Mikotoxinok biodegradációjára alkalmas mikrobák szelekciója és alkalmazásuk lehetőségei Kukolya József, Cserháti Mátyás, Krifaton Csilla, Háhn Judit, Táncsics András, Szoboszlay Sándor, Kriszt Balázs

Aratás utáni biológiai mikotoxin szint csökkentési lehetőségek Toxin adszorpció: 1.Lactobacillusok alkalmazása takarmányadalékként toxinok sejtfelszínen történő megkötésére 2. élesztőből preparált mannooligoszacharidok alkalmazása takarmányokban toxin megkötésre Toxinbontó mikrobák direkt alkalmazása: takarmányadalékkénti alkalmazás- Nocardia corynebacteroides aflatoxinos csirketáp mentesítésre (Tejada-Castaneda et al. 2008) Nem specifikus enzimek alkalmazása:peroxidáz enzimek alkalmazása (nem specifikus enzim, 30-40%-os aflatoxin konverzió, igen nagy enzim igény- Das et al. 2000) A toxinbontás/inaktiválás kulcsenzimeinek izolálása és alkalmazása: Biomin Mycofix Plus Iránymutató a mikotoxin mentesítési eljárásokhoz (Jemme 1989) -inaktiválja, elbontsa, eltávolítsa a toxint -ne maradjon toxikus bomlástermék -a tápanyagtartalom ne változzon -a termék technológiai jellemzői ne változzanak -ne kerüljön többe mint a dekontaminálandó anyag

Mikotoxinok biotranszformációjára alkalmas mikroorganizmusok Vizsgált mikotoxin Referencia Flavobacterium aurantiacum Aflatoxin Ciegler et al., 1966 Aspergillus flavus Hamid and Smith, 1987 Rhodococcus erythropolis Alberts et al. 2006 Rhodococcus pyridinivorans Cserháti et al. 2008 Trichosporon mycotoxinivorans Zearalenone Schatzmayr et al., 2006 Pseudomonas putida ZEA-1 Altahi and El-Deeb, 2009 Rhodococcus erythropolis Norcardia globulera Rood and Duvick, 1998 Rhizopus stolonifer, Aspergillus niger Ochtratoxin A Vágvölgyi et al., 2005 Acinetobacter calcoaceticus Hwang and Draughon, 1994 Exophiala pinifera Fumonisins Duvick et al., 1998 Rhinocladiella atrovirens Bacterium sp.ATCC 55552 Comamonas sp. NCB 1492 Benedetti et al. 2006 Agrobacterium sp. Deoxynivalenol Shima et al., 1997 Eubacterium sp. BBSH797 Binder et al., 1998 Butyrvibrio fibrisolvens T-2 toxin Westlake et al., 1987 Selenomonas ruminantium Anaerovibrio lipolytica Curtobacterium sp. Ueno et al., 1983

A Trichosporon mycotoxinivorans Zearalenon biotranszformációja észteráz segítségével A zealarelon bontási kísérlet kromatogramjai (Molnár et al. 2004)

A MYCOSTOP projekt előzményei -Az Agruniver Holding Kft.: kiváló aromásbontó aktivitású mikroba törzsgyűjtemény, melyek tagjai nagyobbrészt a rhodococcus nezettségbe tartoznak -a rhodococcusok a prokarióták között a legnagyobb genommal rendelkeznek: 9 Mbp -katabolit represszió hiánya -aromás szerkezeti elemet tartalmazó szubsztrátok bontásának hatékonysága (203 különböző oxigenáz) -A R. equi kivételével törzseik nem patogének -nemzetközi kapcsolatok rhodococcus-laborokkal -2006-ban a dél-afrikai van Zyl professzor és csoportja először publikál a rhodococcusok Aflatoxin-bontó képességéről -Előkísérletben az AH Kft. rhodococcus kollekciója igen figyelemre méltó degradációs aktivitást mutatott

A MYCOSTOP projekt biodegradációs ágának célkitűzései A hároméves kutatási szakaszt három fázisra osztottuk 1.fázis: -mikotoxinok degradációjára alkalmas mikrobák screenelése (rhodococcus törzsek bioremediációs gyűjteményekből +referencia törzsek, minél szélesebb törzsgarnitúra ~200 törzs!) -a toxindegradáció követése analitikai és ELISA rendszerekkel 2. fázis: -biztonságos törzsek kiválasztása: molekuláris taxonómiai azonosítás, olyan mikrobák szelekciója, melyek a bontás során nem termelnek citotoxikus, genotoxikus metabolitokat (SOS-Chromo teszt, Aliivibrio fischeri toxikológia) –a törzsek aktivitás fokozása genetikai eszközökkel (UV- és transzpozon mutagenezis) 3. fázis: -toxinbontó mikrobák alkalmazása, immobilizált élősejtes biofilterek fejlesztése -gyakorlati felhasználás, a szeszmoslék detoxifikációja fluidágyas reaktorban 4. fázis: -a mikotoxinbontás metabolizmusának feltárása (nem szerepelt az eredeti célok között!)

