Természet Világa

Az élet keletkezése ELTE, Növényrendszertani és Ökológiai Tanszék Dr. Kun Ádám, Ph.D. tudományos főmunkatárs okleveles biológus, okleveles vegyész ELTE, Növényrendszertani és Ökológiai Tanszék

A megfejtetlen rejtély: az élet keletkezése Tudjuk, hogy van élet Ha találunk egy utat, akkor sem lehetünk biztosak benne, hogy azt az utat járta be az Élet

Életet teremteni egyszerű…

Életet „élettelenből” előállítani kevésbé...

Az élethez vezető út Kémiai sokféleség kialakulása Sokszorozódás kialakulása, kémiai evolúció Templát alapú replikáció Templát vezérelt anyagcsere Protosejt Joyce 2002 Nature 418:214

Út az élethez – Az összetettség növekedése Makromolekula Monomer Funkció szerzés Protosejtté integrálás

Információ hordozó molekula Funkció szerzés Kódolja Elhatárol Anyagcsere Enzim Információ hordozó molekula Membrán Alapegységet állít elő Replikál/Másol Alapegységet állít elő

Kémiai sokféleség kialakulása Avagy hogyan lehet hihető prebiotikus szintézissel előállni a fontos molekulákra

Prebiotikus szintézis Kiindulási anyagok elérhetőek prebiotikus körülmények között (azaz csak olyan anyagokkal dolgozhatunk, ami jelen volt akkor a Földön) A szintézis útja elképzelhető prebiotikus körülmények között (azaz olyan körülmények között játszódhat a reakció, ami reális, például tömény kénsavas közeg, van szerves oldószer nem) A két feltétel együttese messze nem triviális kihívás a szerves szintetikus vegyészek számára. Egy példa az adenin előállítására úgy kezdődik, hogy: 6-kloropurin és 1,2,3,4-tetrahydro-1-naphthylamine 1:1 izopropanolban levő elegyét reflux hőmérsékleten tartsd 20 óráig. Sem a kiindulási anyagok, sem a szerves oldószeres közeg nem elérhető prebiotikus körülmények között.

Funkció – kémiai sajátság ma Monomer Makromolekula katalizátor (enzim) aminosav fehérje információ hordozó nukleotid (bázis, cukor) DNS / RNS membrán zsírsavak micella, lipid vezikulum

Aminosavak - Miller-Urey kísérlet Metán (CH4) Ammónia (NH3) Hidrogén (H2) Víz (H2O) Elektromos kisülés A kémiai evolúció kutatásának mérföldköve volt Stanley Miller kísérlete (Stanley L. Miller (1953): Production of amino acids under possible primitive Earth conditions. Science 117:528-529.), amely során kísérletesen állított elő szerves molekulákat prebiotikus körülményeket modellezve. A kísérletben erősen redukáló, metánt, ammóniát és vizet tartalmazó légkört tételezett fel. A rendszert vízzel (ősóceán) kiegészítve, energiaforrásként pedig elektromos kisülést alkalmazva azt a meglepő eredményt kapták, hogy az oldatban aminosavak és más szerves molekulák vannak. Az aminosavak jelenléte igazolt, azonban oligopeptiddé nehezen kapcsolódnak össze és akkor sem biztos, hogy az a mai szervezetekben „megszokott” peptidkötésen keresztül történik. A kísérletben a genetikai kód által kódolt 20 aminosavon kívül számos más aminosav is megjelent. A „természetes” aminosavak messze nem a leggyakoribbak. Továbbá például a lizin, arginin és hisztidin szintézise még nem megoldott. Az előbbiekhez hozzátartozik, hogy mostanában a légkörfizikusok erősen kétségbe vonják egy ősi redukáló légkör jelenlétét. Modelljeik alapján valószínűbb, hogy a légkör főleg CO2, N2 és H2O keveréke volt, kisebb mennyiségű CO és H2 jelenlétével. Így a fenti reakciókhoz a redukált szenet vagy a víz alatti hidrotermális hasadékokból, vulkánokból feltörő metán vagy az ásványi felszíneken végbemenő redoxi folyamatok szolgáltathatták. A hidrotermális hasadékok mellett – bár az óceán kémiai összetétele kedvez a szerves molekulák abiogén szintézisének – a magas hőmérséklet (85 - 350 C) azonban túlságosan meggyorsítja a bomlást, ami lehetetlenné tesz bizonyos reakcióutakat és a makromolekulák felgombolyodása sem megy megfelelően végbe. Aminosavak (glicin, szarkozin, alanin)

