Laboratory Diagnosis of Fungal Infections Gyula Mestyán 2015 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE.

Az előadások a következő témára: "Laboratory Diagnosis of Fungal Infections Gyula Mestyán 2015 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE."— Előadás másolata:

1 Laboratory Diagnosis of Fungal Infections Gyula Mestyán 2015 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

2 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Contents Relevant characteristic features of fungal agents Laboratory diagnosis Pre-analytical phase Collection, storage and transport of specimen Analytical phase Direct detection of fungal agents from clinical specimen Direct microscopical examination Direct antigen detection Culture Identification Presumptive identification Definitive identification Serology Antimycotic sensitivity tests

3 Relevant characteristic features of fungal agents AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

4 Fungal agents Eukaryotes Slow growing, heterotrophic, aerobic organisms Surface molecules that help the diagnosis and treatment Cell membrane: ergosterol Cell wall: chitin, glucan, mannan Can be grouped on the bases of their morphology, life style and pathogenicity They can be yeasts, moulds, dimorphic fungi saprophytes, commensals and pathogens opportunist and non-opportunist pathogens Some yeasts are part of the normal flora of the oral cavity, the gastrointestinal tract, the vagina and the skin Can also be grouped on the basis of the infectious diseases they can cause AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

5 Reproductive lifecycles (types of spore production) Asexual – „Anamorph” In most of the cases this state can be seen in the diagnostic laboratory Sexual – „Teleomorph” Vegetative phase AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Lifecycles of fungi

6 Asexual reproduction Mitosis Cell with multiple nuclei Cell division „Conidium” (a new cell / a new clone) Blastoconidium Sarjadzás Chlamydoconidium „ Sporulation” Arthroconidium Fragmentation of hyphae „Conidium” Naked on spore bearing structures Sporangioconidium Inside of spore bearing structures http://en.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces http://en.wikipedia.org/wiki/Candida_albicans#/media/ http://en.wikipedia.org/wiki/Candida_albicans#/media/ File:Candida_albicans_2.jpg http://en.wikipedia.org/wiki/Coccidioides_immitis#/media/File:Arthroconidia_ofCoccidioides_immitis_39G0040_lores.jpg http://en.wikipedia.org/wiki/Penicillium#/media/File:Penicillium_Spp..jpg http://en.wikipedia.org/wiki/Sporangium#/media/File:Mature_sporangium_of_a_Mucor_sp._fungus.jpg AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Asexual spores = Conidias

7 Hypha Diameter: 2 -10  m Septate or aseptate Growth Apical (at the tip of hyphae) By the way of branching http://www.medical-labs.net/fungi-hyphae-1522/non-septate-hyphae-coenocytic-hyphae Septate hyphae Aseptate hyphae AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Moulds http://www.medical-labs.net/fungi-hyphae-1522/non-septate-hyphae-coenocytic-hyphae

8 http://en.wikipedia.org/wiki/Zygomycota#/media/File:Zygomycetes_on_solid_media..png Mycelium: „Web” of hyphae Colony of a fungus (thalus) Aerial- and Vegetative mycelium Aerial mycelium Vegetative mycelium Agar surface AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Moulds

9 Shape Round or oval Size 3 - 5 μm Pseudohypha Colonies Resemble to bacterial ones Aerial mycelia are not produced http://www.asm.org/division/c/redesign/images/imagelib/photo/calb1.jpg http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Candida_albicans_(257_12).jpg https://www.flickr.com/photos/microbeworld/sets/72157625392265538/detail AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Yeast Yeast cells Yeast cells and pseudohyphae

10 Two different morphological states 1.Moulds / multiple cells „Environmental state” 2. Yeast / monocellular „Tissue state” Example: Histoplasma capsulatum In the soil or cultured at 25 0 C In the host or cultured at 37 0 C http://pixshark.com/histoplasm-capsulatum-map.htm AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Dimorfic fungi http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Histoplasmosis%285414173501%29.jpg

11 YeastMoldsDimorfic fungi Candida spp.Aspergillus spp.Malassezia furfurPneumocystis jirovecii Cryptococcus neoformansRhizopus spp.Microsporum spp. Mucor spp.Trichophyton spp. Epidermophyton spp. Sporothrix schenkii Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis Penicillium marneffei AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Important fungal pathogens

