Spin visszhang Elvileg a T2 relaxációs idő meghatározásához elegendő a FID „burkológörbéjének” matematikai analízise, vagy az NMR jel félértékszélességének ismerete, mivel a jel a Mxy, síkban történő csökkenése csak a transzverzális relaxáció következménye. A gyakorlatban azonban az Mxy síkban történő intenzitás csökkenést okoz a Bo tér inhomogenitása is. A fenti módon meghatározott relaxációs paramétert T2*. relaxációs időnek hívják. A T2 valódi értékének meghatározá- sához a spin visszhang jelenségét hasznosítjuk. Az alkalmazott pulzusszekvencia a következő:: A spin visszhang az első, még az FT-NMR feltalálása előtt kifejlesztett pulzusszekvencia. A T2 mérésére ma is alkal- mazzák egy tökéletesített verzióját. (CPMG). Másfelől, a spin visszhang számos további, összetett pulzus- szekvencia építőeleme, ahol a mágnesezetteség Mxy komponensének refókuszálása (újrafókuszálása) szükséges. 90y 180y (or x) tD tD

Spin visszhang   Nézzük meg, mi történik a 90oy pulzus után: tD Visszatérve az <xyz> koordinátákhoz: z y y tD x  x x y fázisvesztés y y tD x x 180y (vagy x) refókuszálás z y  x y

Spin visszhang

Spin visszhang – t2 mérés Ha az NMR jelet közvetlenül a visszhang után detektáljuk, a Fourier transzformált jel intenzitása csak a T2 relaxációs idő függvénye lesz és nem befolyásolja a Bo tér inhomogenitása. Ha a kisérletet különböző tD várakozási idők mellett végezzük el, és az intenzitást a tD függvényében ábrázoljuk, egy exponenciális függvényt kapunk, melynek analízisével a T2 relaxációs időt megkapjuk Mxy(t) = Mo * e - t / T2 Intensity ( ) I(t) = Io * e - t / T2 time

Spin-visszhang hatása egy szingulett jelen Az Mxy mágnesezettségi vektor változása a p/2 pulzus után : tD idő eltelte után a mágnesezettségi vektor eltérül az <xy> síkban egy bizonyos szöggel, weff * tD (f), ahol weff = w - wo. A p (180o) pulzus és a második tD, periódus után visszatér az x tengely irányába és nagysága azonos! Nem lesz fázisvesztés, (fáziseltódás okozta intenzitás- csökkenés), ha a második tD idő után azonnal detektálunk. „Tiszta” abszorpciós jelet kapunk! z y y tD x  x x f y weff y y 180 tD x  x f weff

Spin visszhang és homonukleáris csatolás A spin visszhang gyakorlati mérése során azonban nehéz- ségek léphetnek fel, ha a spektrumot tökéletes fázisban szeretnénk látni. Lássuk be, eddig csak olyan modelleket vizsgáltunk, melyek spektruma szingulett jelekből épültek fel. (Nem volt homonukleáris csatolás) Vegyünk egy 1H jelet, mely csatol egy másik kémiai eltolódású 1H jellel és figyeljük a forgó koordinátarenszerből. A p/2 pulzus után a csatolás következtében tD idő alatt kifejlődik a mágnesezettségi vektor két komponense A vektor két ága megfelel a csatoló partner két spinállapo- tának (jelölés). Következő p pulzus azonban invertálja a populációkat ! z J / 2 y y (a) tD  x x x y (b) J / 2

Spin visszhang és homonukleáris csatolás A p pulzus hatása: tükrözi a vektorokat és megváltoztat- ja a forgásirányokat Igy ahelyett, hogy újrafókuszálná a jel két ágát, az ellenkező forgásirány következtében a dublett (multiplett) ágai a második periódus alatt még inkább szeparálódnak. Amennyiben ekkor detektálunk, tiszta diszperziós jelet kapunk. ( Bár ezt tD idő hossza is befolyásolja) J / 2 J / 2 y y (a) (b) 180y (or x) x x (b) (a) J / 2 J / 2 y tD FID, FT x

Spin visszhang alkalmazások Ha jobban meggondoljuk azonban, egy egyszerű NMR mérés során (90o-os, vagy ennél kisebb pulzus alkalmazása) sem nyerhetünk tiszta abszorpciós jelet. Nem mérhetünk közvetlenül a nagy energiájú impulzus után, mert ekkor a vevőtekercsben mesterséges jelek keletkez- nének, a tekercs „leégne”. Kell egy minimális várakozási idő, az un. ‘pre-akvizíciós várakozási idő’ (DE). Azonban ez alatt az idő alatt a kissé különböző mágnese- zettségi vektorokon a a kémiai eltolódás különbség következ- tében különböző mértékű fáziseltódást észlelünk. Miután ez a fáziskülönbség létrejön a különböző kémiai eltolódású jeleken, a jelek fázisa is eltérő lesz, minden jel abszorpciós és diszperziós fázisú jelek keverékéből fog összeállni. y y ...  x x

