Öröklött thrombophiliák laboratóriumi diagnosztikája Bereczky Zsuzsanna DEOEC, Klinikai Kutató Központ

Mi utal thrombophiliára? 1/ Mélyvénás thrombosis relatíve fiatal korban (<50-55 év) 2/ Recurrens thrombosis 3/ Thrombosis szokatlan helyen (nem alsó végtagon) 4/ Familiáris előfordulás (öröklött thrombophilia)

Öröklött thrombophiliák okai Az inhibitor rendszer deficienciája Antitrombin III deficiencia Heparin kofaktor II deficiencia? Az inaktivátor rendszer deficienciája Protein C, Protein S deficiencia Fokozott faktor szint vagy abnormális faktorok Aktivált protein C resisztencia (FV Leiden) Protrombin 20210A allél Dysfibrinogenaemia thrombosissal Magas FVIII, FIX, FXI szint ? Csökkent fibrinolítikus aktivitás Plazminogén deficiencia, FXII hiány? Egyéb Homocystinuria (hyperhomocysteinaemia)

A vénás thrombosisokra való fokozott hajlam genetikai okainak relatív gyakorisága 40% 35% 10% 5% APC rezisztencia - FV Leiden Egyéb ismert AT III, protein C, protein S def. Protrombin 20210 A allél Ismeretlen

Antitrombin III deficiencia 1965. Egeberg et al. Öröklődés: AD (II/HBS: AR) Gyakoriság: 1:2000-5000 (1:250-500) Thrombophiliák hátterében : 3-5% Thrombosis kockázat: 8-10x (LETS) Referencia taromány: 75-120% Plazma szint heterozig.: 30%-70% Tünetek (heterozigóták): MVT, PE, MeVT, CVT (ált. pubertas kor után) Homozigóta nincs: letális mutációk (I. típus és súlyos II. típus)

Öröklött antitrombin III hiány típusai I. Típus: Alacsony antitrombin aktivitás és antigén Okai: >80 mutáció (nagy deléciók, kisebb deléciók és inszerciók, egy nukleotid szubsztitúció) II. Típus: Abnormális antitrombin variáns RS, az aktív centrumra gyakorolt hatás HBS, a heparin kötő helyre gyakorolt hatás (kisebb a VTE kockázat) PE, pleiotróp (multiplex) hatás: kevés, abnormál AT szintézise (402-429 a.savak)

II. típusú AT deficienciát okozó pontmutációk Bauer K A. 2003

deficiencia diagnosztikája Antitrombin III deficiencia diagnosztikája Diagnózis: funkcionális (általában kromogén) teszt Klasszifikáció: antigén meghatározás 1 típus: csökkent aktivitás és antigén 2 típus: abnormális molekula- csökkent aktivitás, normál antigén

AT III meghatározás I. Funkcionális tesztek II. Antigén meghatározás 1. Alvadási tesztek módosított trombin idő meghatározás (defibrinált plazma, heparin kofaktor II és FDP zavar) 2. Kromogén tesztek Antitrombin aktivitás meghatározás Anti-faktor Xa teszt Heparin jelenlétében: “heparin kofaktor aktivitás” Heparin hiányában: “progresszív aktivitás” II. Antigén meghatározás Turbidimetria, nefelometria (ELISA, RIA, radiális immundiffúzió) III. Heparin kötés vizsgálata: 2DCIE

Heparin kofaktor aktivitás meghatározás kromogén szubsztráttal Heparin + AT III  Heparin - AT III komplex trombin (feleslegben)  Heparin - AT III + ————————— FXa (feleslegben)   Heparin - AT III - trombin + trombin (maradék) —————————————————————  Heparin - AT III - FXa + FXa (maradék) trombin R-pNA ———— R-COOH + pNA FXa Rtr CBZ-Gly-Pro-Arg Rxa: Bz-IIe-Glu-Gly-Arg Ajánlás: FIIa alapú teszt esetén bovin trombin használata (HCFII!) de inkább FXa alapú teszt

