Enzimológia Amiláz enzimek Dienes Dóra Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék.

Az előadások a következő témára: "Enzimológia Amiláz enzimek Dienes Dóra Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék."— Előadás másolata:

1 Enzimológia Amiláz enzimek Dienes Dóra Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

2 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 2 Keményítő Termelődése  zöld növényekben  legfontosabb emberi szénhidrát-tartalmú táplálékokban: ­rizs ­búza ­kukorica ­burgonya ­manióka (trópusok) Funkciója  energia-tárolás jobb keményítőként, mint glükózként, mert így nem vízoldható (hidegen) és kompaktabb Tárolása  magokban, gyümölcsökben, gumókban, gyökértörzsekben  félkristályos keményítő granulákként (kukorica: kb. 2-30  m, burgonya: 5-100  m)  a kloroplasztban (levél) és az amiloplasztban (gumó, mag, gyökér) Starch

3 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 3 Keményítő Felhasználása  egyiptomiak ­ruhák keményítésére ­lenszálak szövésénél ­papirusz ragasztására  rómaiak ­kozmetikai krémekben ­haj porozására ­szószok sűrítésére  perzsák, indiaiak ­édességekhez (halva)  kínaiak ­papír felületi bevonására  ma ­sűrítő ­Ragasztó, keményítő, textilipar írezés.... Starch

4 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 4 Keményítő Jellemzői  fehér  íztelen  szagtalan  por Felépítése  szénhidrát  poliszacharid, monomere: glükóz  2 féle glükózpolimer: amilóz, amilopektin ­a növényekre jellemző az amilóz/amilopektin arány ۰rozs: 26% amilóz ۰kukorica: 22-28% ۰viaszos tengeri: 1% ۰„high amylose corn”: 80% ۰búza: 17-27% ۰burgonya: 23% ۰banán: 17% Starch http://tonga.usip.edu/gmoyna/biochem341/lecture34.html

5 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 5 Keményítő Amilóz /  -amylose  lineáris   -1,4  10-30%  burgonya DP 1000-6000 kukorica DP 200-1200  redukáló és nem-redukáló vég  gyengén vízoldható, micellákat képez  helikális elrendeződés hajlamos visszaalakulni 2 molekula ütközik  részlegesen dehidratálódik, kinyúlik  hidrogén kötések  asszociálódik  pelyhes csapadék főleg az amilózra jellemző (öreg kenyér morzsásodása)  jóddal  kék szín Starch http://www.warren.usyd.edu.au/bulletin/NO52/ed52art6.htm, http://web.virginia.edu/Heidi/chapter7/chp7.htm

6 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 6 Keményítő Amilopektin / amylopectin  elágazó  láncban  -1,4  elágazás csatlakozás  -1,6  70-90%  elágazás minden 12-30. cukormolekulán  oldallánc: 15-45 monomer  DP:akár >10.000 monomer egység  vízben oldódik, micellákat képez  jóddal  vöröses lila szín Starch http://www.peoriaendocrine.com/diabetes_lecture.htm

7 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 7 Keményítő Lebontása a növény által  lépésről-lépésre monomerré   -1,4 a keményítő-foszforiláz által   -1,6 az  -1,6-glükozidáz által Starch http://web.virginia.edu/Heidi/chapter7/chp7.htm  HPO 4 2- 

8 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 8 Keményítő Lebontása az ember által  kristályosat nehezen  rezisztens keményítő: bontás nélkül megy át az emésztőrendszeren  főzés  emészthetőség  Starch http://www.cheng.cam.ac.uk/research/groups/polymer/RMP/nitin/Starchstructure.html

9 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 9 Keményítő Élelmiszer-felhasználás / Starch as food  élelmiszer szénhidrát  élelmiszer adalékanyag sűrítő, stabilizáló (pudingok, szószok, salátaöntetek, tészták stb.) rezisztens keményítő tablettázó segédanyag  keményítőcukrok (részlegesen / teljesen hidrolizálva) édesítő (pl. üdítőitalokban) ­maltodextrinek (dextróz egyenérték, DE 10-20%) – töltőanyag, sűrítő ­keményítő szörp/szirup (DE 30-70) – édesítő, sűrítő ­dextróz (DE 100) – kereskedelmi glükóz ­Izocukor, HFS (high fructose syrup) (glükózból glükóz-izomerázzal) ­cukoralkoholok (cukrok redukálásával v. fermentációval előállított édesítők) ált. nem v. kevésbé emelik a vércukrot, alacsony kalória-tartalmúak, nem okoznak fogszuvasodást Starch