Spektrum fázis Más elnevezés szerint ezeket a komponenseket a FID reális, illetve imaginárius (diszperzív) komponenseinek nevezzük. Matematikailag koszinusz, illetve szinuszfüggvénnyel írhatók le. (Emlékezzünk az Euler formulára!) S(w)x = S cos(w) – reális rész S(w)y = S sin(w) – imaginárius rész Számunkra a tiszta abszorpciós fázisú spektrum a kívánatos, ezért a detektor jeléből ezt a reális (koszinusz) és az imaginárius (szinusz) rész kombinációjából nyerjük. A kom- binációs együtthatók a spektrum frekvenciájától függenek. S(w) = S(w)x + [ fo + f1(w) ] * S(w)y az egyenletben fo az úgynevezett zérusrendű fázis, és f1 az un. elsőrendű fázis faktora. Számértéküket rendszerint nem kell meghatározni, a spektrométer programja általában lehetővé teszi manuális beállításukat, illetve automatikus fáziskorrekciós szoftverek is rendelkezésre állnak. Alacsony g érték esetén lehetnek nehézségek.

Heteronukleáris csatolás Hogyan jelentkezik a 13C –NMR spektrumokban? A 13C spektrum jelei felhasadnak az 1H magokkal való csatolás következményeképpen. Az 1JCH csatolási állandók értéke 50 és 250 Hz között váltakozhat A további csatolások a spektrumokat bonyolulttá és áttekinthetetlenné teszik. Az 1H átmeneteket telítve (lecsatolva) ezek az átmenetek megszűnnek, a 13C multiplettek egy vonalként jelentkeznek.: J (Hz) 13C bCbH aCbH 1H 1H bCaH I 13C aCaH bCbH 13C aCbH 1H 1H bCaH aCaH 13C I

Szélessávú protonlecsatolás A szélessávú protonlecsatolás kisérleti módszere a következő: Jellemzők: Egyszerű, egy-pulzus, majd adatgyűjtéses pulzusprogram Kétcsatornás méréstechnika : egy mérő- és egy lecsatoló csatorna alkalmazása. A lecsatolás a teljes mérési idő alatt be van kapcsolva. Következmény: Egyszerű, szingulett jeleket tartalmazó 13C-NMR spektrum A kettősrezonancia folytán szükségszerűen fellépő hetero- nukleáris Overhauser effektus fellépése. Ez 1H-13C magpár esetén pozitív, intenzitás-növekedés jelentkezik (max 2,5- szörös), tehát javul a jel/zaj viszony. 13C: {1H} 1H:

Spin-visszhang és a heteronukleáris csatolás Kombináljuk a spin-visszhang pulzusszekvenciát egy kapuzott lecsatolással: Vizsgáljuk meg a 13C mágnesezettségi vektor viselkedését az adott pulzusszekvencia során! Tekintsük először egy CH (metin) szénatom esetét A p / 2 pulzus után az Mxy vektor a J csatolás hatására „szétválik” a proton spinállapotoknak megfelelő a and b komponensekre A kitérés szöge leírható: f = p * tD * J. 90y 180y (or x) tD tD 13C: {1H} 1H: z y y - J / 2 (a) tD  x x x f y (b) J / 2

Spin visszhang és a heteronukleáris csatolás A tD idő alatt a két vektor „szétnyílik”, az eredő mágne- sezettség csökken (egy pillanatig zérusig, hiszen a két vektor eredője is 0), majd újból nő, de az eredő –x irányba mutat. A 180 fokos, p pulzus invertálja a mágnesezettségi vektorokat (tükrözi az yz síkban) Egy további tD idő múlva (most már az 1H lecsatolást bekap- csolva) a két komponens „találkozik”. A jelintenzitást a tD függvényében ábrázolva: y y y   x x x tD= 1 / 2J tD= 1 / J tD

Spin-visszhang és a heteronukleáris csatolás A jelintenzitás egy koszinuszfüggvény szerint változik tD, függ- vényében 1 / 2J helyen minimumot (zérus), 1 / J helyen maxi- mumot ér el. Egy CH2 (metilén) szénatom jelére hasonló analízist végezve a jelintenzitás – várakozási idő függvényre a következő eredményt kapjuk: Analóg módon, egy CH3 (metil), szénatomra: tD= 1 / 2J tD tD= 1 / J tD= 1 / 2J tD= 1 / J tD

