Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK (1.) Immun affinitás kromatográfia ELISA (A diasorozat sok animációt.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK (1.) Immun affinitás kromatográfia ELISA (A diasorozat sok animációt."— Előadás másolata:

1 ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK (1.) Immun affinitás kromatográfia ELISA (A diasorozat sok animációt tartalmaz. A kinyomtatott ábrák egy része animációként megtekintve nyeri el az értelmét!)

2 AZ IMMUNOESSZÉK ÉRZÉKENYSÉGE

3 ELLENANYAG TISZTÍTÁS ANTIGÉN IMMUNSZORBENSEN oszlop polimer gyöngyök rákötött antigének oszlop töltelék „affinity purified antibody”: a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják.

4 tisztítandó ellenanyagok hozzáadása kötődés elúció mosás Antigén specifikus poliklonális ellenanyag

5 Fehérje(antigén) tisztítás ellenanyag immunszorbensen hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok oszlop oszlop töltelék Fordítva is összeállítható a rendszer: Tisztítandó oldat felvitele Kötődés Mosás Elúció Tisztított antigén polimer gyöngy

6 IMMUNPRECIPITÁCIÓ egy adott fehérje izolálása és koncentrálása sok fehérjét tartalmazó mintákból fehérje kölcsönhatások vizsgálata (pl. jelátvitelben résztvevő molekulák vizsgálata)

7 KROMATIN IMMUNPRECIPITÁCIÓ (ChIP) A DNS adott szakaszával kapcsolatba lépő molekulák (általában transzkripciós faktorok) azonosítása Jelátviteli útvonalak és a génaktiváció közötti kapcsolatok felderítése

8 ELISA plate (lemez) lyuk avagy kút Különböző lemezek – különböző természetű molekulákhoz ELISA Enzyme Linked Immune Sorbent Assay

9 enzyme linkedimmune sorbent ellenanyaghoz konjugált enzim enzim felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok

10 AZ ELISA VIZSGÁLATBAN AZ ANTIGÉN MENNYISÉGÉVEL ARÁNYOS MÉRTÉKŰ VÁLTOZÁST DETEKTÁLUNK Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay

11 AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Direkt módszer Indirekt módszer Felület Antigén Primer ellenanyag Jelzés Szekunder ellenanyagok

12 AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Enzim-antienzim rendszer PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz Antigén Primer ellenanyag Szekunder ellenanyag (faj v. izotípus specifikus) A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyag Enzimek

13 AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni Egyszerű ABC Antigén Biotinált ellenanyag Avidin (szabad) Avidin-enzim komplexek Biotin-enzim komplex Avidin Biotin Complex Jel felerősítése

14 Biotin Különféle reaktív kémiai csoportokkal módosított biotin származékok szinte bármire kovalensen felköthetők M.Wilchek, EA. Bayer et al. (MÓDSZERTAN)

15 A különféle direkt-indirekt, biotin-avidin rendszereket összekombinálva is használják. Lásd a következő példákat.

16 Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. liquor). nem kötődő anyagok kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges fehérjék kimosása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása felesleges ellenanyagok kimosása avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása citokin tartalmú minta hozzáadása felesleges konjugátum kimosása KOMBINÁLT „SZENDVICS” ELISA

17 BIOAKTÍV ANYAGOK KIMUTATÁSA hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek Tumor antigének kimutatása Citokinek, hormonok kimutatása doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása szendvics technikával vagy kompetitív tesztekkel

18 TUMORDIAGNOSZTIKA A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak Tumor antigén (pl. a beteg szérumából) Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor Ag specifikus capture ellenanyaggal (a kit része) fedett felület Prosztata daganatok prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hiperpláziás (BPH) és prosztatitiszes páciensekben  nem specifikus, de a PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával (monitorozásra alkalmas) hasonlóan felhasználható a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