10 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 10 Keményítő Starch http://www.health.gov/dietaryguidelines/dga95/9DIETGUI.HTM

11 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 11 Keményítő Ipari felhasználás / Industrial applications  papíripar ­felületi enyvezés  szilárdság, felület simasága, fehérség, nyomtathatóság ­hullámpapír ragasztó enyv  enyv-ragasztás ­könyvkötés, tapéta, papírzsák, boríték, üveg-cimke ragasztás  ruha keményítés ­sima, ropogó élek, szennyeződések könnyebb eltávolítása  térkitöltő törékeny áru csomagolásához / „starch-based packing peanuts”  gipszkarton, álmennyezet (ragaszt és erősít)  textilipar ­pamutszálak bevonása szövés előtt (írezés)  hintőpor (talkum helyett)  bioműanyagok  Bioüzemanyag (etanol) Starch

12 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 12 Amilázok Keményítőbontó enzimek  endo-enzim: ­αlfa-amiláz, elfolyósít ۰αlfa-1,4 kötést bont ۰rövidebb láncokat, dextrineket (6-7 monomer) termel, αlfa-határdextrin  exo-enzimek: ­β-amiláz ۰nem-redukáló végről ۰maltózt hasít le, határdextrinek maradnak (elágazó amilopektin miatt) ­γ-amiláz (emberi bélflórában), amiloglükozidáz/glükoamiláz (mikrobák termelik) ۰nem-redukáló végről ۰glükóz egységeket választ le (maltózt csak lassan bontja)  elágazásoknál α-1,6 kötéseket bont  megszünteti az elágazásokat ­növényekben: R-enzim, mikrobákban: pullulanáz, izoamiláz  transzferázok: α-1,4 glikozidkötés bontása után új glikozidkötést hoznak létre Amylases

13 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 13 Amilázok  -amiláz /  -amylase  növények (magok csírázása), állatok, gombák, baktériumok (különböző eredetű enzimek!)  endo-enzim  anomer konfigurációt megtartó („retaining”)  amilózból maltózt, maltotriózt szabadít fel  amilopektinből glükózt, maltózt, dextrineket (  -határdextrinek)  működéséhez Ca 2+ kell  emberi ­nyálban (emberében van, de pl. ló, kutya, macska nyálában nincs amiláz) ۰5 izoenzime ismert ۰élelem lebontása 1. lépés ۰kevés cukor, sok keményítő + nyál és rágás  édesebb ۰nyál  -amilázt a gyomorsav inaktiválja (S-tal együtt részben aktív marad) ۰pH opt. 5,6-6,9 ۰evolúció  több kódoló gén másolat nagyobb arányú keményítő-táplálék fogyasztóknál pl. japánok (sok rizs) 14, pigmeusok (esőerdő vadászat) 6 ­hasnyálmirigyben termelődik Amylases

14 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 14 Amilázok  -amiláz /  -amylase  növények, gombák, baktériumok (Bacillus polymyxa) állatok nem termelik, csak az emésztőrendszer baktériumai  exo-enzim  a nem-redukáló végről  anomer konfigurációt átfordító („inverting”)  β konfigurációjú maltózt képez  stabilitáshoz, aktivitáshoz nem kell Ca 2+  gyümölcsök érésekor:  -amiláz bontás  cukrok  édes íz   magokban csírázás előtt aktív  sörfőzés:  -amiláz  árpa csírázáskor maláta készítése Maltóz  glükóz dimer   -1,4 kötés a két glükóz között  maltáz enzim hidrolizálja glükózzá (egyensúlyi reakció) Amylases

15 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 15 Amilázok  -amiláz – amiloglükozidáz v. glükoamiláz /  -amylase - amyloglucosidase  exo-enzim  amilóz és amilopektin nem-redukáló végéről  -1,4 kötés bontásával glükózt szabadít fel  és  terminális  -1,6 kötést is bont  maltózt csak nagyon lassan bontja  pH opt. 3,0-4,0  mikrobák, elsősorban penészek termelik Aspergillus, Rhisopus  magasabb rendű élőlények bélflóraja Amylases