Intenzitásváltozás az összes jelre:

Spin visszhang és a heteronukleáris csatolás Feltételezve, hogy a 1JCH csatolási állandók nem változnak nagyon, a tDértékét 1 / J -nek (1/120-140 Hz) választva, a páros és páratlan multiplicitású jeleket a lecsatolás után ellentétes fázisban kapjuk meg. A kvaterner C jelek a fenti kisérletben mindig fázisban marad- nak, hiszen ők nem mutatnak 1J protoncsatolást. Fázisuk elő- jele alapján tehát meg tudjuk különböztetni a C, CH, CH2 és CH3, atomokhoz tartozó 13C jeleket. Ezt a kisérletet (ami tulaj- donképpen egy kapuzott spin-visszhang),az irodalomban leg- többször csatolt proton tesztnek nevezik (attached proton test, APT). Ugyanezen célból fejleszették ki a DEPT pulzusszekvenciát is. O H 3 5 7 2 4 6 1 6 H O 1,4 150 100 50 0 ppm 5 2,3 7

APT (attached proton test)

Polarizáció átvitel I S S I I S I S S I I S bIbS • • • • aIbS bIaS A jelenséget először egy homonukleáris (1H -1H) esetben próbáljuk vázolni. Az I és S spinek gyengén csatolnak egymással, kémiai eltolódáskülönbségük nagy. A • „gombóc” a nívók betöltöttségének különbségét jelzi. Amennyiben az egyik spin egyik átmenetét pl. : (aIaS - bIaS) szelektíven besugározzuk (telítjük) a két nívó betöltöttsége azonossá válik (ugyanannyi gombóc az 1. és 3. szinten !) bIbS 1,3 2,4 1,2 3,4 4 I S • • aIbS • • bIaS 2 3 S I I S • • • • aIaS 1 bIbS 3,4 4 I S • • aIbS 1,3 2,4 • • • 2 bIaS 3 1,2 S I • • • aIaS 1 I S

Homonukleáris polarizáció átvitel és inverzió Miután megváltoztattuk a nívók benépesítettségét, ennek megfelelően a spektrum vonalainak intenzitása is változni fog! A polarizációt egyik magról a másik magra vittük át, ezért a módszer neve szelektív polarizáció átvitel, angolul selective polarization transfer, rövidítve SPT. Ennek a módszernek egy további variációja is lehetséges: Alkalmazzuk a következő pulzusszekvenciát: Az első pulzus egy kis energiájú, és ezért szelektív p pulzus. Mint tudjuk, a p pulzusok invertálják a populációkat. Esetünkben csak az 1,3 átmenet populációját. 90 180s 3,4 bIbS 4 2,4 I S • • 1,2 aIbS • • • • 2 bIaS 3 S I • • aIaS 1 1,3

SPI : egy alkalmazási példa Egy gyakorlati példa: fahéjsav-etilészter Az a és b olefin protonjeleket szelektíven invertáljuk, jól megfigyelhetők a jelcsoporton belüli intenzitásváltozások a b b a

Heteronukleáris polarizáció átvitel Mivel itt nemcsak polarizáció átvitel, hanem inverzió is létre- jön, a módszert szelektív polarizácó(s) inverziónak (selective population inversion, SPI ) nevezzük. Az SPT és az SPI át- fedett spinrendszerek elemeinek azonosítására alkalmas technika (ld. példa: fahéjsav etilészter). Heteronukleáris vál- tozatuk azonban ennél is sokkal hasznosabb és elterjedtebb. Nézzük meg, hogyan változnak itt az energianívók: A 13C és 1H nívók benépesítettségi aránya a giromágneses tényezők arányának (1: 4) felel meg. Ezekkel arányos a spin- átmenetekhez tartozó jelek intenzitása is. Bár a természetes előfordulás következtében fellépő hátrányt nem tudjuk kikü- szöbölni, felmerül a kérdés, hogy az 1H mag kedvezőbb érzé- kenységét hogyan tudnánk a vele csatoló, de kevésbé érzé- keny 13C mag rezonanciájának mérése során hasznosítani. A módszer lehetőséget teremt más, ún.” ritka”-spinű heteromag ( pl 15N, 29Si, stb) javított érzékenységű mérésére is… 1,2 3,4 13C bCbH 4 • • aCbH 2 1H • • • • 1H 1,3 2,4 bCaH • • • • • 3 13C aCaH 1 I S