12 Grouping based on the infections they can cause: I. Skin infections Superficial mycoses Pytiriasis versicolor: Malassezia furfur Dermatophytoses Infections of skin and skin appendages (hair, nail) caused by dermatophytes Microsporum spp., Trichophyton spp., Epidermophyton floccosum Dermatomycosis Skin Infections caused by fungi other than dermatophytes: e.g. Candida spp. Subcutaneous infections e.g. sporotrichosis: Sporothrix schenckii II. Endemic fungal infections Non-opportunistic, dimorfic agents: e.g. Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis III. Opportunist infections Invasive infections of immunologically compromised patients: Invasive and local aspergillosis, mucormycosis: Aspergillus spp. Mucor spp. Cryptococcosis: Cryptococcus neoformans Invasive and local candidiasis: Candida spp. Pneumocystis jirovecii http:// commons.wikimedia.org/wiki/File:HumanSkinDiagram.jp AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Simple grouping of fungi

13 Laboratory diagnosis AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

14 Pre-analytical phase Collection, storage and transport of specimen Analytical phase Direct detection of fungal agents from clinical specimen Direct microscopical examination Direct antigen detection Culture Identification Presumptive identification Definitive identification Serology Antimycotic sensitivity testing AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Diagnosis I.

15 Roles of different medical professionals in the diagnostic process: Physician Clinical diagnosis Collection, storage and transport of specimen Histopathologist Direct detection of fungi from tissue specimen Clinical microbiologist (mycologist) Direct microscopical examination, direct antigen detection, direct molecular examination, culture, identification, antimycotic sensitivity testing, serology AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Diagnosis II.

16 Preanalitical phase: Collection, storage and transport of specimen AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

17 The pre-analytical bases of successful laboratory examination: Correct clinical diagnosis. Properly collected, stored and transported specimen. Pathogens of certain infections can be predicted on the basis of clinical picture The identification of the pathogens could be important even in these cases as well e.g. the sensitivity of the different species causing mucocutaneous candidiasis can be different Laboratory request form written by the physician Should contain all the important clinical and epidemiological information. These pieces of information help the laboratory in planning the examinations and the interpretation of test results: Recent travel, residence abroad, profession, recreational activities, animal contact, …. Underlying diseases predisposing to infections,... AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Specimen collection, storage and transport

18 Steril testtájról és A.) Fungal infections of normally sterile sites Guidelines of specimen collections are similar to the ones established for bacterial infections Pus, tissue specimen An aspirated specimen is better than a specimen taken with the help of a swab Tissue should be taken from the middle and from the margin of the lesion Abscess: aspirated pus and a piece of the abscess wall should be sent B.) Fungal infections of normally sterile sites The guidelines could be different in this regard Preparation of the site of collection: cleaning with 70% alcohol risk of bacterial cantamination ↓ Skin: collection of scrapings from the inflamed margin of the lesion with the help of a blunt scalpel or edge of a glass slide or specimen collected by cellotape stuck and sent on a glass slide Hair: pulling out the hair shaft is better than cutting it / 10-12 pieces are sufficient /, and send them in a clean container or in an envelope Wood-lamp (ultraviolet light) can help in detection of the infected ones The use of sterilizable massaging plate may ease the collection of the infected pieces of hair Nail: a part of the nail of its whole depth or a deep scraping (be continued) AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Specimen collection / I.

19 B.) Fungal infections of normally sterile sites (continuation) Mucous membrane: Scrapings are better than swab specimen Vagina: Diagnosis can be set up on the basis of clinical picture and microscopy findings Culture: if staining cannot be performed, or if the treatment has failed Urine: Contamination with vaginal and perineal flora should be avoided (risk of contamination by Candida spp.↑) Disseminated histoplasmosis, coccidioidosis : cultivation of pathogens could be attempted from the urine Lower respiratory specimen Sputum: 3x consecutive first, early morning specimen sent separetely (not pooled!) In immunosuppressed states: bronchoalveolar lavage (BAL), percutaneous needle biopsy Stool: Suspected invasive infection: colonoscopy + collection of tissue specimen is recommended! Request for stool culture must be be refused - candidas are member of the normal flora In cases of microbiota inbalance we can culture candidas in high number AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Specimen collection / II.