16 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 16 Amilázok Amylases

17 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 17 Amilázok Maltáz –  -glükozidáz / maltase  αlfa-1,4 (néha αlfa-1,6) glikozid kötések hidrolízise  nem-redukáló végről  maltózt és malto-oligoszachariodokat hidrolizál  termék: αlfa-glükóz  csírázó magvak, burgonya  élesztő, baktériumok, penészgombák  nyál, hasnyálmirigy, vér, bélnedv  emberben 4 féle αlfa-glükozidáz ­maltázok ­szukráz/invertáz (szacharóz) és izomaltáz (izomaltóz: αlfa-1,6) Amylases

18 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 18 Amilázok Elágazásbontó enzimek / debranching enzymes  elágazásoknál αlfa-1,6 kötéseket és  határdextrint bont  izoamiláz csak αlfa-1,6 kötéseket bont, αlfa-1,4-et nem  Pullulanáz (Aerobacter aerogenez termeli) ­pullulánt is bontja pullulán: Pullularia pullulans (ma helyesen: Aureobasidium pullulans, élesztőszerű gomba) tartalék tápanyaga, glükóz polimer, maltotrióz láncokból α-1,6 kötéssel épül fel (α-1,4 és α-1,6 kötés) (pullulán ehető, ízetlen; felhasználása: élelmiszeradalék, kapszula- alapanyag) ­I-es típus: α-1,6 kötéseket vág maltotriózt szabadít fel ­II-es típus: α-1,4 és 1,6 kötéseket is vág (α-amiláz-pullulanáz) maltózt és maltotriózt szabadít fel neopullulanáz: α-1,4 és α-1,6 kötések bontása után transzglikozilációval új α-1,4 és α-1,6 kötést hoz létre Amylases

19 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 19 Amilázok Aktivitásuk mérése Az  -amiláz aktivitás meghatározásának alapjai  a redukáló cukrok mennyiségének növekedése ­keményítő hasítása  dextrinek  kisebb egységek (maltoteteraóz, maltotrióz, maltóz és glükóz) ­új cukor redukáló végek megjelenése ­pl. dinitro-szalicilsavas eljárás: 3,5-dinitro-szalicilsav oxidálja a glükóz aldehid csoportját  3-amino-5-nitro-szalicilsav keletkezik  barnás-sárgás szín, fotometriásan mérhető  a keményítő-jód komplex kék színének intenzitáscsökkenése ­amiláz  kezdetben hosszabb molekulájú dextrinek  jóddal barnásvörös szín ­keményítő teljes lebomlása  az elegy jóddal nem ad színreakciót  keményítő szuszpenzió viszkozitásának változása  mesterséges szubsztrát hidrolízise ­kromofór csoport felszabadulása ­fotometriásan mérhető Amylases

20 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 20 Amilázok Enzim források  baktériumok ­Bacillus ­Streptomyces ­Pseudomonas ­Aerobacter  gombák ­Saccharomyces ­Pullalaria pullulans ­Aspergillus ­Mucor ­Rhisopus Amylases

21 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 21 Amilázok felhasználása Ipari felhasználás / Industrial applications  sütőipar cukrok  élesztő C-forrása  CO 2 amiláz  a pékáruk térfogata , állaga javul  élelmiszeradalék: E 1100 sütőipari állományjavító, stabilizáló ­sertés hasnyálmirigyből ­penészgombák által termelt  textilipar: keményítő bevonat eltávolítása  -amilázzal (írtelenítés), bakteriális amilázok  papíripar  detergensek: bakteriális amilázok  gyógyászati, klinikai alkalmazások ­maltooligoszacharidokból  -amilázzal  tiszta, viszkózus oldat  csecsemők, idősek, betegek táplálása ­nyálmirigy és hasnyálmirigy eredetű rendellenességek indikátorai  sörgyártás: cukor- és alkohol-tartalom beállítása  gyümölcslevek: keményítő-tartalmú gyümölcsök (pl. éretlenül szedett alma)  takarmányok emészthetőségének javítására Industrial applications

22 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 22 Amilázok felhasználása Ipari felhasználás / Industrial applications  kukorica keményítő bontása ­glükóz eá.  -amilázzal, pullulanázzal, amiloglükozidázzal ­izocukor eá.  -amilázzal, amiloglükozidázzal, glükóz-izomerázzal ­HFS eá. (fruktóz 55% ioncserével) ­keményítőszörp eá. (glükóz + dextrinek, DE kb. 40%; édesipar: cukorkák eá.) ­maltóz szirup eá.  -amilázzal Industrial applications