Heteronukleáris polarizáció átvitel - SPT Nézzük, hogy viselkedik egy heteronukleáris AX spinrendszer az SPT kisérlet során. Miután telítettük az 1,2 vonalhoz tartozó átmenetet, (ez egy proton-proton átmenet!) vizsgáljuk meg a nívók benépesítettségét: A jelintenzitás a betöltöttség-különbséggel arányos módon fog változni, kétszeres növekedés lesz a másik 1H átmeneten és háromszoros növekedés az egyik 13C átmeneten (3,4). Összegezve: nőtt a 13C intenzitás az eredeti spektrumhoz viszonyítva (ami a célunk volt), abszolút értékben pedig a nye- reség kétszeres! 3,4 13C bCbH • • • 4 2,4 aCbH 2 1H • • • • 1H bCaH • • • 3 1,3 1,2 13C aCaH 1 I S

Heteronukleáris polarizáció átvitel – SPI Végezzünk most egy hasonló SPI kisérletet! Ekkor is az 1,2 átmenet benépesítettségét változtatjuk, de most hajtsunk végre egy szelektív inverziót! (4X több gombóc a felső nívón) Nézzük még egyszer az alsó ábrán az eredeti 13C intenzitásviszonyokat: A heteronukleáris SPI eredménye egy -3, +5 intenzitású dublett lesz, amely abszolút értékben négyszeres intenzitás- növekedést jelent. (jobb ábra) 2,4 13C bCbH • • • • • 4 3,4 aCbH 2 1H • • • • 1H bCaH 3 • • aCaH 13C 1 1,2 I S 1,3 1,3 2,4 I

J-moduláció és polarizáció átvitel A 13C intenzitás növekedés nyereség, de az eddigi módon felvett spektrumok mindig protoncsatoltak, tehát eredendően multiplettek, ráadásul torz (fel-le mutató) jelek. Felmerül a szélessávú protonlecsatolás igénye. Ezt nem tudjuk egy- szerűen megtenni, hiszen az intenzitás növekedésének ere- dete az 1H nívók különbsége. Ez azonban eltűnne, ha az 1H- csatornán szélessávú protonlecsatolást alkalmaznánk. A megoldást az ún. csatolás-moduláció alkalmazása jelenti. Válasszuk tD értékét 1/2J –nek! Ekkor a p/2 pulzus és tD, idő után a 13C mágnesezettségi vektor az eddig tanultak alapján újrafókuszálódik. A következő vektorábrán látjuk ezt. 90 tD 13C: 180s {1H} 1H:

J-moduláció és polarizáció átvitel Most csak a 13C mágnesezettséget vizsgáljuk, hiszen az 1H csatornán mindössze az történt, hogy a p pulzussal egyetlen átmenetet szelektíven invertáltunk. A p/2 13C pulzus után +5 and -3 arányú két komponens jelenik meg az <xy> síkban: Nincs újrafókuszálás A lecsatolás előtt a lecsatolás előtt újrafókuszálás történt y y J/2 tD = 1/2J x x +3 +5 +5 -3

J-moduláció és polarizáció átvitel Ugyanezen viszonyok a lecsatolás után : Nincs újrafókuszálás A lecsatolás előtt a lecsatolás előtt újrafókuszálás történt y y J/2 tD = 1/2J x x {1H lecsatolás} {1H lecsatolás}

Binomiális pulzusok Valójában pulzusszekvenciák v. másnéven pulzusvonatok. Alkalmazási lehetőségeik között szerepel a gerjesztési profil módosítása, azaz bizonyos kémiai eltolódású jelek kívánt megjelenése v. meg nem jelenése. Hatásukat jól lehet vekto- rokkal szemléltetni. A legegyszerűbb binomiális pulzus az 1:1, ahol két, td intervallummal elválasztott, eltérő fázisú p/2 pulzust alkalmazunk. Az w0 frekvenciát válasszuk most az eliminálni kívánt jel kémiai eltolódásával egyenlőnek Az első p/2 pulzus lehajtja a mágnesezettségi vektort az <xy>. síkba. A td, idő eltelte után a jelek/spinek az <xy> síkban pre- cesszálnak, kivéve az eliminálni kívánt kémiai eltolódású jelet, mely az x tengellyel együtt forog továbbra is. 90y tD 90-y z z y Mo 90y tD x x x y y

 A következő p/2 pulzus minden x komponenst visszatérít a z tengely irányába, azaz az elnyomni kívánt teljes jelet, vala- mint az összes többi jel aktuális x komponensét Az eredményül kapott FID csak olyan komponenseket tartal- maz, melyek a vivőfrekvenciától eltérő frekvenciával rezonál- nak. Ezek a vevőtekercs szempontjából fázisban maradnak, de ellentétes előjelűek lesznek attól függően, hogy a vivőfrekven- ciánál nagyobb, vagy kisebb frekvenciájú helyen rezonálnak. A td, időpont megválasztásától függően továbbá „kinullázódnak” azok a jelek is, melyek 1/ (2*td) Hz frekvenciánál jelentkeznek. Megfelelő td kiválasztásnál ez nem zavaró. y y 90-y  x x x y y FID (y) FT x

