Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Sejtek genetikai módosítása (gének bevitele vagy eltávolítása) www.protocol-online.org Tranziens ↔ Permanens transzfekció.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Sejtek genetikai módosítása (gének bevitele vagy eltávolítása) www.protocol-online.org Tranziens ↔ Permanens transzfekció."— Előadás másolata:

1 Sejtek genetikai módosítása (gének bevitele vagy eltávolítása) Tranziens ↔ Permanens transzfekció

2 Mit viszünk be? I. Vektorok Plasmidok: kettős szálú DNS; ~ bp; ha önálló replikációra képes → permanens transzfekció Mesterséges kromoszómák : 300,000(BAC) to 1,000,000(YAC)

3 Lonza promóter1 kívánt „open frame” promóter2 eukaryota rezisztencia gén promóter3 bakteriális origo promóter4 bakteriális rezisztencia gén „multi-cloning” hely (MCS) Mit viszünk be? Viralis vektorok Bakteriális expresszió

4 Cut-and-paste transposition Mobilis szakaszok: transzpozon-transzpozáz rendszerek Transzpozon: „ugráló gén”; Transzpozáz: szekvencia-specifikusan hasítja a transzpozon-végeket és illeszti be szekvencia-specifikus helyekre PiggyBac; Sleeping Beauty Replicative transposition.

5 Feltételes gén-expressziós modellek I. Doxicyclin-gátolható konstrukció Doxicyclin-aktiválható konstrukció Feltételesen immortalizált idegi sejtvonalak kettősen transzgenikus egerekből ATG Neurofilamentum-L promoter LAP 348 gén ATG SV40 T ag gén LAP 348 IPTG Lac-érzékeny „operátorok” Transzgenikus egerek Kettősen transzgenikus egerek: NF-promóterről feltételesen vezérelhető T ag X LAP-egér T ag - egér Baim SB et al., PNAS 88:

6 Feltételes gén-expressziós modellek II. Cre – Lox rendszer : Cre DNS-rekombináz (P1 bakteriofág hely-specifikus rekombináz enzime) meghatározott DNS- szekvenciához – a pallindrom-core-pallindrom szerkezetű, 34 bp - LoxP hely „core” régiójához kötődik, és a pallindrom szakaszt vágja ki, rekombinálja vagy fordítja meg. Andras Nagy, Genesis A Cre-enzim expressziójának időzítésével, a Lox- tartalmú gének a kívánt időszakban kivághatók, vagy aktiválhatók

7 DNS bejuttatása a sejtmembránon át Ca-foszfát, lipidamin-anyag, liposzóma dendromerek, poli-kationons polimerek (PEI, PAMAM, stb) Replkációra képtelen hordozó Virus (pl, lenti, adeno, stb) mikro-injekció elektroporáció „génpuska ” Ca-foszfát Nagy-szemcséjű DNS-CA 2+ csapadék; internalizált szemcsék 2-12 óra múlva; Tápcsere!!! Transzfekciós gyakoriság ellenőrzése óra múlva Szérum-mentes és szérumos közegben is működik; Jelentős sejtpusztulás! Módszer kiválasztása sejttípustól, konstrukciótól is függ 2M

8 „gén-puska” Elektroporáció Elv: sejtmembrán pont-szerű elektromos sértése Gén-belövés nanotechnológia

9 Lipid-DNS micellák; DNS tartalmú liposzómák Elv: lipid-anyag beolvadása a sejt-membránba Lipofectamin, Transfectin, Lipofectin 5  m Nem-szelektált GUV lecithin liposzóma” Tang, M.X., et al.,. Bioconjugate Chem. 7, 703. Quiagen SuperFect : a dendromer model for DNA binding polyamido-amine dendromerDNA – dendromer interaction Poli-amin dendromerek ? Elv: endocytosis (PEI, PAMAM, stb) DNS-komplexálás

10 Replkációra képtelen hordozó virussal (pl, lenti, adeno, stb) való bejuttatás „termelő” sejt: vírusburok képződik, virális replikáció génjei nem Normál tápban; néhány óra; nagy transzfekciós gyakoriság; DE..... Direkt injektálás; hólyagcsíra ES sejtek Fizikai módszerek

11 Transzfektált sejtek kiválogatása Permanens transzfekció esetén, a gén-hordozó sejtek száma nő az idővel, de az aránya nem feltétlenül (!); Jelző-gének egyidejű bevitele biztosítja a kiválogathatóságot. i)Fluoreszcencia alapján : GFP, YFP, mCherry, stb fluoreszcens fehérjét kódoló jelzőgén; FACS válogatás ii)Antibiotikum-rezisztencia alapján: adott antibiotikumot (neomicint, zeocint, stb) bontó enzimet kódol a „jelző”gén; megfelelő koncentrációjú antibiotikum jelenlétében való sejtnövesztés iii)Anyagcsere-enzim működése alapján: a jelző gén olyan enzimet kódol, amellyel a sejt olyan táp-környezetben is nő, amiben a nem-transzfektált sejtek elpusztulnak (pl. hypoxanthine-aminopterin-thymidine; HAT szelekciós médium) Válogatás leggyakrabban: Tranziens versus permanens transzfekció Citoplazmában (időleges) mRNS átírás ~ 10-30% Bevitt DNS beépül a sejtek genomjába; sejtosztódással „szaporodik” ~ 2-5 % Transzfekciós hatékonyság: Gént hordozó sejtek az összes sejt %-ában

12 HAT – medium Hypoxantin-aminopterin-timidin Fuzionált hybridoma sejtek válagatása


Letölteni ppt "Sejtek genetikai módosítása (gének bevitele vagy eltávolítása) www.protocol-online.org Tranziens ↔ Permanens transzfekció."

Hasonló előadás


Google Hirdetések