1. fázis: Mikroba törzsek mikotoxin bontó képességének meghatározása A screen rendszer elemei: -vizsgált toxinok: Aflatoxin, Zearalenon, T-2 toxin, Ochratoxin, DON -vizsgálatba vont mikrobák: 200 törzs -bontási teszt: LB-táptalaj, 2-4 ppm toxinszint, 3 napos inkubáció -Toxin monitoring: napi mintavétel, a felülúszóból ELISA (SoftFlow) és analitikai (Wessling) mikotoxin kimutatás

1. fázis: Rhodococcus törzsgyűjtemény mikotoxin bontó képességének meghatározása AflatoxinB1 Zearalenon DON Ochratoxin T2 Aflatoxin B1 Soft Flow Wessling Faj törzs %  %   R. erythropolis Ak-35 3 10 89 99 100 R. globerulus AK-36 1 90 R. pyridinivorans AK-37 61 67 22 98 K408 87 20 42 34 R. aetherivorans AK 44 55 39 29 69 94 R. rhodochrous ATTC 12 26 95 96 DSM 4306 17 2 DSM 743 11 70 R. coprophilus N774 38 57 R. ruber N361 58 62 45 R. gluberulus N58 56 4 Ni1 60 88 OchratoxinA Fumonizin B1 Zealarenon T-2 toxin

1. fázis: A Rhodococcus törzsgarnitúra toxinbontó képessége Rhodococcus faj   Zea DON Ochra T2 AF1 Multitoxin bontás R. erythropolis 18 1 21 3 R.pyridinivorans 4 2 R. globerulus R. ruber R. gordoniae R. coprophilus R. rhodochrous R. aetherivorans 8 rhodococcus faj 32 törzsét szkreeneltük eddig, a R. erythropolis Ni1-törzs három toxin, a Zearalenon, T2-toxin és az aflatoxin bontására is képes

1. fázis: Nem rhodoccocus genuszba tartozó mikroba fajok toxinbontó képessége (28 tétel) Nemzetségek Fajok száma Zea DON Ochra T2 AF1 Pseudomonas 6 1 Streptomyces 5 3 4 Chryseobacterium Cupriavidus 2 Pseudoxanthomonas Paracoccus Microbacterium Raoultella Serratia Sphingopyxis Ochrobactrum Gordonia Arthrobacter Piros: 95%-fölötti bontás (Cupriavidus basiliensis Őr16: 99%!); sárga: 66% fölötti bontás

Aliivibrio fischeri lumineszcencia-teszt Ökotoxikológiai vizsgálatokban használt tesztszervezet A. fischeri strain NRRLB-11177 (ISO/EN/DIN 11348) Módosított akut teszt (Sarter et al, 2008) 24 órás sejttenyészetre kifejtett gátlás 3.5, 10, 15, 25 h órás kontaktidő után A módszert adaptáltuk ELISA rendszerhez Nagy mennyiségű minta feldolgozása, UV-mutagenezis és transzpozon mutagenezis rendszerekhez (több ezer klón!)

SOS-Chromoteszt 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 Escherichia coli PQ37 mutáns Genetikai háttér: Operon fúzió: lacZ gén az SOS regulonba van integrálva → normál lac régió törölve β-galaktozidáz aktivitás az SOS repair rendszer indukciójától függ → színreakcióból következtethetünk a mutagenitási potenciálra Direkt/Indirekt hatású genotoxinok kimutatása, S9 patkánymáj-kivonat S9 mix hígítási szint 4NQO AFB1 2AA 1:1 10,79 5,63 0,98 4,30 1:2 10,69 3,88 2,23 4,03 1:4 9,51 2,35 3,08 3,97 1:8 4,64 1,81 3,32 3,66 1:16 2,91 1,20 3,59 1:32 1,65 1,39 3,50 2,88 1:64 1,70 1,41 2,89 2,54 1:128 1,50 1,23 2,16 2,01 Indukciós faktor (IF): I (Indukciós faktor) = (A405 nc x A620 t)/(A405 t x A620 nc) ahol: nc: negatív kontroll; t: tesztelt oldat Genotoxikus hatás: IF>1,5 Eredményeink alapján az AFB1 kimutathatósági határa: 78 ppb