Öröklött antitrombin III hiány típusai Típus Antigén Heparin kofaktor Progresszív Heparin aktivitás aktivitás affinitás* Ia    Normál Ib    Csökkent IIa Normál   Csökkent IIb Normál   Normál v. emelkedett IIc# Normál  Normál Csökkent * Heparin kötő teszttel meghatározva # IIc típusú heterozigóták: nincs (kisebb) fokozott thrombosis rizkó, öröklődésmenet AR

Fiziológiás/pathológiás állapotok melyek befolyásolják az AT III szintet újszülött kor, koraszülöttek terhesség 3. trimeszter, preeclampsia OAC, ösztrogén terápia májbetegség fehérje vesztő állapotok (enteropathiák, nephrosis) heparin terápia (15-30%)- fokozott clearance L-Aszparagináz terápia (ALL) DIC, MVT, PE

Protein C deficiencia 1981. Griffin et al. Öröklődés: AD/AR Gyakoriság: 1:16,000/1:300 Thrombophiliák hátterében: 3-5% Thrombosis kockázat: 7x (LETS) Referencia tartomány: 70-140% Plazma szint heterozigótákban: 14%-70% Tünetek heterozigótákban MVT, PE, MeVT, CVT (AD forma): kumarin necrosis Homozigótákban < 5%, Neonatalis purpura (AD forma): fulminans, CVT

Protein C meghatározás I. Funkcionális teszt 1. Alvadási teszt 2. Kromogén teszt II. Antigén meghatározás ELISA

Abszorpciós technikák: időigényes, PC kinyerés nem 100% (des--karboxi formánál különösen nem jó) Protac: Agkistrodon contortrix mérge, Ca2+- független, plazma proteázok nem inaktiválják Ajánlás: alvadási teszt jobb szűrőteszt

Protein C alvadási teszt Beteg plazma hígítás Kontroll plazma hígítás Protein C deficiens plazma APTI reagens (PL + aktivátor) Protac Inkubáció 240 sec, 37oC-on Alvadás indítása: 25 mM CaCl2-vel

Protein C hiány típusai I. Normál PC molekula csökkent szintézise PC antigén, PC aktivitás II. Kóros PC molekula a. PC antigén normál, PC aktivitás alvadás, kromogén b. PC antigén normál, PC aktivitás alvadás, kromogén norm (a PS és PL kötés zavara- Gla-domén mutációk)

Fiziológiás/pathológiás állapotok melyek befolyásolják a PC szintet újszülöttkor, koraszülöttek májbetegség sepsis, DIC, akut thrombosis, PE ARDS postoperativ állapotok kemoterapeutikumok OAC kumarin terápia!!! terhesség, ösztrogének, nephrosis, ISZB heparin (poibrén) magas titerű LA (APTI reagens)

Protein S deficiencia Öröklésmenet: AD Gyakoriság: 1:16,000 1984, Comp et al. Öröklésmenet: AD Gyakoriság: 1:16,000 A thrombophilia oka: 3-5% Plazma szint 30%-65% totál heterozigótákban: 15%-50% szabad A heterozigóták tünetei: MVT (szokatlan lokal.), PE, Sync. necr. arteriás thrombosisok thrombophlebitis Homozigóták: < 5%, MVT, PE neonatalis purpura fulminans

Protein S hiány típusai I. Normál PS molekula csökkent szintézise csökkent szabad (és totál) PS antigén csökkent PS aktivitás II. Kóros PS molekula normál szabad (és totál) PS antigén csökkent PS aktivitás

Protein S meghatározás lehetőségei I. Antigén meghatározás 1. Totál PS (ELISA, immunturbidimetria) 2. Szabad PS (ELISA, ligand-kötő assay, immunturbidimetria) II. Funkcionális teszt - szabad PS aktivitását méri

Szabad protein S antigén meghatározás 1/ Két dimenziós immunelektroforézis 2/ C4bBP-PS komplex eltávolítása PEG precipitációval, a felülúszóban maradó szabad PS meghatározása ELISA-val 3/ Csak a szabad PS-t felismerő két monoklonális antitest segítségével egy lépéses szendvics ELISA 4/ Ligand kötő assay ELISA lemezhez kötött C4bBP-t használnak a szabad PS megkötésére 5/ Immunoturbidimetriás meghatározás, a szabad formát felismerő antitesttel