20 Transport The specimen except ones obtained from dermatophytosis, should be sent to the laboratory in sterile container without delay: < 2 hours Delayed transport results in death of fungal pathogens or Results in proliferation of contaminating becteria Storage Environment of of inevitable storage: Specimen from normally sterile site, deep tissue specimen: room temperature Specimen from superficial site: 4 0 C Dermatophytosis Using sterile container for storage and transport is not necessary A clean envelope can be suitable / as the specimen dries out during storage and transportation, thus the contaminating bacteria cannot multiply Do not refrigerate the specimen during storage! The dermatophytes are sensitive to low temperature. AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Storage and transport of specimen

21 Direct detection from clinical specimen AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

22 Microscopical study Antigen detection Molecular examinations Hybridisation Amplification AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direct detection of fungi from clinical specimen

23 Direct microscopy study of specimen „Wet-mount” or fixed smear Rapid and cost effective examinations < 1 hour ( ↔ culture: several days, weeks) But: the sensitivity is low Differentiaton of yeast from molds is possible Result of this examination helps in the design of further laboratory examinations and the empiric antifungal therapy and also in the interpretation of laboratory results: What is the significance of the isolate? Is it a member of the normal flora (e.g. Candida sp.)? Is it an environmental fungus (e.g. Aspergillus sp.)? AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direct microscopy / I.

24 In some cases the type of the infection can be determined: blastoconidia, pseudohyphae candidiasis Septate hyphae, angle of branches: 45 0 aspergillosis Aseptate hyphae, angle of branches: 90 0 mucormycosis Skin, nail, hair: hyphae, arthroconidias dermatophytosis http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3199404_ad-23-S11-g002&req=4 http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Zygomycosis,_mucormycosis_2.jpg http://www.asm.org/division/c/redesign/images/imagelib/photo/cab1.jpg AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direct microscopy / II.

25 In other cases the taxonomic position of the pathogen can determined: CSF / capsuled, yeast cells Cryptococcus neoformans Cyst Pneumocystis jirovecii Intracellular yeast cells Histoplasma capsulatum Thick walled sphaerula with endospores Coccidioides immitis commons.wikimedia.org/wiki/File:Cryptococcus_neoformans_using_a_light_India_ink_staining_preparation_PHIL_3771_lores.jpg http://static.wikidoc.org/f/f7/Pneumocystis_jirovecii.jpg http://library.med.utah.edu/WebPath/TUTORIAL/AIDS/AIDS041.html http://www.publicdomainfiles.com/show_file.php?id=13489018816349 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direct microscopy / III.

26 Utilization of its result Infections of the skin and skin appendages Starting the treatment is often based on the results of direct microscopy examination The length of the culture of dermatophytes is quite long hyPresence of hyphae and arthroconidias often sufficient for indication of treatment Infection of hair: differntiaition of ectothrix / endothrix growth is important The growth type may imply the dermatophyton species Detection of yeast cells, pseudohyphae could be significant (be continued) AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direct microscopy / IV.

27 Utilization of its result (continuation) Respiratory specimen: sputum, BAL Fungus mycelium can be detected in the smear: Colonization? Invasive fungal infection? Prompt notification and consultation are needed Especially, if the patient is immunocompromised ( invasive aspergillosis?) Yeast cells +/- pseudohyphae in the smear May refer to an oropharyngeal colonisation Yeasts rarely cause lower respiratory infections Steril tissue and liquid specimen: e.g. CSF, blood, peritoneal aspirates Presence of fungi should be notified immediately It is always significant in a properly obtained specimen AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direct microscopy / V.

28 Microscopical examinations in the microbiological laboratory „Wet-mount” smear Gram-stain Calcofluor white stain India ink staining Histopathological examination Giemsa staining Gömöri methenamine silver impregnation (GMS) Period acid-Schiff reaction (PAS) Hematoxylin-eosin staining Mucicarmine staining AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direct microscopy / VI.