23 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 23 Amilázok felhasználása Glükóz előállítása (lsd. Mezőgazd.Iparok)  kukorica keményítő kinyerése ­a kukoricaszemekből eltávolítják a fehérjetartalmú csírát  állati takarmány/csíraolaj kinyerése ­a csírátlanított szemeket megőrlik ­a keményítőt elkülönítik, tisztítják  előhidrolízis, elfolyósítás ­105-110°C, 5 perc (gélesítés)  <1 DE ­30-40% sz.a. szuszpenzióhoz α-amiláz (B. licheniformis) (+ 20 ppm Ca 2+ ) ­85-95°C, pH 6,0, 1-2 óra  8-18 DE  elcukrosítás ­hígítás  10-20% ­amiloglükozidáz (A. niger) + pullulanáz (Bacillus)  további hidrolízis  glükóz ­60°C, pH 4,5, 48-96 óra  95 DE ­szűrés  termék: 95-98% glükóz Industrial applications

24 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 24 Keményítő Dextróz egyenérték  a keményítő hidrolízis mértéke  elbontott glikozidkötések száma / kezdeti összes [%]  redukáló cukor glükózban kifejezve / teljes szénhidrát mennyiség [%]  a szárazanyag %-ában számított redukálóképesség  a keményítő hány %-a van dextróz (glükóz) formában  DE = 180/(162 x n + 18) x 100 ahol n az átlagos DP glükóz DE 100 maltóz DE 53 maltotrióz DE 36 keményítő DE közel 0 fordítva arányos a polimerizációs fokkal, a maltodextrinek móltömegével Starch

25 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 25 Amilázok felhasználása Industrial applications

26 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 26 Amilázok felhasználása Industrial applications

27 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 27 Amilázok felhasználása Izocukor élőállítása  kukorica keményítőből eá. glükózoldat tisztítása, töményítése (40% sz.a.)  a glükóz-oldatot immobilizált glükóz-izomeráz (xilóz izomeráz) enzimmel feltöltött oszlopokon engedik át (pH 7-8) intracelluláris E  nehéz kinyerni  immobilizálják ­az enzimet Bacillus coagulans baktérium tenyésztésével állítják elő (Novozymes) ­xilóz alapú fermentáció (xilán és xilóz tartalmú búzakorpán)  glükóz-izomeráz (xilóz izomeráz) indukciója ­egyensúlyi reakció  a glükóz egy része fruktózzá izomerizálódik elméletileg max. 50% fruktóz rövidebb reakcióidő  kevesebb melléktermék, de így csak 42% fruktóz  oldatot tisztítása töményítése bepárlással kb. 64%-osra  glükóz és fruktóz kromatográfiás elválasztása  fruktóz bekeverése a 42%-osba  HFCS (high fructose corn syrup) ált 55% fruktóz Industrial applications

28 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 28 Amilázok felhasználása Industrial applications

29 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 29 Amilázok felhasználása Izocukor  glükóz-fruktóz elegy tömény vizes oldata  élelmiszeriparban édesítőszerként  nehezen kristályosodik  erős nedvszívó képességű  megakadályozza a készítmény vízvesztését  Mo.: Szabadegyháza, Hungrana Kft. Európa legnagyobb kukoricafeldolgozója (3.000 t/nap feldolgozási kapacitás) Európa legnagyobb izocukor-kvótája (220.000 t/év) EU termelés 27%-a Industrial applications

30 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 30 Amilázok felhasználása http://en.wikipedia.org/wiki/Fructose Industrial applications

31 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 31 Amilázok felhasználása http://en.wikipedia.org/wiki/Fructose Industrial applications

32 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 32 Amilázok felhasználása http://www.starch.dk/isi/glucose/glucose.asp Keményítő savas / enzimes bontása (Keményítőszörpök)  savas katalízissel (régebben)  28-55 DE  elfolyósítás savval, elcukrosítás amiloglükozidázzal  további lebontás  hőstabil amiláz felfedezése  még több lehetőség a termék összetételére  enzimes, enzimes technológia  porlasztva szárítható termékek (pl. kávékrémporba)  lekvárokban magas cukor-tartalom  mikrobák növekedését gátolja glükóz szirup kedvezőbb mint a szacharóz, mert kevésbé édes  hagyományos felhasználásuk: keménycukorkákban  később: italokban (sör) magas maltóz-tartalmú szirupok felhasználása Industrial applications