Protein S funkcionális teszt- APC kofaktor funkció Beteg plazma hígítás Referencia/Kontroll plazma hígítás Protein S deficiens plazma APTI reagens (PL + aktivátor)-FXa/Tromboplasztin (PI)/RVV (Faktor Va) Aktivált Protein C 240 sec inkubáció 37oC-on 25 mM CaCl2 Az alvadási idő megnyúlás mértéke arányos a vizsgálandó minta protein S aktivitásával. Ismert protein S aktivitású kalibrátor plazma alkalmazásával a másodpercben kapott alvadási idők protein S aktivitás értékekké konvertálhatók.

A protein S deficiencia diagnosztikáját nehezítő tényezők Analitikai (metodikai), preanalitikai problémák: FVIII, LA, FV Leiden (II. típus!), heparin 2. PS szintet befolyásoló tényezők: PS csökkenés deficiencia nélkül Szerzett PS deficienciák Öröklött PS deficienciák: a genetikai diagnosztika problémái

A protein S szintjét befolyásoló (fiziológiás) tényezők nem, életkor, hormonális státusz, hormonpótlás, oralis anticoncipiensek (a C4bBP is), terhesség (2. trimeszterben akár 45% alá is csökkenhet) életkor 1 nap FT PT 1 hó 6 hó felnőtt 36 (24-48) 26 (14-38) 63 (48-78) 56 (22-90) 87 (71-103) 82 (44-120) 92 (60-124) PS szint (%) Andrew, 1987, 1988, 1992 FT: érett úsz., PT: koraszülött

Szerzett PS deficiencia Kumarin terápia, K-vitamin def. májbetegség Nephrosis C4bBP> PS:Ag Gyulladás C4bBP Szerzett PS deficiencia MM, tu. L-aszparagináz Varicella, HIV APS SLE DIC, Akut thrombosis

Öröklött PS deficiencia genetikai diagnosztikája A genetikai defektus jelenlétével legjobban a szPS korrelál (II. típus nagyon ritka) Problémák: nagy gén, ezért a diagnosztika időigényes, pszeudo-gén miatt a PCR primerek tervezése nehézkes, a deficiencia hátterében nem mindig található meg a mutáció (intragén polimorf markerekkel, Southern blottal nagyobb gén defektusok azonosítása) Eddig több mint 150 különböző mutációt írtak le PROS1 adatbázis Polimorfizmusok: Pro626 CCA-CCG, intronK C54T, alternatív poliA szekvenciák, Ser460Pro: PS Heerlen- fokozott affinitás C4bBP-hez

Protein S gén-exon 9 A B

Protein S mutációs adatbázis www.isth.org Mutáció típusa Előfordulási gyakoriság Nukleotid szubsztitúció 80% Misszensz mutáció 60% Nonszensz mutáció 23% Splice site mutáció 17% Inszerciók/deléciók 20% Nagy deléciók <1% Homozigóta vagy összetett heterozigóta: az esetek 3%-a II. típusú deficiencia: az esetek 5%-a

A faktor V aktivációja és inaktivációja Arg506 Aktivácó: limitált proteolízis trombinnal A1 A2 B A3 C2 C1 Arg709 Arg1018 Arg1545 Ca2+ Inaktiváció: proteolítikus hasítás aktivált Protein C-vel (első hasítási hely Arg 506-nál) Arg306 Arg679

APC rezisztencia: 1993. Dahlback Az APC rezisztencia kimutatása: funkcionális alvadási teszt A Leiden mutáció kimutatása: molekuláris genetikai módszerek Az öröklött APC rezisztenciáért szinte kizárólag a Leiden mutáció a felelős. Thrombosis kockázata heterozigótákban: 5-7x homozigótákban: 80x FVL+OAC: 35x

