A sejt. Hogyan vizsgáljuk a sejtek és szövetek szerkezetét? Dr. Röhlich Pál prof. emeritus ÁOK 2010/2011 I. félév: A sejtbiológia alapjai 2011. 09. 13.

A sejt általában Az élő szervezetek sejtekből épülnek fel. A sejt az a legkisebb strukturális és funkcionális egység, amely még az alapvető életjelenségeket mutatja, önálló életre képes. Kétféle típus: prokaryota, primitív sejt, legfontosabb képviselője a baktérium (tok, sejtmembrán, nincsenek sejtorganellumok, sejtmagnak csak előalakja van: „pro-karyon”). Nagyság 1 μm alatt. eukaryota, bonyolult szerkezet, valódi sejtmag („eu-karyon”), sejtorganellumok, membránnal határolt kompartimentumok, átlagos nagyság 10-20 μm között. Az emberi szervezet is ilyen sejtekből áll. Mértékegységek: 1 mikrometer (μm) = 10-3 mm, 1 nanometer (nm) = 10-3μm Sejttan (cytologia): a sejttel, elsősorban annak szerkezetével foglalkozó klasszikus tudományág Sejtbiológia: integratív tudomány, összesíti, egységbe foglalja a sejtre vonatkozó strukturális, molekuláris, biokémiai, élettani, biofizikai stb. ismereteket. Struktúra és funkció egysége. Oktatása egyetemünkön.

Pro- és eukaryota sejt méretbeli különbsége prokaryota (phagocytált baktérium) 

Idealizált állati sejt összetevői (fény- és elektronmikroszkópos „leltár”) 

Mikroszkópok A képalkotás két alapvető módszere: * Optikai módszer (lencserendszerek nagyított optikai képet alkotnak). * Pásztázó (scanning) módszer (a tárgyat soronként letapogatjuk egy fényponttal, majd a regisztrált jelekből a kép összeáll a képernyőn egy szinkron futó pásztázó sugárral. A nagyítás a két pásztázott terület arányából adódik).

A. van Leeuwenhoek (1632-1723) és „mikroszkópja” erős nagyítású lencse (üveggyöngy)

Sugármenet egy kutatómikroszkópban 

A mikroszkópos kép jellemzői Feloldóképesség: két pont közötti legkisebb távolság (d), melynél még azok különálló pontokként azonosíthatók. Abbé képlet: d = 0.61 λ / n sin α λ = a fény hullámhossza n = tárgy és objektív közti közeg törésmutatója (levegő: 1, imm. olaj: 1,56) α = az objektívlencse fél nyílásszöge n sin α = numerikus apertúra (NA) Fénymikroszkóp feloldóképessége: kb. 0,2 μm Nagyítás: objektív nagyítás x okulár nagyítás

Sejtek, szövetek előkészítése a mikroszkópos vizsgálathoz I. A klasszikus módszer (szövettani gyakorlat!) * Rögzítés (fixálás). A strukturák megőrzése a sejtet felépítő makromolekulák keresztbekötésével vagy a fehérjék kicsapásával. Leggyakoribb kémiai fixálószerek: 4-10% formaldehid, 2-4% glutárdialdehid. Az aldehidcsoportok erős kémiai kötéseket képeznek a fehérjék reaktív csoportjaival. * Festés. A sejtek a mikroszkópban közel átlátszóak, belső strukturák alig vehetők ki. Megoldás: a sejtek megfestése különböző festékekkel. A festékek általában elektromos töltésük alapján, vagy hidrofób kölcsönhatások révén kötődnek különböző sejtes strukturákhoz. Pozitív töltésű, ún. bázikus festékek (hematoxilin, metilinkék, toluidinkék, ruténiumvörös, stb.) negatív töltésű molekulákhoz (pl. nukleinsavak, glükozaminoglikánok) kötődnek, bazofil festődés. Negatív töltésű, ún. savanyú festékek (eozin, fukszin, stb.) pozitív töltésű molekulákhoz (pl. mitokondriumok, kollagén rostok, eozinofil sejtek szemcséi, izomsejtek részletei) kötődnek, ún. acidofil festődés. Töltés nélküli, ún. neutrális festékek víztaszító, hidrofób molekulák (szudánfekete, skarlátvörös, stb.), ezért zsírnemű anyagokban oldódnak, azokat festik meg (hidrofób kölcsönhatások révén, zsírfestés) Festéskombinációk (pl. hematoxilin-eozin, Azan, Mallory) Ezüstimpregnációk (Ag-ionok különböző strukturákhoz kötődnek, redukálószerrel kezelve barna színű fémezüst válik ki). Golgi-app., idegi strukturák, rácsrostok, váladékszemcsék tüntethetők fel Szövet esetén metszetek készítése

