közelítő, de a gyakorlatban sok esetben elegendő ilyen pontosság.

13

14 Mi a helyzet az ivóvízzel?
Nagy térfogatban kevés élő csíra, de meg kell tudni mérni ennek a számát → membránszűrés + tenyésztés 0,2 µm

15 Mikrobák szaporítása (fermentációs iparok)

16 Példa: sütőélesztő gyártás
18-20 óra alatt éri el a maximális sejttömeget

17 Mennyiségi meghatározás fermentációknál: turbidimetria = zavarosság mérés
Fényelnyelésen alapuló optikai módszer (fotométer) OD= log I0/In Az OD a sejttömeggel arányos dimenzió nélküli szám (Milyen feltétellel lehet megfeleltetni az OD-t sejtszám értéknek?)

18 A gyakorlaton használt élesztőgombák
Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Rhodotorula rubra Trichosporon cutaneum (pszeudomicéliumos)