29 1. Candidiasis pseudhyphae + blastoconidias 2. Dermatophytosis Hyphae and arthroconidias „ectothrix” M. canis „endothrix” T. tonsurans Hair 3. Coccidioidosis sphaerula wit endoconidias KOH treatment KOH + Calcofluor white treatment A. Glass slide smears Wet-mount smear / light -, phase-contrast -, fluorescent microscope Specimens: skin scrapings, nail clippings, hair shafts, mucous membrane, urine, respiratory tract, …. 1.) Examination: clear the specimen with KOH digestion a.) specimen on glass slide + 1 drop 20% KOH + coverslip b.) heat treatment (30 0 C, 20 minutes) / if the specimen contains keratin: + 30’ incubation at room temperature c.) detection in light or phase-contrast microscope 2.) Examination: a.) staining with a mixture of KOH + Calcofluor white (binds to chitin) b.) detection in fluorescent microscope 1. http://en.wikipedia.org/wiki/KOH_test#/media/File:Vaginal_wet_mount_of_candidal_vulvovaginitis.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d9/KOH_trichogram.jpg 2. http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3199404_ad-23-S11-g002&req=4 3. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Spherule_of_Coccidioides_immitis_with_endospores_PHIL_481_lores.jpg AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direct microscopy / VII.

30 B. Glass slide smears Wet mount smear / light microscope India ink staining: Cryptococcus neoformans detection Specimen: CSF, urine Examination: a.) concentration with centrifugation b.) one drop of sediment is mixed with one drop of india ink + coverslip c.) detection in light microscope Positive result: dark background / ghost images of yeast cells of different sizes with unstained halos of capsules Sensitivity: low Rarely performed / The direct Ag detection is a more sensitive test! http://en.wikipedia.org/wiki/Cryptococcus_neoformans#/media/File:Cryptococcus_neoformans_using_a_light_India_ink_staining_preparation_PHIL_3771_lores.jpg AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direct microscopy / VIII.

31 C. Glass slide smears Fixed smears Calcofluor white staining Gram-staining Most of the fungi are Gram positives Giemsa Pneumocystis jirovecii, Histoplasma capsulatum (intracellular yeast cells) AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direct microscopy / IX.

32 Aim: diagnosis of invasive aspergillosis (besides other tests) and monitoring the antifungal treatment of the same infection ELISA: Galactomannan (GM) cellwall antigen Specimen: serum, bronchoalveolar lavage (BAL), (CSF?) Sensitivity: high (97.4%); specificity: good (90.5%) Causes of false positive results: Other fungal and bacterial infections, Antibiotic therapy, Ingestion of certain foods AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direct antigen detection / I.

33 Aim: diagnosis of Cryptococcus neoformans infection Detection of capsule antigen (glucuronoxylomannan) / latex-agglutination test, ELISA Specimen: CSF, serum Sensitivity: high (100%); specificity: high (93-100%) AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direct antigen detection / II.

34 Aim: diagnosis of invasive candidiasis Latex-agglutination test: detection of Candida Ag Specimen: serum Sensitivity: low (13-38%); specificity: good (82-93%) ELISA: detection of Candida mannan Ag (cellwall) Specimen: serum Sensitivity: low (58%); specificity: high (93%) Can be used in combination with antibody or 1,3-beta-D-glucan (BDG) detection: sensitivity: ↑ (83%); specificity: ↓ (86%) Positive result is available several days (about 6 days) earlier than that of the blood culture or than (about 16 days) the time when a positive X-ray changes can be detected AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direct antigen detection / III.

35 Aim: diagnosis of endemic fungal infections Histoplasmosis ELISA: Histoplasma Ag Specimen: serum, urine, BAL Immunocompromised patients: Sensitivity: high (92-94%) ↔ sensitivity of antibody detection: lower (69-84%) Immunocompetent patients: Sensitivity: low (39-80%) ↔ sensitivity of antibody detection: higher (86-100%) The sensitivity is good in the first 3 weeks of the infection (prior to the appearance of antibodies) Coccidioidomycosis ELISA: Coccidioides Ag Specimen: urine Sensitivity: low (71%), specificity: high (99%) AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direct antigen detection / IV.