Az APC rezisztencia funkcionális meghatározásának elve A plazmához hozzáadott aktivált protein C (APC) proteolítikusan degradálja az aktív V-ös és VIII-as faktorokat, ami az e két faktort (vagy egyiket) magában foglaló alvadási tesztben alvadási idő megnyúlást eredményez. Ha az V-ös (esetleg VIII-as) faktor APC által történő degradációja lassúbb a faktorban bekövetkezett kóros strukturális változás miatt, APC rezisztenciáról beszélünk. Ez esetben az alvadási idő APC hatására történő megnyúlása lényegesen kisebb. II. generációs tesztek! (FVIII, LA, heparin, kumarinok)

Referencia tartomány: ≥ 2.0 lo t AP C -R ( V. ) a kt ivá lt Pro e in C r z i sz n m eg h atá r ozásá vi o D IA G N OS Z T IK A I RE NS K ÉS L kk s zá m: 45620-2 - 99 80 is ze l és : 20/ 4 v gá at oz +A PC –A P C E l ő híg ít o tt p az m a * , 10 ml A PT I r e agen s ( 1. ) 37°C - on 5 p rc i g nkubá lj uk Ka c u k id da t 4. unkao *1:5 hígítás FV hiányos plazmával APTI APC+CaCl2 APC-R = APTI CaCl2 Referencia tartomány: ≥ 2.0

Leiden mutációra vad típusú, heterozigóta és homozigóta betegek REA-clot APC-R (V.) teszttel mért APC rátái Vad típus n=48 Heterozigóta n=9 Homozigóta n=2 APC ráta

Olvadáspont analízis (FV Leiden) 4 5 6 7 - 1 2 3 hômérséklet (°C) -dF/dT vad típus heterozigóta homozigóta

Faktor V Leiden mutáció hordozás gyakorisága UK: 3% Hollandia: 3% Franciaország: 3.5% Németország: 7% Spanyolország: 3% Törökország: 10% Görögország: 10% Svédország: 10% Finnország: 3% Magyarország:~10%(K-Mo.:9,2%, Ny-Mo.:6,2%)

Protrombin 20210A allél Hordozása 1.8-4.1-szeres relatív kockázatot jelent mélyvénás thrombosisra. A familiáris thrombophiliák kb. 10%-áért felelős. Egyéb thrombophiliás állapotokban hordozása tovább fokozza a thromboembolia kockázatát. Mutáció: a protrombin gén 3’ át nem íródó szekvenciájában guanin-adenin csere. Következmény: szignifikáns plazma protrombin szint emelkedés magasabb transzlációs efficiencia vagy stabilabb mRNS képződése révén. Karrier frekvencia: K-Mo.: 4,4%, Ny-Mo.: 3,8%

Thrombophilia szűrés - ajánlások Egyértelműen ajánlott: rekurrens VTE, 50 éves kor előtt jelentkező VTE, nyilvánvaló kiváltó tényező hiányában kialakult VTE bármely életkorban szokatlan lokalizációban jelentkező VTE VTE terhességben, puerperiumban, OAC, vagy hormonpótló terápiában Megfontolandó: 50 év alatti dohányos nők AMI 50 év felettiek ismert kiváltó tényező jelenlétében kialakult VTE (nincs tu) terhességi komplikációk (pl. preeclamsia) tünetmentes családtagok (főleg nők) Nem ajánlott: általános populációs szűrőtesztként prenatalis tesztként, tünetmentes gyermekek szűrésére artériás thrombosisokban (vannak kivételek, pl. fiatal betegek atherosclerosis nélkül) OAC, hormonpótlás előtt (teljes panel) Aiach M, Emmerich J. 2006

Thrombophilia szűrése Paraméter Módszer APC rezisztencia II. generációs funkcionális teszt FII 20210A molekuláris genetikai vizsgálat Antitrombin III heparin kofaktor aktivitás Protein C funkcionális alvadási teszt Protein S funkcionális alvadási teszt+szabad PS ag Dysfibrinogenaemia TI, fibrinogén (funkc.+immun.) Homocisztein éhgyomri APS LA + AP antitestek Vizsgálat időzítése: kerüljük az akut thrombosisban, kumarin terápia alatt, nagy dózisú heparin terápia alatt, újszülött korban, terhességben történő kivizsgálást.