Formóz reakció A cukrok szintézise könnyen megoldható az úgynevezett formóz reakcióval, amelyben formaldehidből kiindulva egy bonyolult reakcióhálózatban mindenféle cukor jöhet létre, köztük ribóz is. A szintézis autokatalitikus, de a keletkezett cukrok elég instabilak. Továbbá a keletkezett cukrok mind kémiai felépítésüket, mind sztereokémiájukat tekintve elég vegyesek, és a biológiailag fontos cukrok – elsősorban a ribóz – egyáltalán nem fordulnak elő tömegesen az elegyben. Borát felszínen viszont a ribóz stabilizálható, s a reakció ezen irányban elvihető. Butlerov, A. 1861. C. R. Acad. Sci. 53: 145-147. Ricardo, et al. 2004 Borate Minerals Stabilize Ribose A. Science 303: 196

Cianid polimerizáció A nukleinsavakban található bázisok közül az adenin, guanin, citozin és uracil abiogén keletkezését megfigyelték (bár a pirimidinek keletkezése egyes szerzők szerint kevéssé meggyőző), viszont a timinét nem. A szintézisben a hidrogén-cianid kulcsvegyület (Oró J. (1960) Synthesis of adenine from ammonium cyanide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2:407-412), az adenin felfogható HCN polimerként is. Feltehető, hogy a bázisok abiogén szintézise megoldható, de a nukleozidok képzése belőlük problémás. A bázisok és a cukor reakciója purinok esetében nagyon kis mértékben végbemegy, azonban pirimidinek esetében a nukleozidok keletkezése reménytelennek tűnik. A nukleozidok foszforilációja vízmentes közegben jó kitermeléssel megtörténik (bár a megfelelő formájú foszfor jelenléte prebiotikus körülmények között kérdéses), de a foszforiláltság foka változó és mindenféle izomer keletkezik. A nukleotidok nagyon kis mértékben összekapcsolódnak, de a szükséges 3’-5’ foszfodiészter kötés mellett a 2’-5’ és a 5’-5’ is kialakul. Zubay, G. and T. Mui (2001). "Prebiotic synthesis of nucleotides." Origins of Life and Evolution of the Biosphere 31: 87-102. Orgel, L. E. (2004). "Prebiotic adenine revisited: eutectics and photochemistry." Origins of Life and Evolution of Biospheres 34(4): 361-369.

Makromolekulák Peptidek nem keletkeznek az aminosavakból (max. dipeptidek) Nukleotidok nem állnak össze (na ez azért gyorsan megoldódhat), viszont nukleotidokból oligomerek igen. Lipidek összeállnak vezikulákká, micelláká! De magunak a lipideknek a keletkezése nem megoldott

Makromolekulák: Oligonukleotidok 40-50 tagú oligomerek montmorillonit agyag felszíneken előállnak Montmorillonit vulkanikus hamuból keletkezik Perris, J. P. 2002 Montmorillonite catalysis of 30-50 mer oligonucleotides: laboratory demonstration of potential steps in the origin of the RNA world. Origins of Life and Evolution of the Biosphere 32, 311-332. Montmorillonit = Na0.2Ca0.1Al2Si4O10(OH)2(H2O)10

Membrán kialakulás A micellák és membránok autokatalitikusan kialakulnak Ön-összeszerelődés (self-asembly) A sejtmembrán foszfolipidekből áll.

Az élet építőkövei A monomerek és makromolekulák prebiotikus szintézise Funkció Monomer Makromolekula katalizátor (enzim) aminosav fehérje ? információ hordozó nukleotid (bázis, cukor) ? DNS / RNS membrán zsírsavak ? micella, lipid vezikulum

Szép, hogy vannak molekuláink, de mire jók? Funckió? Szép, hogy vannak molekuláink, de mire jók? A mai molekulák jók arra amire használjuk őket, de ez nem biztos, hogy csak ők jók

Mire van szükségünk? Anyagcsere Előálljon minden amire szükségünk van. Katalizátorok Kémiailag sokfélét ismerünk. Ásványi felszínek Kompartmentalizáció Amit előállítottunk az ne menjen el. Felületek Ásványi felszínek A felületek előnyösek termodinamikailag Katalitikus aktivitásuk lehet Az ásványi felszínek védhetnek az UV sugárzástól Az ásványi felszínek elősegíthetik a homokiralitást