36 Aim: Diagnosis of aspergillosis, candidiasis ( and Pneumocystis jirovecii infection?) Modified LAL test: 1,3-beta-D-glucan (BDG) („panfungal marker”) detection Not specific: 1,3-beta-D-glucan is a component of the cellwall of several fungal species and plants (wheat, rye, barley) Except: Mucormycetes, Cryptococcus spp., yeast form of Blastomyces Specimen: serum, (CSF?) Detection with Limulus Amoebocyte Lyzates (LAL) and not with antibodies LAL + BDG = form a chromophore / can be detected by spectrophotometer Sensitivity: low (83%), specificity: good (93%) Interpretation: false positive results / e.g. hemodyalisis, immunglobulin preparations AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direct detection of cellwall components

37 Culture AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

38 Fungi can grow on bacterial media The speed of their growth is slower The cell structures, spores and conidias needed for identification develop slower Two types of fungal media should be used for culture: Non-selective and Selective media (if the presence of other microorganism is suspected) Non-selective media: Both the slow and the rapid growing fungi can grow on them Selective media containing cycloheximide: only the slow growers can grow on this type of media AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Culture / I.

39 Choice of media depends on the type of infection, the expected pathogen, the anatomical site of specimen collection (sterile or non-sterile) 1. Non-selective, primer fungal media Brain Heart Infusion Agar (BHI) Calf brain and and beef heart infusate + 5-10% sheep blood Sabouraud Dextrose Agar (SDA) Peptone, dextrose, pH 5.5 Serves primarily for culture of dermatophytes and yeast It yields characteristic colony morphology if subcultured from a nutrient rich medium Sabouraud Brain Heart Infusion Agar (SABHI) All medically important fungi can grow on it Growth factors should be provided to some fungi: e.g. olive oil / Malassesia furfur AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Culture / II.

40 1. Selective media Primary fungal media + antibiotics +/- cycloheximide Antibiotics Penicillin, streptomycin, gentamicin, chloramphenicol, … They inhibit the growth of residential and contaminating bacterial flora Cycloheximide (inhibits the protein synthesis of eukaryotiotic cells) Can inhibit the growth of the rapid growing, cantaminating, environmental fungi Some opportunistic fungal pathogens are sensitive to it (e.g. Aspergillus spp., Candida spp, Cryptococcus neoformans) Their successful growth needs media without cycloheximide When we use a medium with cycloheximide, we also have to use another one without it AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Culture / III.

41 Chrom-agar Differencial medium Selective agar containig chromogenic substrate?? The four most important Candida spp. can produce colonies of distinct colour: C. albicans C. krusei C. tropicalis C. glabrata Advantage of its usage: Direct isolation + parallel presumptive identification The length of laboratory examination can be reduced by one day AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Culture / IV.

42 Types of media of different bloodculture (BC) bottles Detection of fungemia with culturing the blood in a liquid medium or on a solid medium after preparation with lysis-centrifugation Continuous monitoring BC systems using bottles with liquid media Usage of bottles supporting the growth of fungi shortens the time needed for detection Candida spp. can grow well in aerobic, bacterial bottles too The results should be interpretated carefully - False positive result: fungi can contaminate the BC bottles! - False negative result: can occur in cases of infections caused by moulds! Lysis-centrifugation Intracellular dimorphic fungi Yeast, moulds AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Culture / V.

43 Laboratory vessels: Petri dish: Advantage: large surface, easy handling Disadvantage: dry out easily, less safe It is worth preparing thicker agar in it Close it with air-permeable tape Test tube (screw capped) Advantage: safer, dries out slower Disadvantage: small surface, difficult inoculation and subculture AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Culture / VI.

44 Temperature of incubation: Most of the fungi 25 – 30 0 C Candida spp.: sufficient growth at 35-37 0 C, too Dimorphic fungi – at two temperatures: 25 0 C (SDA) – mould form 37 0 C (BHI) – yeast form Length of incubation: 5 days - 8 weeks Superficial mucous membrane infection (candidiasis?): 5 -7 days Histoplasma capsulatum: 6 – 8 weeks AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Culture / VII.