Miért az aflatoxin volt az első leírt mikotoxin és mi közük van ehhez a pulykáknak? Aflatoxin inaktiválása háziállatokban: AFB1 AFB1-8,9-epoxid AFB1GSH Aflatoxin inaktiválása pulykákban: AFB1 AFB1-8,9-epoxid AFB1GSH cytochromes P450 (CYP) Glutation transzferáz GST CYP 1A DNS-kötés, mutáció, toxicitás 1960 pulyka X-kór: az aflatoxin felfedezése

Aktív és biztonságos törzsek kiválasztása   SOS-Chromotest ELISA-rendszer Kémiai analitika Indukciós Faktor Bontási (%) Bontási idő 24 h 48 h 72 h Mikroszervezetek E. coli 2,4 2,1 2,3 <20 R. globerulus N58 – 2,6 20,79 R. ruber N361 3,0 R. erythropolis ZFM 23,1 1,8 72,87 71,69 OM 7-2 3,1 1,7 79,2 84,3 N11 2,0 1,4 1,3 97,64 81,71 R. coprophilus ATTC 12674 1,2 97,9 96,05 NCIMB 9784 97,11 98,55 DSM 4306 97,56 99,98 IFO 12538 1,6 96,4 94,52 R. rhodochrous K402 1,9 98,11 99,92 CW25 97,97 Különböző rhodococcus törzsek különböző bontási útvonalat használhatnak az AFB1 bontásához Különböző bakteriális biotesztek használata Eltérő hatások: genotoxicitás vs. citotoxicitás

3. Fázis: A R. pyridinivorans AK37 törzs aktivitásának fokozása UV-mutagenezissel -A mutagenezishez UV-transziluminátort használtunk, 25 sec kontaktidővel ami kb. egy ezrelékes túlélést eredményezett -A mutáns klónokból 2000-et szelektáltunk, majd felszaporítás után ELISA lemezeken, 30%-os glicerolban -80C-on tároltuk -A klónok aktivitás screenjét 2ppm Aflatoxin B1-el kontaminált , és 10ppm zearalenont tartalmazó rendszerben, Aliivibrio fischeri toxicitásteszttel végeztük -Tíz megnövekedett aktivitású klónt szelektáltunk, ezeket használtuk az immobilizált élősejtes konstrukciókhoz

3. Fázis: Immobilizált élősejtek előállítása -Az immobilizáláshoz az elterjedten használt 89.000-98.000-es molekulatömegű polivinil-alkoholt (Sigma-Aldrich) használtuk -Speciális polimerizációs és kérgesítő technikát fejlesztettünk ki -A gyöngyök rendkívül ellenállóak, 4hétig képesek intaktak maradni 200rpm kevertetés mellett A PVA-gyöngy SEM képén jól látható annak nyitott micellás szerkezete PVA-micella falában immobilizált R. pyridinivorans sejtek

2. Fázis: Rhodococcus pyridinivorans zearalenon-bontó képességének vizsgálata patkányon, uterotropikus bioassay módszerrel OECD Guideline for the testing of chemicals Uterotrophic Bioassay in Rodents (440) 18 napos (választás előtti) nőstény Wistar patkányok (MTA-KOKI Orvosi Géntechnológiai Részleg) Marker: uterus tömege 17

Kísérletek ZEARALENON DÓZIS-HATÁS VIZSGÁLAT kontroll: tiszta olivaolaj E2: 17-ösztradiol (pozitív kontroll) 0,04 mg/kg bw Zearalenon több dózisban 0,1 ; 1 ; 5 ; 10 mg/kg bw Eredmények: Szignifikáns hatás uterus tömegére: E2 Zearalenon 5 mg/kg ; 10 mg/kg A testtömeg-növekedésre egyik kezelés sem volt hatással. BIODEGRADÁCIÓ-VIZSGÁLAT: kontroll: LB tápoldat LB tápoldat+20ppm Zearalenon R. pyridinivorans -sal 3 napig inkubálva, majd liofilizálón 20X koncentrálva (~47ppm toxin) LB tápoldat+ Zearalenon (20x koncentrálás után ~425ppm toxin) Eredmények: Szignifikáns hatás uterus tömegére: Zearalenon A testtömeg-növekedésre egyik kezelés sem volt hatással. 18