Miért kellenek katalizátorok? Reakciók lassúak (pl. vízkilépés, CO2 megkötés) Gyorsabbnak kell legyen a lebomlásnál Térszerkezeti problémák Reakciók nem specifikusak (rengeteg mellékreakció is végbemegy) Nem sztereospecifikusak, racém keletkezik A kémiából tanultak alapján egy reakció sztöchiometriáját és a reagensek koncentrációját ismerve elképzelésünk lehet, hogy a reakció egyensúlya mely irányba van eltolva (az irreverzibilis reakcióknál extrém módon). Ezek után írjuk fel egy peptidkötés kialakulásának reakcióját: HOOC-R-NH2 + HOOC-R’-NH2  HOOC-R-NH-OC-R’-NH2 + H2O Vizes közegben a H2O koncentrációja igen magas, így a reakció spontán végbemenetele igen valószínűtlen. A térszerkezeti problémák illusztrálására gondoljunk abba bele, hogy sikeres reakció akkor történik, ha a reaktánsok egyszerre ütköznek, s az ütközés minden reaktáns szempontjából megfelelő irányban és helyen történik. Kémiai reakcióban kettőnél több molekula nem vesz részt (nincs hármas ütközést megkívánó elemi reakció), míg enzimreakcióknál ez nem ritka. A nagy molekuláknál véletlenszerű ütközést feltételezve igen valószínűtlen, hogy pont a megfelelő irányban találkozzanak. (Gondolatkísérlet: Van két szabálytalan alakú testünk, mindkettőn van egy-egy kis rész amelyek ha találkoznak a két test összetapad. Milyen gyakran fognak összetapadni, ha egyszerűen összedobom őket?) A reakciók nem specifikusságával kapcsolatban gondoljunk arra, hogy pl. peptidkötés kialakulhat egy aminosav –NH2 csoportja és egy glutaminsav oldalláncbeli karboxi-csoportja között is. Tehát két molekula reakciójának végterméke többféle molekula lehet.

Racém, kiralitás Számos molekula királis, azaz két változata van, amely fedésbe nem hozható, hasonlóan a két kezünkhöz. A két enantiomer biológiai hatása eltérő lehet Racém monomerből nem lehet „rendes” polimert előállítani. D-alanin L-alanin Egy adott királis vegyület sztereoizomerei gyakran eltérő hatással vannak az élő szervezetre vagy a környezetre. Szerencsétlen esetben az egyik enantiomer hatása végzetes is lehet, például, az 1960-as években a terhesség kezdeti szakaszában nyugtatóként adott Thalidomid nevű gyógyszer mellékhatásaként több ezer torz csecsemő született. A szerencsétlenséget az okozta, hogy a racemátként forgalomba hozott gyógyszernek az (R) enantiomere nyugtató, de az (S) enantiomere teratogén hatású volt. Továbbá például a természetes L-aszparagin keserű, míg a szintetikus D-aszparagin édes. D-glükóz L-glükóz

Kémiai sokféleség kialakulása Sokszorozódás kialakulása, kémiai evolúció Templát alapú replikáció Templát vezérelt anyagcsere Protosejt

Az RNS Világ

A DNS / fehérje világ előtt… Ma élő élőlényekben Az információDNS-ben tárolódik Fehérjék az enzimek Kódolja Fehérje DNS Replikál Monomert állít elő

RNS enzimként is működhet és információt is tárolhat! … egy RNS világ volt RNS enzimként is működhet és információt is tárolhat! RNS Replikálódik, hogy enzimet kapjunk Reakciókat katalizál, monomert állít elő Cech és munkatársai (Kruger, K. et al. Self-splicing RNA: autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequence of Tetrahymena. Cell 31, 147-157 (1982)) és nem sokkal később Altman és munkatársai is (Guerrier-Takada, C., Gardiner, K., Marsh, T., Pace, N. & Altman, S. The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. Cell 35, 849-857 (1983)) olyan RNS molekulát írtak le, amely kémiai reakciót katalizál. Az első esetben a Tetrahymena nukleuszában a riboszómális RNS érésénél egy intron fehérje enzim nélkül vágódott ki az RNS láncból. A másik esetben RNáz-P-ről derült ki, hogy a katalízist az RNS rész végzi. Ezek a felfedezések lettek az alapjai az RNS világ hipotézisnek (Gilbert, W. The RNA world. Nature 319, 618 (1986)) DNS stabilabb és a fehérjék jobb enzimek