45 Identification AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

46 Aims of identification: Diagnostic Epidemiologic Therapeutic Levels of identification: Presumptive Definitive AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Identification (ID) Tests which help identification: Yeasts Macro- and micromorphology Biochemistry (assimilation, fermentation) Antigen detection Molecular examinations: Hybridisation, amplification MALDI-TOF Moulds Macro- and micromorphology Molecular examinations: Hybridisation, amplification MALDI-TOF

47 Examination of primary cultures On solid media / in positive BC bottles (and in other liquid media) Question: a yeast, a mould, or a dimorphic fungus has grown? Presumptive identification: on the bases of macro- and micromorphology of the culture 1. Examination of macromorphology of colonies grown on solid media Shape, size, consistency, texture, colour of colonies, Colonies should be examined from above and from beneath as well Speed of growth Yeast: creamy colonies resembling bacterial ones Whitish, creme colour: Candida sp? Red: Rhodotorula sp. ? Mould: aery, woolly like appearance Orange: Microsporum sp. ? Grey, black: Aspergillus sp.? Dimorphic fungi: 25 0 C / yeast state; 37 0 C / mould form AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Presumptive identification / I.

48 Yeast Size? Shape? Arrangement? Pseudohypha? Capsule (staining with india ink)? Types of sporulation? Moulds Hyphae Septate? Aseptate? Branching? Angle of branches? Pigmented? Diameter? Arthroconidia? Spore bearing structure Conidia Exo- or endoconidia? Sizes? Colour? Arrangements? 2.a. Micromorphology (microscopy) of colonies grown on solid media AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Presumptive identification / II.

49 Yeast Size? Shape? Arrangement? Pseudohyphae? Capsule (staining with india ink)? Types of sporulation? Mould Hyphae Septate? Aseptate? Branching? Angle of branches? Pigmented? Diameter? Arthroconidia? 2.b. Microscopic examination of micromorphology in liquid media e.g. examination of Gram-stained smear prepared from positive BC bottle Question: a yeast, a mould, or a dimorphic fungus has grown? Then it should be subcultured onto solid a medium AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Presumptive identification / III.

50 Isolates without capsule Subculture on Chrom-agar: e.g. colonies of C. albicans are green Cornmeal agar: for confirmation of production of chlamydoconidium (C. albicans) Germ-tube production Biochemical: rapid tests: e.g. urease, trehalose Isolates with capsule Subculture on Birdseed agar: e.g. Cryptococcus neoformans = brown colonies Biochemical rapid tests: e.g. caffeic acid disc, urease, nitrate AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Presumptive identification of yeasts / I.

51 Production of Germ tube Germ tube: a „tube” protruding laterally from the yeast cell A certain shape of germ tube exclusively characterizes C. albicans (and C. dubliniensis) isolates Test: Small quantity of fungal culture suspended in calf serum Incubation: 37 0 C, 1-2 hours Then the suspension put on a glass slide covered with coverslip should be examined in a microscope AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Presumptive identification of yeasts / II. http://en.wikipedia.org/wiki/Germ_tube

52 Culture under coverslip Chrom-agar Cornmeal agar Bird seed agar The 3-4 most important Candida species can be differentiated on the basis of their colour C. albicans, C.krusei, C. tropicalis (C. glabrata) Production chlamydoconidium exclusively characterizes Candida albicans Brown colonies: Cryptococcus neoformans AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Presumptive identification of yeasts / III. http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail_10652_14827738__-1_0 http://en.wikipedia.org/wiki/Candida_albicans#/media/File:Candida_albicans_2.jpg http://www.ijdr.in/viewimage.asp?img=IndianJDentRes_2012_23_4_490_104956_f12.jpg https://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/Difco_BBL/211132.pdf

53 Examples of presumptive identification of yeasts Candida albicans: Microscope: blastoconidium +, pseudohypha + Germ tube + Chrom-agar: green colonies Cornmeal agar: chlamydoconidium + Candida glabrata: Microscope: blastoconidium (small size) +, pseudohypha + Germ tube - Chrom-agar: light purple Cornmeal agar: chlamydoconidium - Biochemistry: trehalóz + Cryptococcus neoformans India ink staining: capsule + Bird seed agar: brown colonies Biochemistry: caffeic acid disc test + AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Presumptive identification of yeasts / IV.