Mikrotomia (metszetek készítése) I. Metszetek beágyazott anyagból. 1. Paraffin beágyazás Víztelenítés fokozatosan emelkedő koncentrációjú alkoholsorban Intermedium (zsíroldó folyadék, pl. xylol) Átitatás olvasztott paraffinnal (56oC) Kiöntés blokkformába, lehűtés 2. Metszés: mikrotomon (5 μm vastag metszetek), langyos vízen terítjük, tárgylemezre szárítjuk.  szánkamikrotom II. Metszetek fagyasztott anyagból (fagyasztott metszetek)

Megfestett fejlődő fehérvérsejtek nagy nagyítással 

aktinváz fluoreszcens mikroszkópos képe Fluoreszcens mikroszkópia Fluoreszcencia: meghatározott hullámhosszú (ún. gerjesztő) fénysugár hatására a fluoreszcens molekula egy nagyobb hullámhosszú fénysugarat (emissziós sugár) bocsát ki. Fluorokrómok: fluoreszcens festékek Fluoreszcens fehérjék: Tengeri gerinctelenekből előállított fluoreszkáló fehérjék. Előnyük: élő sejtekben is használhatók (génexpresszió vizsgálata, vizsgálandó fehérjék megjelölése és követése, stb.) Fluoreszcens mikroszkóp: fluoreszkáló strukturák vizsgálatára alkalmas mikroszkóp. Jellemzői: erős gerjesztősugarat kibocsátó fényforrás, gerjesztő és emissziós szűrő, felülmegvilágítás (ferde dikroikus tükör, az objektívlencse kondenzorként is működik). Alkalmazás: citokémia (immunfluoreszcencia, in situhibridizáció: FISH, lektincitokémia), fluor. indikátorok intracelluláris ionkoncentrációk és lokalizáció vizsgálatára, stb. Előny: érzékeny módszer, kis mennyiségű anyag is jól kimutatható („csillagok az égbolton”).   aktinváz fluoreszcens mikroszkópos képe

A konfokális pásztázó mikroszkóp rekeszek  emittált sugár útja gerjesztő sugármenet fókuszban fókuszon kívül A lézer sugárforrásból jövő gerjesztő fénysugár egy apró lyukon (rekeszen) megy keresztül, majd azt az objektív a preparátum meghatározott magasságában pontként képezi le. Ha ott fluorokrómmal jelölt struktúra van, az onnan kilépő fénysugarat az objektívlencse szintén pontban képezi le egy másik fényrekesz apró lyukában. A rekeszen áthaladó fényt egy detektor érzékeli. Az objektív fókuszsíkja alatti és feletti síkokból jövő fényjelek gyakorlatilag kirekesztődnek. A pontszerű gerjesztősugarat soronkint mozgatva letapogatjuk a preparátumot, a detektorból jövő jelekkel pedig egy katódsugárcsövet vezérlünk, amelyen összeáll a preparátum fluoreszcens képe.  fluoreszcens mikroszkópos kép konfokális mikroszkópos kép

Citokémia (hisztokémia) Kémiai komponensek (pl. makromolekulák) kimutatása sejtekben, szövetekben. A sejtes (v. szöveti) preparátumot többféle módszerrel vizsgálhatjuk: Kémiai reakciónak vetjük alá, végtermék színes (pl. Feulgen-reakció DNS kimutatására) Kémiai reakciót végeztetünk el vele, pl enzimek kimutatása (enzimcitokémia), végtermék színes Izotópok specifikus beépítése meghatározott makromolekulákba (pl. izotóppal jelzett timidin beépülése DNS-be), kimutatása fényérzékeny emulzióval (autoradiográfia) Specifikus molekuláris kötődések kihasználása (affinitás-citokémia) immuncitokémia lektincitokémia in situ hibridizáció

Immuncitokémia  Az immuncitokémia rendkívül hasznos Alapelv: az immunrendszer ún. B-sejtjei ellenanyagokat (fehérjéből álló ún. immunglobulinokat) képesek termelni a szervezetbe bekerülő idegen anyagok (pl. makromolekulák) ellen. Az immunglobulin Y-alakú komplex fehérje (2 nehéz és 2 könnyű lánccal). Az Y két karjának a végén van a specifikus kötőhely. Az ellenanyagok specifikusan kötődnek az idegen molekula egy részletéhez (epitópjához). A kötődés felhasználható makromolekulák kimutatására a sejtes, szöveti preparátumban. A sejtes, szöveti strukturákhoz kötődött ellenanyag kimutatása (közvetlenül vagy közvetett módon): fluoreszcens festék rákapcsolásával történik, vagy olyan enzim rákapcsolásával, melynek reakcióterméke színes. Poliklonális és monoklonális ellenanyagok Az immuncitokémia rendkívül hasznos és elterjedt eljárás! Az osztódó sejtben a mikrotubulusok zöld, a kinetochorok lila színben, a kromoszómák kék színben látszanak 

