Az RNS világ, hibaküszöb Kun Ádám Növényrendszertani és Ökológiai Tanszék és Collegium Budapest

Az Élet kialakulása előtt... Az első élőlények rendelkeztek Sejtmembránnal Anyagcserével Örökítőanyaggal Hogy jutottunk el idáig? Mi volt az ősleves (pizza) és az első élőlények közötti időben?

Mi volt előbb a tyúk vagy a tojás? Fehérje enzimek DNS örökítőanyag Lipid membrán

RNS világ Az RNS lehet enzim és információhordozó DNS és fehérje világ előtt RNS világ A DNS stabilabb a fehérje pedig változatosabb és hatékonyabb enzim

RNS világ RNS világ bizonyítékai RNS világ lehetőségei RNS világ kialakulásának megoldatlan problémái RNS világ fejlődésének problémái

RNS világ bizonyítékai a mai szervezetek biokémiájában I Természetes RNS enzimek (ribozim) Mindegyik RNS hasítást katalizál I. Csoportbeli intronok II. Csoportbeli intronok RNáz P Kalapácsfej Hajtűhurok Hepatitis Delta Vírus Neurospora Varkund Satelite RNA A természetes ribozimeknek napjainkig 7 csoportját izolálták. A természetes ribozimek (összefoglaló Doudna, J. A. & Cech, T. R. The chemical repertoire of natural ribozymes. Nature 418, 222-228 (2002)) mindegyike RNS hasítást végez, bár különböző mechanizmussal (Westhof, E. Chemical diversity in RNA cleavage. Science 286, 61-62 (1999); Doherty, E. A. & Doudna, J. A. Ribozyme structure and mechanism. Annual Review of Biochemistry 69, 597-615 (2000); Doudna, J. A. & Lorsch, J. R. Ribozyme catalysis: not different just worse. Natue structural & molecular biology 12, 395-402 (2005)). Joyce, G. (2002) Nature 418:214-221 alapján

RNS világ bizonyítékai a mai szervezetek biokémiájában II: Koenzimek NADP FAD Koenzimek: valamilyen specifikus kémiai csoport átadásában résztvevő metabolitok (rengeteg reakcióban) Acetyl koenzim A (koenzim A): acetyl csoport NADH, FADH2 (NAD+, FAD): hidrogén és elektron ATP (ADP): nagyenergiájú foszfát NAD CoA ATP

tRNS Aminosavat szállít a transzlációhoz Lehet koenzim is! Elképzelhető, hogy először aminosav koenzimek segítették a ribozimeket, valahogy úgy ahogy most a tRNS-en van aminosav. Később az aminosav lánc egyre hosszabb lett és az RNS vált koenzimmé. Glutamil-tRNA + 2 H+ + 2 NADPH L-Glutamát-1-félaldehid + NADP+ + tRNAGlu

RNS világ bizonyítékai a mai szervezetek biokémiájában III Dezoxi-ribonukleotidok ribonukleotidokból keletkeznek (de ezt valószínűleg ribozimek nem tudják katalizálni). Riboswitches: Génreguláció vélhetően legősibb formája. Az mRNS térszerkezete határozza meg, hogy lefordítódik fehérjévé. Nukleozid-difoszfátot a ribonukleotid-reduktáz enzim redukálja dezoxi-nukleozid-difoszfáttá.

RNS világ bizonyítékai a mai szervezetek biokémiájában IV: Transzláció mRNS tRNS riboszóma Mesterségesen előállított ribozimekkel a fehérjeszintézis megoldható. A transzkripciót az RNS-polimeráz enzim végzi. A DNS  fehérje „átmentet” (transzláció) RNS közvetítésével történik Riboszómában a peptidil transzfert egy ribozim végzi!

RNS világ lehetőségei Mesterséges evolúcióval előállított enzimek SZINTÉZIS v. VÉLETLENSZERŰ MOLEKULÁK SZELEKCIÓ Affinity chromatography Filter binding Gel mobility shift Imunopercipitation EVOLVÁLÓDOTT MOLEKULA SOKSZOROZÓDÁS mutagenic PCR

RNS világ lehetőségei: RNS szintézis Nukleotid képzés pirimidinből és aktivált ribózból Polinukleotidok 5’ foszforilációja 5’ foszfát aktiválása 5’,5’ pirofoszfát kötött nukleotid kapcsolással Ligáz aktivitás Legjobb szintetáz kb. 200 bázis hosszú és 14 nuklotidot tud egy templát alapján hozzákapcsolni egy oligonukleotid lánchoz 97.5%-os másolási hűséggel.