Az 1:1 pulzust sikeresen alkalmazni lehet nem kívánt nagy jelek (különösen) vízjel elnyomására. Figyeljünk a gerjesztési profilra! A spektrum integrálása viszont nem célravezető. 1H spektrum (50mM cukoroldat 9:1 H2O/D2O oldószerben) 1H spektrum 1:1 pulzus alkalmazásával( td = 200 s):

SPT nagyenergiájú (kemény) pulzusokkal A megismert SPI és SPT módszerek hátránya, hogy a proton- gerjesztés kisenergiájú (és speciális alakú!) pulzusokkal jön létre, melyeket a gyakorlatban nem egyszerű megvalósítani. Előnyösebb lenne helyettük a szokásos „kemény” pulzusok használata. Ilyen célra pulzuskombinációkat alkalmaznak. Az első szelektív azokra az 1H jelekre, melyek frekvenciája azo- nos mindkét p/2 pulzus vivőfrekvenciájával. Ez a változat annak a jelnek a populációját invertálja, amely kémiai eltolódása (pl. egy dublett jel közepe) azonos a pulzu- sok vivőfrekvenciájával. Mindkét esetben tD = 1/2JCH. Vizsgáljuk meg az első pulzus- szekvencia hatását egy vektorábrán 90x 90x tD = 1/2JCH tD 90x 90y tD = 1/2JCH tD

SPT nagyenergiájú (kemény) pulzusokkal A p/2 pulzus után mind az a mind a b vektor a +x tengely mentén helyezkedik el : Az 1/2JCH. idejű várakozás után a gyorsabb (a) a vektor megelőzi a lassabb (b) vektort éppen p radián értékkel. Ekkor alkalmazva a második p/2 pulzust, a és b vektorok a z tengelyre kényszerülnek Ez a pulzusszekvencia a 13C gerjesztéssel együtt alkalmazva intenzitásnövekedést okoz azon a 13C jelen, melyhez az adott proton kapcsolódik. z z tD = 1/2J a a x x b b y y JCH / 2 z z b a 90 x x b y y a

Nem-szelektív polarizáció átvitel Az eddig ismertetett SPT és SPI szelektív módszerek, egy- egy proton jel gerjesztésével/inverziójával valósulnak meg. Előnyös lenne, ha az érzékenységjavulást széles sávban élvez- hetnénk, ehhez az összes heteroatomhoz csatoló protonjelről kellene a polarizáció transzfernek létrejönnie. Egy lehetőség az utóbb ismertetett pulzusszekvenciát kombinálni egy spin- visszhanggal, ahol tD = 1/4JCH A p pulzus és a 2 tD idő alatt újrafókuszálódik a mágnesezett- ségi vektor, minden kémiai eltolódású proton populációja megfordul (invertálódik). A p pulzus az X csatornán felcseréli az a és b vektorokat: Ezután a második p/2 pulzus az a és b vektorokat a z ten- gely irányába kényszeríti. 90 1801H & 18013C 90 tD = 1/4JCH tD tD y y y b 1801H 18013C tD x x x b b a a a

Nem-szelektív polarizáció átvitel - INEPT Az ismertetés elején bemutatott pulzusszekvencia kis módo- sításával született meg az ún. INEPT (Insensitive Nuclei Enhancement by Polarization Transfer) kisérlet, mely egy gyakran használt hatékony módszer az NMR spektrosz- kópiában önmagában és más módszerek építőelemeként is. Az X mag legtöbbször egy „ritka spin”, (pl.13C vagy 15N) me- lyen szeretnénk elérni az intenzitásnövekedést. Az eddigiekhez képest fontos változtatás a „kiolvasó” p/2 pulzus az X csatornán, a célból, hogy detektálható transzver- zális mágnesezettséget hozzon létre. Lényeges, hogy nem egyidejűleg, hanem az 1H csatornán adott p/2 pulzus után alkalmazzuk. INEPT 180 90 X: 90x 180x 90y tD tD 1H:

Refókuszált INEPT [ -y ] A „hagyományos” INEPT kisérletnél +5 és -3 (fel- és lefelé mutató) jelek problémájával találkozunk. Jó lenne a jel két ágát egy szingulett jellé alakítani, de szokásos szélessávú 1H lecsa- tolás ez esetekben nem mindig sikeres. Ekkor a legjobb meg- oldás az, ha az INEPT pulzusszekvenciát kiegészítjük egy újra- fókuszáló pulzuskombinációval a végén és a -y tengely men- tén detektálunk: A szénatom rendűségétől függően a D várakozási időt opti- malizálhatjuk, azaz választhatjuk a következő értékeket: CH : D = 1/4J CH2: D = 1/8J Hogy minden rendű szénatomon (kivéve a kvaternereket!) legyen polarizáció transzfer, a gyakorlatban D  1/7J értéket szoktak alkalmazni. 180 90 180 13C: [ -y ] 90x 180x 90y 180x tD tD D D {1H} 1H:

Refókuszált INEPT A p/2 13C puzus után megnövekedett értékű (+5 & -3) 13C mágnesezettséget észlelünk az <xy> síkban. Az INEPT (és még kedvezőbben, a refókuszált INEPT) kisérlet többféle mérési lehetőséget kínál, elsősorban kis érzékenységű magok (pl. 13C, 15N, 29Si ) rezonanciájának vizsgálata során. - általánosságban javul az érzékenység - „szerkeszthetjük” a spektrumot, mint az APT-nél - kedvezően mérhetjük a heteronukleáris csatolási állandót - optimalizálható több-kötéses csatolási állandóra is A sikeres kisérlethez azonban jól kell előzetesen megbecsülni a csatolás-függő várakozási időket, különben torz fázisok lép- hetnek fel, amelyek nem korrigálhatók a FT után sem. y y b D b a x x a y y a b a 18013C 1801H D x x b

INEPT: jelintenzitás növekedés heteromagok mérése esetén: A multipletteken belüli intenzitás-arány:„megszokott” leírása Pascal-háromszög 1 1 1 1 2 1 1 3 3 1 INEPT esetén ez a Pascal-háromszög a következőképpen módosul: 1 1- 1+ 1-2 2 1+2 1-3 3(1-) 3(1+) 1+3 ahol G a giromágneses tényezők hányadosa

INEPT: jelintenzitás növekedés heteromagok („ritka spinek”) mérése esetén: 31P 13C 29Si 15N 109Rh 2.47 3.98 5.03 9.87 31.8 Az eredmény egy gyakorlati példán (dublett jel)

INEPT : egy gyakorlati példa ”normál” 29Si 1D spektrum: refókuszált 29Si INEPT spectrum: A 2J1H-29Si csatolási állandó kb. ~7 Hz, a g1H / g29Si arány 5.

DEPT fy A DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) pulzusszekvencia előnye azonfelül, hogy lehe- tőséget teremt az eltérő multiplicitású (CH, CH2 és CH3) 13C jelek megkülönböztetésére, a protonok kedvezőbb mágnesezettségi viszonyait is közvetíti a 13C spektrumra. A pulzusszekvencia alkalmazása során fellépő ún. többszö- rös kvantumátmenetek nem teszik lehetővé működésének az eddig alkalmazott mágnesezettségi vektorábrákkal történő magyarázatát. A DEPT kisérlet különböző változatainak összeadásával/kivoná- sával olyan független, mesterséges spektrumokat szerkeszthe- tünk, melyekben a C, CH, CH2, és CH3 jelek külön-külön spekt- rumban jelennek meg 90x 180x 13C: 90x 180x fy tD tD tD {1H} 1H:

DEPT Amennyiben a különböző multiplicitású C jelek intenzitását a f pulzusszög függvényében ábrázoljuk: p/4 p/2 3p/2 CH CH2 CH3

DEPT kisérlet különböző f szögekkel Alkalmazás példa: pulegon f = p / 2 (90)esetében a CH szénatomok jelennek meg f = 3p / 4 (135) CH, esetében megkülönböztethetjük CH, CH2 és CH3 szénatomokat.

A DEPT módszer változatai

APT és DEPT összehasonlítása DEPT spektrumszerkesztés

Larmor frekvencia 11.7 T térerő esetén (MHz) Néhány fontos NMR- aktív mag Név Spin Természetes előfordulás (%) Relatív érzékenység Larmor frekvencia 11.7 T térerő esetén (MHz) 1H 1/2 99.98 1 500.13 13C 1.07 1.76*10-4 125.75 2H 0.015 1.45*10-6 76.77 31P 100 6.6*10-2 161.97 23Na 3/2 9.25*10-2 132.29 19F 8.22*10-1 470.59 10B 3 19.58 3.89*10-3 53.73 11B 8.42 1.33*10-1 160.46 14N 99.63 1.00*10-3 36.14 15N 0.37 3.85*10-6 50,69 17O 5/2 0.037 1.08*10-5 67.80 29Si 4.7 3.68*10-4 99.36 195Pt 33.8 3.36*10-3 107,51