Az immunfluoreszcens vizsgálat két egyszerű módja Direkt immuncitokémiai reakció: a kimutatni kívánt molekula ellen termeltetett specifikus ellenanyaghoz kötünk fluoreszcens festéket (fluorokrómot), Indirekt immuncitokémiai reakció: az első, specifikus ellenanyag ellen egy másik állatfajban termeltetett ellenanyagot jelölünk meg fluorokrómmal 

Csapsejtek mozaikja kísérleti állat retinájában. Kettős immuncitokémiai jelölés. Csapsejtek mozaikja kísérleti állat retinájában. A vörösérzékeny csapokat az erre a csapokra specifikus ellenanyaghoz kötött vörös színű fluoreszcens festék (fluorokróm), a kékérzékenyeket pedig a kékekre specifikus ellenanyaghoz kapcsolt zöld színű fluorokróm tünteti fel. 

Lektin-citokémia  PNA  WGA A földimogyoró-lektin (peanut agglutinin, PNA) a béta-galaktóz 1-3 N-acetilgalaktozaminhoz kötődik. Ilyen található pl. a retina csapsejtjeit körülvevő ún. csaphüvelyben, a lektincitokémiai reakció sötét végterméke ezt a hüvelyt tünteti fel. PNA Egyes növényi fehérjék (lektinek) specifikusan kötődnek bizonyos szénhidrátokhoz, ezért felhasználhatók ezen szénhidrátoknak a szövetekben történő kimutatásához. A búzacsírából izolált lektin (wheatgerm agglutinin, WGA) sziálsavhoz és kisebb mértékben az N-acetilglükozaminhoz kötődik. Ilyen fordul elő pl. a bélhám nyáktermelő mirigysejtjeiben, az ún. kehelysejtekben. A kehelysejtek nyákanyagát a WGA-hoz közvetve kapcsolt fluorokróm fényes fluoreszcenciája mutatja ki (fluoreszcens mikroszkópos felvétel).  WGA

In situ nukleinsavhibridizáció A kimutatandó nukleinsav (DNS v. RNS) szakasszal komplementer nukleinsavszakaszt szintetizálunk (oligonukleotid próba), amelyet megjelölünk a mikroszkópban való láthatóság céljából. A jelölés lehet fluorokróm vagy egy antigén, melyet immuncitokémiai reakcióval mutatunk ki. A megjelölt próba a sejtes vagy szöveti preparátumban a kimutatandó nukleinsavhoz kötődik (hibridizál), és azt láthatóvá teszi. Néhány jellemző alkalmazás: gének, centromerek lokalizálása a kromoszóma-készletben, transzkripció vizsgálata az mRNS kimutatásával, virusfertőzés kimutatása a virus-nukleinsav detektálásával, … Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) különböző kromoszómák centromer régiójának és egy génnek a kimutatására humán urothelsejten. sárga: p16 tumor-szuppresszor génje vörös: 3. kromoszóma centromerje kék: kromoszóma centromerje zöld: 17. kromoszóma centromerje Dr. Lotz Gábor felvétele 

A transzmissziós elektronmikroszkóp Vákuum, elektromágneses lencsék, nagyfeszültség (80-100 KV), képrögzítés: fluoreszkáló ernyőn v. filmen Feloldóképesség: 0,2 nanometer! Nagyítás: néhány ezerszerestől 100.000x Preparátum: igen vékony (kisebb, mint 100 nm) Élő sejtek vákuum miatt nem vizsgálhatók! Kontraszt: nagy atomszámú elemekkel (Os, Ag, Au, Pb, stb.) 

műgyantába ágyazott vizsgálati anyag Ultramikrotom Ultravékony metszetek vastagsága: 50-70 nm Ez a fény hullámhosszának 1/10-e! Egyetlen sejtből kb. 200 ultravékony metszet készíthető! műgyantába ágyazott vizsgálati anyag üvegkés  a metszetet finom rézrácsra vesszük fel a metszet széle 

Ultravékony metszetről készült transzmissziós EM felvétel.

Félvékony metszetek 0,5 μm vastag metszetek (EM célra fixált és beágyazott anyagból) Festés: toluidinkék és azúrkék oldatával. Nagy előnye: igen finom sejtrészletek kivehetők. Májsejtek nagy nagyítással. A mitokondriumok jól látszanak. 