RNS világra utaló körülmény a mai szervezetek biokémiájában I Természetes RNS enzimek (ribozim) Mindegyik RNS hasítást katalizál I. Csoportbeli intronok II. Csoportbeli intronok RNáz P Kalapácsfej Hajtűhurok Hepatitis Delta Vírus Neurospora Varkund Satelite RNA A természetes ribozimeknek napjainkig 7 csoportját izolálták. A természetes ribozimek (összefoglaló Doudna, J. A. & Cech, T. R. The chemical repertoire of natural ribozymes. Nature 418, 222-228 (2002)) mindegyike RNS hasítást végez, bár különböző mechanizmussal (Westhof, E. Chemical diversity in RNA cleavage. Science 286, 61-62 (1999); Doherty, E. A. & Doudna, J. A. Ribozyme structure and mechanism. Annual Review of Biochemistry 69, 597-615 (2000); Doudna, J. A. & Lorsch, J. R. Ribozyme catalysis: not different just worse. Natue structural & molecular biology 12, 395-402 (2005)). Joyce, G. (2002) Nature 418:214-221 alapján

RNS világra utaló körülmény a mai szervezetek biokémiájában II: Koenzimek Koenzimek: valamilyen specifikus kémiai csoport átadásában résztvevő metabolitok (rengeteg reakcióban) Acetil koenzim A (koenzim A): acetyl csoport NADH, FADH2 (NAD+, FAD): hidrogén és elektron ATP (ADP): nagyenergiájú foszfát NADP FAD NAD CoA ATP

RNS világra utaló körülmény a mai szervezetek biokémiájában III: Transzláció mRNS tRNS riboszóma Mesterségesen előállított ribozimekkel a fehérjeszintézis megoldható. A transzkripciót az RNS-polimeráz enzim végzi. A DNS  fehérje „átmentet” (transzláció) RNS közvetítésével történik Riboszómában a peptidil transzfert egy ribozim végzi! Nissen P, Hansen J, Ban N, Moore PB, Steitz TA. 2000. Science 289: 920

RNS világ lehetőségei: RNS szintézis: Nukleotid képzés pirimidinből és aktivált ribózból; Polinukleotidok 5’ foszforilációja; 5’ foszfát aktiválása 5’,5’ pirofoszfát kötött nukleotid kapcsolással; Ligáz aktivitás; Legjobb szintetáz kb. 200 bázis hosszú és 14 nuklotidot tud egy templát alapján hozzákapcsolni egy oligonukleotid lánchoz 97.5%-os másolási hűséggel. Protein szintézis: Minden lépés megoldható. Aminosavak aktiválása (sokféle aminoaciláció); Peptid kötés kialakítás (peptidil transzfer) Membrán transzfer Redoxi reakciók (NAD függő alkohol dehidrogenáz) Egyéb reakciók (amid kötés bontás, alkiláció, porfirin metiláció, kén alkiláció, Diels-Alder cikloaddíció, amid kötés kialakítás, hidas bifenil izomeráció) Ezeket az RNS enzimeket mind in vitro evolúcióval állították elő.

Replikáció Fejlesztett Bartel I ligáz 20 nukleotid templát alapú hozzáadását képes katalizálni Másolási pontosság 0.967/bázis Johnston, W. K., Unrau, P. J., Lawrence, M. S., Glasen, M. E. & Bartel, D. P. RNA-catalyzed RNA polymerization: accurate and general RNA-templated primer extension. Science 292, 1319-1325 (2001). Zaher, H.S. & Unrau, P.J. Selection of an improved RNA polymerase ribozyme with superior extension and fidelity. RNA 13:1017–1026 (2007)

Replikáció szál szétvállás RNS Világ fejlődése Oligo-nukleotidok ásványi felszínen Replikáció szál szétvállás pontosság Nukleotidok ACGUGCUGAGCAU UACACGACUCGUA RNS Ribozimok Anyagcsere Replikáz Kompartmentalizáció Fehérje szintézis

Információ replikáció Eigen Paradoxona

Információ replikáció A replikáció nem hibátlan (főleg nem replikáz és javító mechanizmusok nélkül) A másolás pontossága korlátozza a fenntartható információ hosszát. Mekkora információ (milyen hosszú RNS szál) tartható meg adott másolási pontosság mellett?