Heteromagok NMR spektroszkópiája: 2H Kémiai eltolódástartomány: azonos, mint az 1H Csatolás: JHD /JHH = gD/gH Mérés: szélessávú protonlecsatolás mellett (esetleg a lecsatolás „kapuzott”) Mérési nehézségek: műszer stabilizálás – külső lock (pl 19F)

Heteromagok NMR spektroszkópiája: 2H A deutérium csatolásainak megjelenése

HO-CH2-CH2D (I) HO-CHD-CH3 (II) DO-CH2-CH3 (III) R = 3 * II / I C = (I + II) / (S * k)

Heteromagok NMR spektroszkópiája: 23Na

Heteromagok NMR spektroszkópiája: 23Na

Nátrium koncentráció viszonyok változása sejtekben és környezetükben PPP DOTP TTHA

Heteronukleáris NMR: 31P

Heteronukleáris NMR: 31P 31P spektrum mérése: szélessávú protonlecsatolás mellett. Nehézségek: - a 31P-1H csatolási állandó jóval nagyobb lehet, mint a 13C-1H csatolási állandó (ca. 600 Hz)

Heteronukleáris NMR: 31P 1H csatolt 31P spektrum {1H} lecsatolt 31P spektrum

Heteronukleáris NMR: 31P

Heteronukleáris NMR: 31P

31P lecsatolás nehézségei : nagy csatolási állandó, több P esetén nagy sávszélesség

„Kvázi” in vivo 31P-NMR egyidejű 23Na mérés

Study of dynamic processes by NMR So far we have talked about techniques and experiments used to study ‘frozen’ molecules by NMR. We have made no mention whatsoever about the time frame of the NMR measurement. What if we have something in the tube that is suffering some sort of dynamic process? This could be a chemical reaction, conformational equilibrium, exchange between the bound and free states of a ligand/protein complex, etc., etc: We need to analyze a bit how the rate of the process is when compared to the speed of what we are using to measure it. Believe it or not, it is all a matter of the uncertainty principle. We will try to explain this by presenting a simple process. Things valid for it will be more or less valid for all other dynamic processes studied by NMR, including ligand binding of drugs to proteins. Kex Conformational equilibrium Chemical equilibrium KB 63

Measurement of rate constants Say that the process we are looking at is the inversion of NN-dimethylformamide: We know that we have an exchange of the red and blue methyls due to the double bond character of the amide bond. Both methyls are chemically and magnetically different, so an NMR spectrum of DMF shows two different methyl signals: This means that the exchange rate between the two sites is long enough if we compare it with the relative frequency difference between the resonances of the two species (red and blue): 1 1 Rate (s) >> or dr - db Dd 64

Measurement of rate constants (continued) Lets now start increasing the temperature. Since the rate depends on the DG of the inversion, and the DG is affected by T, higher temperature will make things go faster. What we see in the NMR looks like this: At a certain temperature, called the coalecense temperature, the rate of the exchange between the two species becomes comparable to the difference in chemical shifts of the sites: Past this point, the NMR measurement cannot distinguish between things in either site, because things are exchanging faster than the difference in relative frequencies. T TC 1 1 Rate (s)  or dr - db Dd 65

T TC 1 1 Rate (s)  or dr - db Dd 66

Measurement of rate constants (…) We see that there are two regions as we increase go higher in temperature, called slow exchange and fast exchange: Now, since we can estimate the temperature at which we have the transition taking place, we can get thermodynamic and kinetic data for the exchange process taking place. If we did a very detail study, we see that we have to take into account the populations of both sites (one site may be slightly favored over the other energetically), as well as the peak shape. As we’ve been doing with other mathematical derivations, we will use approximate results, which for the time being serve out purposes. We will focus on the case of equally populated sites (equal energies), which means that the energy difference will be only from the exchange process being studied. Dd * Rate > 1 Slow exchange Dd * Rate = 1 Transition (TC) Dd * Rate < 1 Fast exchange 68

DG‡ = R * TC* [ 22.96 + ln ( TC / Dn ) ] Measurement of rate constants (…) From the Dd value (in Hz) at the limit of slow exchange we estimate the rate constant at the coalecense temperature: Here we are using frequencies in radians, and that’s why we need the p factor. This equation has many simplifications (we will never now if the lowest temperature is truly slow exchange, and we don’t consider linewidths). However it works pretty OK. Since we have the coalecense temperature, we can calculate the DG‡ of the process using a similar fudged relationship: If we do not take into account any entropic contributions to the DG‡, we in principle calculate the rate of the reaction at any other temperature from this data alone. With NMR we can measure rates from 10-2 to 108 s-1. Kex = p * Dn / √2 = 2.22 * Dn DG‡ = R * TC* [ 22.96 + ln ( TC / Dn ) ] 69