Elektronmikroszkópos immuncitokémia fagyasztott ultravékony metszeten A kimutatni kívánt katepszin D lokalizációját a lysosomákban sötét aranykolloid szemcsék jelzik. A májsejtrészlet ultravékony metszetén a kötődött anti-katepszin ellenanyagot egy aranyszemcsékhez adszorbeált második ellenanyag mutatja ki. lysosoma  W. Liou felvétele

A pásztázó (scanning) elektronmikroszkóp   Olyan egyszerű elektronmikroszkóp, mely az elektronsugarat egy pontban gyűjti össze a preparátum felszínén. Az elektronsugár a felszíni molekulákból szekunder elektronokat üt ki, melyeket egy detektor regisztrál. A pontszerű elektronsugár soronként letapogatja a felszínt, a detektorban keletkező jel pedig egy katódsugárcsövet vezérel, miáltal azon a TV elvhez hasonlóan a preparátum felszíne leképeződik, erősen nagyított formában. Értelemszerűen a pásztázó elektronmikroszkóp a sejtek és egyéb mikroszkópos strukturák felszínének vizsgálatára alkalmas.

Vörös- és fehérvérsejtek ér belsejében. Pásztázó (scanning) elektronmikroszkópos felvétel

II. Élő sejtek mikroszkópos vizsgálata Cél: sejtek mozgásának, sejtosztódásnak követése, intracelluláris anyagmozgások vizsgálata, sejtek válasza különböző behatásokra, … Nehézség: a sejtek nem mutatnak elég kontrasztot, alig láthatók Megoldás: az optikai kontraszt fokozása speciális mikroszkópos berendezésekkel: ezek lényege: a fénysugár optikailag sűrűbb vagy ritkább közegeken különböző fáziseltolással halad át, a kilépő sugarakat interferáltatva a fáziskülönbségek amplitúdókülönbségekké (kontraszttá) alakíthatók át. Élő sejt mikroszkópos képe kontrasztfokozó berendezésekkel: differenciálinterferencia kontraszt (DIC)  kontraszt nélkül fáziskontraszt-mikroszkóp

Sejttenyészet (sejtkultúra) Sejtek a szervezeten kívül („üvegben”, in vitro) életben tarthatók, szaporíthatók a megfelelő életkörülmények (tápanyagok, oxigén, növekedési faktorok, sterilitás, megfelelő hőmérséklet, stb.) biztosításával. Leggyakoribb sejtforrás élő sejtek vizsgálatához. Sejtek letapadása, konfluens tenyészet, monolayer Sejtvonalak (halhatatlanok, bizonyos differenciáltság, sejtbiológiai modellsejtek) Sejtmozgások felvétele videoval (korábban filmezéssel). Mikrokinematográfia. Mozgások felgyorsítása. Lefagyasztás folyékony nitrogénben, tárolás hosszú ideig Néhány felhasználás: sejtdifferenciálódás, malignus átalakulás, különböző anyagok hatása a sejtre, különböző sejttípusok kölcsönhatása, sejtek osztódása, sejtvándorlás vizsgálata, … Gyakorlati felhasználás: sejtek felszaporítása terápiás célra, őssejttenyésztés, monoklonális antitestek termeltetése, in vitro toxicitásvizsgálat, kromoszómák izolálása diagnosztikai célra.

Tenyésztett sejtek (fáziskontraszt-mikroszkópos felvételek)   Izomképző (myoblast) sejtek Egér fibroblastok

A sejtbiológiai tananyag Az előadási anyag + a Szövettan tankönyv 1. és 2. fejezete (kérem, jegyzeteljenek az előadáson!), Segítség: előadási anyag vázlata az intézet honlapján: http://anatomia.sote.hu/ix.php?1, Segédletek, Előadások (jelszó: stapes) Ajánlott kiegészítő könyvek: Darvas Zsuzsa és László Valéria: Sejtbiológia, Semmelweis Kiadó, 2005 Csaba György és Madarász Bálint: A sejt szerkezete (EM atlasz), Semmelweis Kiadó Még alaposabb tudást igénylők számára: Alberts-Bray-Johnson-Lewis-Raff-Roberts-Walter: Molecular Biology of the Cell, 5th edition, Garland Science, New York Szabó Gábor szerkesztésében: Sejtbiológia, 2. kiadás, Medicina Kiadó, Budapest

Felhasznált illusztrációk forrása:  Röhlich: Szövettan, 3. kiadás, Semmelweis Kiadó Budapest  Alberts – Johnson – Lewis – Raff – Roberts – Walter: Molecular biology of the cell. 5. kiadás, Garland Science  Junqueira - Carneiro: Histologie, 6. kiadás, Springer  Saját prep. és/vagy felvétel, ill. rajz