„Replikáció” egy példája RNS RGS RNX RNH DNM RQS RNJ RPS VILÁG VILÁF VILÁL IDLYG KILLG VIJÁG VELÁG VILUG VILHG VILWG VRLÁG HIPOTÉZIS EIPKTYSII HIPEXÉSIS HIPETÉZKS HIYOTÉZIS HIPOSÉZIS HIPOTÉZIZ HTPOTÉZIS CIPOTÉZIS HIPOTÉGIA HIPOXLZIS HIPXTÉZIS HIPUTÉZIS

Eigen Pradoxona és a hibaküszöb Nincs enzim nagy genom nélkül, és nincs nagy genom enzim nélkül Az Eigen féle összefüggés azt mondja ki, hogy a fenntartható információ hossza (N) fordítottan arányos a hibarátával (1-q). A modell alapfeltevése, hogy az információt hordozó vad típusú molekula replikációs rátája a legmagasabb (tehát az szaporodik a leggyorsabban, ez az ő előnye). Az ln(s) mutatja, hogy mennyivel jobb a vad típus a mutánsainál. Általában ls(s)=1-nek veszik, így 99% másolási hűség mellett (1% hiba) 100 hosszú enzim tartható fent. Az 1% hibarátánál valószínűleg sokkal magasabb hibarátával kell számolnunk azon körülmények között, tehát optimista becslés mellett is alacsony a fenntartható genomméret. Ebből ered az Eigen paradoxon. A genom méret növelhető a másolási pontosság növelésével. Ehhez enzim kell, ami viszont nem fér bele a 100-as hosszba, ami megengedhető. Tehát a nagyobb genomhoz jó enzim kell, amihez viszont hosszú genom, hogy kódolja. Ez egy tipikus 22-es csapdája. A jobb oldali ábra a hibakatasztrófát ábrázolja. Az Eigen modell (az egyenletek ideillesztésétől megkímélnélek titeket) eredménye, hogy egy adott hiba felett a másolás nem megkülönböztethető a véletlenszerűtől, akkor sem, ha a vad típus másolási sebessége gyorsabb. Ez a hibaküszöb (error threshold). N hossz lns a mesterkópia szelekciós fölénye q másolási pontosság Swetina és Schuster 1998 alapján

Szekvencia vs. Szerkezet Átíródik A szekvenciát kell megtartani Mutáns: rátermettség 0 DNS fehérje GCATGACTCATATGC ATCGTCTGTCGGCGAT Structure has to be maintained Mutáns: Azonos rátermettség RNS AUCGUCUGUCGGCGAU GCAUGACUCAUUAUGC

RNS szerkezet Az enzimaktivitás a szerkezettől függ A ribozim fenotípusa a szerkezete Kevesebb szerkezet van, mint szekvencia Egy kevés mutáció általában nem változtatja meg a szerkezetet Szerkezet könnyebben fenntartható, mint a szekvencia. (fenotipikus hibaköszöb)

Az utolsó univerzális közös ős Milyen lehetett az első élő sejt?

Transzláció és a genetikai kód eredete Fehérjék jobb katalizátorok (4 kémiailag hasonló bázis vs. 20 kémiailag sokféle aminosav) Mivel az RNS központi szerepet játszik a transzlációban, így valószínűleg az RNS világban „találták fel”

Néhány tény a genetikai kódról Közel univerzális Redundáns Miért triplet? A triplet optimális a reverzibilis kapcsolódáshoz Miért 20 aminosav? Az enzim sokféleség növekszik a több aminosavval, de a mutációs robusztusság csökken. A kód optimálizált mutációs robosztusságra

Protosejt Replikáció ? Komplex anyagcsere Membrán / Kompartmentalizáció ? evolúció

Az utolsó univerzális közös ős mRNS proofreading és javítás minden élőlényben azonos. A transzláció és a transzkripció is. DNS proofreading és javítás nem! LUCA-nak RNS genomja volt! Poole, A. M. & Logan, D. T. 2005 Modern mRNA proofreading and repair: clues that the Last Universal Common Ancestor possessed an RNA genome? Molecular Biology Evolution 22, 1444–1455.

A megfejtetlen rejtély Oligo-nukleotidok ásványi felszínen nukleotidok RNS ribozimok

A megfejtetlen rejtély Kódolja fehérje RNS DNS Membrán monomert állít elő replikálja monomert állít elő

Köszönöm a figyelmet!