33 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 33 Amilázok felhasználása http://www.starch.dk/isi/glucose/glucose.asp Sütőipar  az élesztő erjeszti a cukrokat  alkohol és CO 2 keletkezik  a tészta megkel  az élesztő termel amilázokat, de hosszadalmas (hosszú idejű kelt tészták, savanyú kenyerek)  amiláz hozzáadás  a keményítőszemcséinek lebontása kismolekulájú dextrinekre  az élesztő tovább tudja bontani  gyors  csíráztatott árpa (maláta) vagy gombaeredetű α-amiláz  megnő a tészta térfogata, és javul a bélzet textúrája, rugalmassága + öregedés késleltetése  ! már csekély túladagolásuk ragadós, gumiszerű tésztát eredményez ­α-amiláz hatására keletkező elágazó DP 20-100 maltodextrin miatt ­elágazásbontó enzim, pl. pullulanáz adagolása Industrial applications

34 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 34 Amilázok felhasználása http://www.starch.dk/isi/glucose/glucose.asp Textilipar  a fonalat szövés előtt dextrinnel vagy keményítővel vonják be: írezés  a felületet simává teszik  növelik a szilárdságot  a kész textíliákból amilázzal eltávolítják: írtelenítés  szelektív eltávolítás, a rostok nem sérülnek ­előmosás ۰nedvesítés és a nem keményítő anyagok eltávolítása ­impregnálás az enzimoldattal ۰65-70 / 75-80°C ­keményítőhidrolízis (már az impregnálásnál is) ۰2-16 óra reakcióidő, pH 6-7 (az enzim optimumán), 70-75 / 90-110°C ­utómosás: az enzim és a hidrolízistermékek eltávolítása ۰szintetikus detergens + NaOH, 95-100°C, sav hozzáadás a lúg semlegesítésére  hőtűrő bakteriális amiláz Industrial applications

35 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 35 Amilázok felhasználása http://www.starch.dk/isi/glucose/glucose.asp Papíripar  primer rostok feldolgozásakor (fából kinyert cellulóz) ­felületi kezelésére vagy ragasztóanyagként alacsony viszkozitású, nagy molekula tömegű keményítő-származékokok, dextrin ­ennek előállítása:  -amilázzal  szekunder rostok felhasználásakor (hulladékpapír) ­amilázos kezeléssel a rostok felülete megtisztítható az előző feldolgozás során alkalmazott keményítő alapú segédanyagoktól  a rost–rost kapcsolat fokozódik  erősebb papírokat lehet előállítani  javulnak a nedvesedési tulajdonságok  a rostosítás gyorsul Industrial applications

36 2009Enzimológia – Amiláz enzimek 36 Amilázok felhasználása Juice Industry ► Amylase AG XXL Glucoamylase ► Biocip Membrane Glucoamylase / Polygalacturonase / Cellulase Brewing Industry ► Attenuzyme Glucoamylase ► Ceremix Plus Alpha-amylase / Protease / Betaglucanase ► Cerezyme Sorghum Alpha-amylase / Protease / Betaglucanase Starch industry ► DextrozymePullulanase / Amyloglucosidase ► Liquozyme Alpha-amylase ► Maltogenase Maltogenic amylase ► Termamyl All except Termamyl Classic Alpha-amylase ► Liquozyme Alpha-amylase Baking industry ► Fungamyl Super MA Alpha-amylase / Xylanase ► Novamyl Maltogenic amylase Alcohol Industry ► Saczyme Glucoamylase ► SAN Extra Glucoamylase ► SAN Super 360L Glucoamylase / Alpha-amylase / Protease ► Spirizyme Glucoamylase ► Liquozyme Alpha-amylase ► Novozym 50004 Glucoamylase Textile industry ► Aquazym Alpha-amylase ► Novoprime D 659 Alpha-amylase Detergent industry ► Duramyl Alpha-amylase ► Stainzyme Alpha-amylase ► Termamyl Alpha-amylase Pet food industry ► Extruzyme Pro Alpha-amylase Industrial applications