3. Fázis: Aflatoxin B1 bidegradációs kísérlet immobilizált törzsekkel -Az 1ppm AFB1 tartalmú szeszmoslékhoz PVA gyöngyökben immobilizált mutáns és vad típusú AK37 törzseket adtunk (1-3,3-10mg száraz sejttömeg/ml mátrix tartalmazó, valamint üres-kontroll), majd 28 oC-on, 170 rpm-en, 3 napon keresztül rázattuk a lombikokat. -A minták maradék toxintartalmát a Wessling Hungary Kft laborjában HPLC módszerrel határoztuk meg. Törzsek: -AK 37 (Rhodococcus pyridinivorans), -AK34UV (Rhodococcus pyridinivorans) Kísérleti mátrix: természetes Aflatoxin B1 szennyeződést tartalmazó kukoricából előállított szeszmoslék

4. fázis: A bakteriális mikotoxinbontás metabolizmusának feltárása De novo genom projekt indítása a R. pyridinivorans AK37 törzsből a BayGen Intézettel közösen: -a genom 5,27Mb-pár méretű, 60 contigba rendezve (90-330kb contigméret) Transzkriptóma analízis Zealarenon és Aflatoxin B1tartalmú táptalajon tenyésztett mikrobából Transzpozon mutagenezis könyvtár készítés és nullmutánsok szkreenelése az adaptált fluorimetriás és SOS-chromoteszttel 2D-proteom elválasztás és az indukált fehérjék peptid térképezése

4. Fázis: A toxinbontásban résztvevő enzimek azonosítása kétdimenziós proteom elválasztással -A 2D protein térképezés lehetővé teszi induktív közegben expresszálódó enzimek azonosítását -A fehérjék első elválasztása izoelektromos pont (pH strip 3-11), -A második méret szerint (10%SDS-PAGE) történik -A kivágott foltok analízise, peptidszekvenálás MS/MS módszerrel kontroll Zearalenon Aflatoxin B1

4.Fázis: A tandem tömegspektrometriával nyert peptidszekvenciák azonosítása a Rhodococcus pyridinivorans AK 37 genomjában Peptid szekvencia találat E-value Contig Ident.% Posit.% LVTPELSGSLLPGITR 1 0,002077 Contig_16 100 TMIQSPSGVILQEAADVHAR 2,55596 Contig_18 67 ADVLTTGAGNPVGDK 6,32116 Contig_34 53 80 FSTVAGESGSADTVR 2 0,358313 Contig_35 DLPIYVVCPGR 0,036984 Contig_37 91 ISGVGIDQPPYGIFVINQK 3,62421 Contig_42 56 69 AQSILEKSGVNPDIR 0,265346 Contig_49 87 AEIEGEMGDSHVGLQAR 0,000159 Contig_7 ALELALAQIDK 2,01249 EGSLIDMGVEQGFIR 0,002031 FLLENTDVRDEIEK 0,022029 IGVMFGSPETTTGGK 0,004303 MTGALNNSGTTAIFINQLR 9,76E-06 QAEFDILYGQGISK 0,005468 SAAIDVIVIDSVAALVPR 0,00487 83 94 SGSWYTYEGDQLGQGK 0,000106

További célkitűzések A MYCOSTOP projekt 2011-es befejezéséig immobilizált toxinbontó mikroba alapú, félüzemi szeszmoslékmentesítő technológia kidolgozása Multimikotoxin-bontó mikrobatörzs nemesítése, aktivitás fokozása UV- és transzpozon mutagenezis technikákkal (R. erythropolis Ni1) A metabolizmus kutatáshoz nélkülözhetetlen genetikai alapok megteremtése: de novo genom projekt a Cupriavidus basiliensis-ből (ochratoxin) reszekvenálás a Rhodococcus erythropolis Ni1 törzsnél, fizikai térkép a R. pyridinivorans AK37 törzsből A toxin metabolizmus feltárása Aflatoxin B1, Zearalenon, T2-toxin és Ochratoxin esetében A toxin metabolizmusért felelős enzimek expressziója, biokémiai jellemzése Takarmányadalékként alkalmazható, mikotoxin dekontaminációra alkalmas enzimkészítmények előállítása