An example of conformational equilibrium As part of my taxol stuff I tried to make a constrained side chain analog, to evaluate if imposing rigidity on the molecule improved or deteriorated activity. I decided to make a biphenyl system, which proved to be a really bad choice, because if I had read, I would have known that these things behave funny. I made it (it took me a looooooooong time), and when I finally took the 1H, I saw that the thing I made had two possible conformations due to the restricted rotation of the biphenyl: I could see all the signals doubled, (but I had one thing by TLC), so there was some funky business going on. We came to the conclusion that we had a slow equilibrium (slower than NMR) occurring for this sample in DMSO… 70

An example (continued) Since I had worked like a mule for 4 months, I refused to leave it at that. Also, we were concerned about having two things. If this was an equilibrium, temperature should affect the rate, so we did a temperature study: We found that a) there was coalecense of the two sets of signals at ~80oC, and b) that the process was reversible. 71

An example (…) In this case, the ring inversion is not alone, and we have other conformational changes upon inversion. There may also be H-bond making and breaking, so its hard to pick a pair of protons to calculate the barrier for rotation. I never did it in Texas, so I’m doing it here. If we pick a pair of aromatic protons (after all, the aromatic rings are flipping), we get a dn of 0.04 ppm, or 20 Hz (at 500 MHz): If we apply the approximate formula for the DG‡ (considering that coalecense occurs at 85oC (358 K), we get: Not that off the mark… 20 Hz Kex = 44.4 s-1 DG‡ ~ 18.5 Kcal/mol 72

Magnetic field gradients and diffusion So far all our discussions have dealt with ‘perfect’ magnetic fields (i.e., homogeneous Bo). We obviously want this for good resolution and sensitivity. However, creating a gradient of known characteristics on Bo can be extremely useful. A gradient in the magnetic field results in different Bs. If we just consider a linear variation along the z axis (i.e., a z- gradient, Gz) and a sample of water, what we’ll see is that water molecules at different positions along z will have different s (because   Bo+ Gz)): Notice that the signal is proportional to ‘sample mass’… Bo Bo+ Gz  

Magnetic field gradients (continued) So, how is this useful? For starters, we can get an image of the sample if we apply the gradient during acquisition. Since spins at different positions along the tube have different s, we get a ‘continuous’ spectrum that parallels the shape of the container (MRI). In other words, with a linear gradient the spins end up spatially encoded. This means that we ‘know’ to what part of the tube (or “arm”) the spin belongs based on the gradients that we applied. Add contrast based on different relaxation times for different tissue, and you get MRI (sort’a). In addition, by combining gradients of different signs we can spatially encode the nuclei, allow them to ‘evolve’ (times, pulses, etc.), and then decode them. Spins that did (or did not) behave as expected during the evolution period will (will not) show in the spectrum… w (Hz) Bo+ Gz

Gradients and diffusion Which brings us to diffusion measurements. Measuring self-diffusion coefficients (Ds) is extremely important in chemistry and biology. It tells us about interactions between molecules, their motions, etc., etc. Pulse-field gradient NMR is ideal to measure the diffusion of particles bearing NMR-active nuclei. The most basic technique involves combining a spin-echo with two gradients of opposite sign and length d separated by a delay D: We have to analyze how the spin-echo will look like under the effect of the encoding and decoding gradients for nuclei that diffuse at different rates. Keep in mind that the gradient will make things move faster/slower in the rotating frame (i.e., change their ‘chemical shift). 90y 180y [y] D/2 D/2 1H: D Gradient channel: d d

Gradients and diffusion (continued) In this case, since the nuclei moves away from where it was, the decoding gradient has a completely different effect (i.e., things will dephase further). Therefore, the signal intensity will be greatly attenuated. The end results is that the the faster the nuclei diffuse, the smaller their signals will be in the spectrum. By selecting the values of G, d, and D we can ‘fine-tune’ the experiment for species with self-diffusivities going down to 10-12 m2s-1 (this is for our Bruker). y y G(d) 180 D/2 x x y y -G(d) D/2 x x

[–g2G2d2D x (D – d / 3)] Gradients and diffusion (continued) In order to calculate the value of D, we repeat the experiment for several values of G while maintaining d and D constant. The resulting intensity versus gradient plot follows the following relationship, and a fit gives D. Some real data for [Emim][OAc] at 40 oC : I(G) = Io x e [–g2G2d2D x (D – d / 3)]