RNS világ lehetőségei: Protein szintézis Protein szintézis minden lépése megoldható Aminosavak aktiválása (sokféle aminoaciláció) Peptid kötés kialakítás

RNS világ lehetőségei: Egyéb reakciók amid kötés bontás alkiláció porfirin metiláció kén alkiláció Diels-Alder cikloaddíció Amid kötés kialakítás hidas bifenil izomeráció

RNS világ lehetőségei: Érdekességek Egy ribozim a részeiből is összeállhat működő ribozimmé E. coli RNáz P M1 részét darabolva, azok összeállnak működő ribozimet alkotva. Kisebb részleteket jobban lehet replikálni Egy szekvencia, két ribozim HDV-t és class III ligáz-t egyesítő ribozimet állítottak elő, úgy, hogy olyan szekvenciát kerestek, amely mindkét szerkezetet felveheti. Működő enzimeken keresztül vezethet az út egyik funkcióból a másikba

RNS világ kialakulásának megoldatlan problémái Rengeteg féle cukor, bázis Sztereokémia Pirimidinek prebiotikus keletkezése kérdéses Nukleotidok képződésének sebessége nagyon kicsi Polimerizáció során 2’-5’; 3’-5’ és 5’-5’ kapcsolatok

Hogyan alakulhat ki ebből egy RNS világ? Az RNS világ fejlődése Tekintsünk el az előbbi problémáktól! Legyen aktivált monomerünk. Legyenek oligonukleotidjaink Hogyan alakulhat ki ebből egy RNS világ?

Az RNS világ fejlődése: Az Eigen paradoxon A replikáció nem hibátlan (főleg nem replikáz és javító mechanizmusok nélkül) Mekkora információ (milyen hosszú RNS szál) tartható meg adott másolási pontosság mellett?

„Replikáció” egy példája RNA RGA RNX RNH DNM RQA RNJ RPA WORLD WORLF WORLL IDRYD KORLD WORUD WORHD WORWD WRRLD HYPOTHESIS EYPKTHYSII HYPEXHESIS HYPETHESKS HYYOTHESIS HYPOSHESIS HYPOTMESIS HTPOTHESIS CYPOTGESIS HYPOTHEGIA HYPOXHLSIS HYPXTHESIS HYPUTHESIS

Az Eigen paradoxon: Modell xi molekula conc. Ai másolási sebesség wij mutáció j-ből i-be D és F az állandó kocentrációért Q a másolási hűség, Q=qN q a bázisonkénti másolási hűség

Eigen paradoxon: A paradoxon Együtt tud-e élni egy mesterkópia, a mutánsaival? ahol s az eredeti szekvencia szelekciós fölénye Hosszabb RNS-hez jobb (hosszabb enzim kell), de a hosszabb enzimet nem tudja megtartani a rendszer Tehát mondjuk 97.5% pontossággal másoló 200 nukleotidból álló replikáz nem tudja fenntartani saját magát.

Hibaküszöb N=50 Swetina és Schuster 1998 alapján

Genotípus - Fenotípus Genotípus a szekvencia (bázissorrend) A fenotípus az Eigen modellben szintén a bázissorrend Mesterkópia: AUCGUCUGUCGGCGAU A két szekvencia teljesen különbözik. A mutáns fitnesse 0 Mutáns: GCAUGACUCAUUAUGC

RNS struktúra Neurospora VS ribozim 144 nukleotid hosszú

RNS másodlagos szerkezet Bázispárok számától függ a szabadenergia. Dinamikus optimalizáció a bázispárok számának maximalizálására (energia minimalizálására) A bázispárok energetikáját kísérletesen vizsgálják

RNS másodlagos szerkezet meghatározás Szekvencia R=r1, r2, r3, ..., rn; ahol ri{A,C,G,U} Másodlagos szerkezet S = i.j bázispárok rendezett halmaza 1  i < j  N j - i>3 i.j és k.l bázispárokra (i<k) igaz az egyik: i=k és j=l (ugyanaz a bázispár) i<j<k<l (egymás után jönnek) i<k<l<j (i.j magába foglalja k.l-t) Keressük a legalacsonyabb energiájú (vagy ahhoz közeli) szerkezetet, feltehetően ez a másodlagos szerkezete egy RNS molekulának

Másodlagos szerkezet energiája A srtruktúra energiája a hurkok energiájától függ Bármely struktúra egyértelműen felbontható m+1 (m a bázispárok száma) hurokra hajtűkanyar halmozódó bázispár kitüremkedés belső hurok elágazás A struktúra energiája, így az egyes hurkok energiájának összege

Struktúra a fenotípus A másolási sebesség, vagy az enzimatikus aktivitás a struktúrától függ. Egy RNS molekula fenotípusa nem a bázissorrend, hanem a struktúra. 4N szekvencia lehetséges, mennyi struktúra? Hogyan határozzuk meg a struktúrát

RNS tájképek Kémiailag és fizikailag megalapozott genotípus-fenotípus térkép Ilyen máshol még nincs a biológiában

RNS tájképek tulajdonságai I Körülbelül 2.35N struktúra, azaz egy struktúrához több szekvencia tartozik. Kevés mutáció (1-3) általában nem változtatja meg a struktúrát Ha van egy kompatibilis szekvenciánk, akkor az átlagosan 7.2 mutációval olyanná alakítható, hogy kívánt MFE struktúrája legyen