54 Commercially available biochemical tets Assimilation +/- fermentation tests Manual tests Tests for semi-automatic devices Antigen detection tests Nucleic acid based molecular tests Hybridisation (PNA-FISH) Amplification Protein based molecular tests MALDI-TOF AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Presumptive identification of yeasts / V.

55 With the help of microscopical examination Detectable morphological features: Hyphae Septate? Aseptate? Branching? Angle of branches? Pigmented? Diameter? Arthroconidia? Beyond the others above in a histological section of hollow organ: Spore bearing structures? Conidia? Detectable morphological features: Hyphae Septate? Aseptate? Branching? Angle of branches? Pigmented? Diameter? Arthroconidia? Spore bearing structure Conidia Exo- or endoconidium? Sizes? Colour? Arrangements? AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Presumptive identification of moulds Question: Aspergillus? Mucor? dermatophyton? dimorhic fungus? …… B. Primary culture A. Directly from specimen

56 Performed with the help of microscopical examinations! The primary media cultures are not suitable for definitive identification! As they are rich in nutrients, the growth of hyphae are good, but the sporulation is poor and the fungi frequently cannot grow in pure culture Bases of definitive identification: Pure culture and good sporulation is needed The primary culture should be subcultured onto media with less rich nutrients e.g. Potato Dextrose Agar, Czapek-Dox agar The microscopic examination should be repeated from the new suitable media! AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Definitive identification of moulds

57 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁTKORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Microscopical methods (presumptive and definitive) of identification „Microslide culture” technique: A glassslide is placed onto a pair of glass rods in the bottom of a Petri-dish A small block of agar medium is placed onto the surface of the slide The margin of the agar block should be inoculated with the mould to be studied Finally a coverslip is placed onto the inoculated agar block and be incubated for days Tease mount praparation: A small amount of mould collected with the help of needles is put onto a glass slide in a drop of dye in a way which does not disrupt the structures of the fungus needed for precise identification Then a coverslip should be put onto it Transparency tape preparation: Specimen is collected with the help of a piece of Cellotape and it is put over a drop of a dye placed on a glass slide Staining: Lactophenole-cotton blue AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Methods of identification of moulds

58 Serology AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

59 I. Diagnosis of invasive infections of opportunist fungal pathogens Immunsuppressed state: risk of invasive fungal infection ↑ Aspergillosis, candidiasis, Cryptococcus neoformans infection, …. Serological diagnosis ELISA Interpretation of the results Positive result: Not easy to interpret Valid result? Result of an earlier infection? Significant result: ≥ 4x increase in titer Negative result: False negative results can occur if the patient is in an immunsupressed state AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Serology / detection of antibodies

60 II. Diagnosis of infections caused by endemic, dimorfic fungi Histoplasmosis, coccidioidomycosis, …. These infections can develop in an otherwise healthy, immunocompetent individual Serological diagnosis Complemet-fixation reaction (CFR), Immundiffusion (ID) Interpretation of the results: cross reactions can occur between antigen preparations of different pathogens AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Serology / detection of antibodies

61 Antimycotic sensitivity tests AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

62 I. Drugs for systemic treatment Polyenes - bind to ergosterol e.g. amphotericin B Azoles – inhibit the ergosterol synthesis (lanosterol-14-aphfa-demethylase) Triazoles: e.g. fluconazole, voriconazole, posaconazole Echinocandins – inhibit glucan synthesis Pl. caspofungin, micafungin, anidulafungin 5-Fluorocytosine - antimetabolite: inhibit RNA, DNA, protein synthesis Flucytosine II. Drugs for topical treatment Azoles Imidazoles: e.g. miconazole Allylamines – inhibit ergosterol synthesis (lanosterol-14- alpha-demethylase) e.g. terbinafine, naftifine AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Most important antifungal drugs

63 I. Identification: important for empiric treatment The first important step in determination of sensitivity of an isolate is the identification at species level On the basis of the identification („if we know the name of the fungus”) we can determine its intrinsic resistance and sensitivity, and can judge the possible acquired resistance On the bases of these we can design the empiric therapy taking into consideration the actual treatment guidelines II. Tests for focused therapy These are semiquantitative and quantitative tests, similar to the ones used for determination of antibiotic sensitivity of bacteria AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Antimycotic sensitivity tests