RNS tájképek tulajdonságai II Mesterkópia: Azonos struktúra Azonos fitness AUCGUCUGUCGGCGAU Mutáns: GCAUGACUCAUUAUGC Semleges utak a tájképen Az utak 21.7%-a perkolál

RNS tájképek tulajdonságai III Vannak gyakoribb struktúrák A szekvenciák zöme gyakori struktúrát vesz fel (evolválódott ribozimek minden bizonnyal gyakoriak) A struktúrák zömét csekély számú szekvencia veszi fel Minden szekvencia körüli kb. 20 mutációval elérhető gömbön belül minden gyakori struktúra elérhető

RNS tájképek következményei Az evolválódott ribozimek minden bizonnyal gyakori struktúrák. A hibaküszöböt egy megengedőbb fenotípikus hibaküszöb váltja fel. Az Eigen paradoxont ez nem oldja meg, de megoldását könnyebbé teszi.

Ribozimok rátermettség tájképe A fenotipikus hibaküszöb becsléséhez szükségünk van egy rátermettség tájképre A rátermettség tájkép kísérletes adatokra épül Feltételezzük, hogy az enzimaktivitás arányos a rátermettséggel (protosejt)

A vizsgálat célja Valós ribozimokra rátermettség tájkép szerkesztése Ilyen tájkép előállításának általános menete Fenotipikus hibaküszöb becslése

Mely ribozimok jöhetnek szóba? 1. Jól karakterizált Csak a természetes ribozimok teljesítik ezt a kritériumot 2. Nem túl hosszú (praktikus ok) Az I-es és II-es csoportbeli intronok kiesnek 3. Nem lehet a transz ható enzim szerkezetben pszeudo-csomó (algoritmus követelménye) Hepatitis Delta Virus kiesik e miatt Neurospora VS Ribozyme, Hairpin, Hammerhead

Neurospora Varkund Satellit Ribozim A pozíciók 83/144 (57%) mutálva van, mi összesen 183 mutánst vettünk figyelembe

VS Ribozim: mutációs kísérletek 144 nukleotidból 87-en végeztek mutációs kísérletet Összesen 183 mutánst vizsgáltak

VS Ribozim Elágazások fontosak Aktív hely Hossz nem fontos Hossz nem fontos Kitüremkedés nem lehet a másik száron, de törölhető Szubsztrát kötés

Hairpin Ribozyme N = 50 A pozíciók 39/50 (78%) mutálva van, összesen 142 mutáns vettünk figyelembe

Ribozimokkal kapcsolatos általános megfigyelések A szerkezet a fontos, nem az egyedi bázispárok A szerkezet kissé változtatható Vannak kritikus helyek A tájkép multiplikatív (lehet hogy van egy gyenge szinergia)

Általános funkcionalitás tájkép Rendeljen minden lehetséges 4N szekvenciához egy relatív enzimaktivitást Kompatibilis szerkezet Hibás bázispár Kritikus helyek Jósolt struktúra

I. Kompatibilis szerkezet A célstruktúrának megfelelő bázis-párok mindegyike – legtöbbje – ki tud-e alakulni? Néhány hibás pár (rosszul párosított bázispár) megengedhető, de Nem lehet kettő ilyen egymás mellett Nem lehet egy régióban kettőnél több A a szekvenciával kompatibilis struktúrának megfelelő aktivitás.

II. Hibás bázispárok Minden megengedett hibás bázis-pár csökkenti az aktivitást Az elhelyezkedésüktől függően más hatásuk lehet az egyes hibás pároknak

III. Kritikus helyek Minden lehetséges nukleotidhoz rendelünk aktivitást ezeken a helyeken.

IV. Jósolt szerkezet A 2D szerkezet meghatározása. (Vienna RNA Package) Elfogadjuk, ha a célszerkezetbe tekeredik. A MFE nem biztos, hogy a kísérletesen meghatározott másodlagos szerkezet

RNS populáció dinamikája 1000 RNS molekula Szaporodás esélye arányos a fitnesszel A másolás pontatlan, de a molekula hossza állandó Degradáció sebessége azonos minden szekvenciára

A tájkép tulajdonságai

Fenotipikus hibaküszöb VS Ribozim Hajtű m* = 0.146 m* = 0.053

Más tájképekkel összehasonlítva Mnt. Fuji típusú tájkép Nincs szerkezet Az aktivitások pontmutációk alapján Egycsúcsú rátermettség tájkép Az egyszeres mutánsok átlagos aktivitása alapján

Más tájképekkel összehasonlítva

Fenntartható genom méret Neurospora VS Ribozim Hairpin A két funkcionalitás tájképe eléggé hasonló, így az lns értékeket használhatjuk a fenntartható genomméret becslésére.

Fenntartható genom méret

Probléma még egyáltalán Eigen Paradoxona?