19 Hólyagrák: Az urothel sejtek NMP22 nukleáris mátrix proteinje egészséges emberekben csak kis mennyiségben található meg a vizeletben → megemelkedése diagnosztikus marker Pajzsmirigy daganatok: A szérum tireoglobulin (hTG) megemelkedett szintje diagnosztikus marker Alfa Fötoprotein (AFP) : 68kD-os protein, amit az embrionális máj és szikzacskó termel. Megjelenhet az anya szérumában is (transzplacentális transzfer). Születés utáni egy év alatt alacsony szérumszintre csökken le (<9ng/ml). Magasabb koncentrációja leggyakrabban máj-, petefészek- és hererákkal, preszakrális teratokarcinómákkal, de egyéb daganatokkal is összefüggésben lehet. Carcinoembrionális Antigén (CEA) sejtadhézióban vesz részt. Normális esetben csak az embrionális fejlődés során van jelen. Colorectális és egyéb carcinomát hordozó egyénekben megemelkedik a szérumszintje. Változásának nyomon követésével következtetni lehet a terápia hatékonyságára. Her-2/neu protein: EGF receptor homológ 185 kD-os transzmembrán glikoprotein, tirozin kináz receptor. Az emlődaganatok 20-30%-ban a tumorsejtek emelkedett mértékben expresszálják. Immunterápia során a működése blokkolható specifikus ellenanyaggal (Herceptin), ezért jelenlétét immunhisztokémiával, vagy immunfluoreszcenciás eljárással mutatják ki biopsziás mintákban.

20 HER-2/NEU RECEPTOR SZEREPE AZ EMLŐRÁKBAN ÉS A MONOKLONÁLIS HERCEPTIN TERÁPIA MECHANIZMUSA

21 EGYSZERŰ INDIREKT ELISA LÉPÉSEI Antigén specifikus ellenanyag kimutatása az antigén kitapasztása (coating avagy fedés) felesleges antigén kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges fehérjék kimosása specifikus ellenanyagok hozzáadása felesleges ellenanyagok kimosása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával pl. rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid segítségével Autoimmun ellenanyagok kimutatása pl. HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid Enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása

22 FERTŐZÉSEK DIAGNOSZTIKÁJA Mivel szabad vírus antigének és vírus részecskék nem minden esetben detektálhatóak kellő hatékonysággal (pl. látencia), ezért helyette inkább a szervezetben képződött vírus specifikus ellenanyagokat mutatják ki a fertőzés diagnosztizálásakor. vírus antigénnel fedett ELISA lemezek készen kaphatóak a fertőzött személy szérumában található vírus specifikus ellenanyagok hozzákötnek az antigénhez emberi Ig specifikus jelölt ellenanyagok jelzik a specifikus ellenanyagok jelenlétét ILYEN ELVEN MŰKÖDIK: Epstein-Barr Virus (EBV) teszt kit → EBNA-1 (EBV nukleáris antigén) segítségével mutatják ki az ellene termelt IgG-t HIV diagnosztikai kitben → rekombináns HIV antigénnel anti-HIV antitestek kimutatása vérből, plazmából, szérumból vagy akár beszáradt (és rehidratált) vérfoltból Toxoplazmózis (Toxoplazma gondii – egysejtű parazita) → Toxoplazma elleni IgM kimutatás A toxoplazmózis terhesség során veszélyes akkor, ha az anya friss fertőzésben szenved. Ekkor még csak IgM típusú ellenanyagok termelődnek a fertőzés hatására, melyek transzplacentálisan nem szállítódnak és így nem nyújtanak védelmet a magzat számára: A magzat szabadon fertőződhet.

23 AUTOIMMUNITÁS A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is hasonló módszerekkel detektálják Pl.: SLE (szisztémás lupus erythematosus) : Immunkomplex betegség, melyben számos autoantigén ellen kimutathatóak autoantitestek. A leggyakoribb antitest a kettős szálú DNS elleni antitest (az SLE-ben szenvedő betegek 60%-ában kimutatható). Anti-ENA antitestek számos szisztémás AIB-ben megfigyelhetők (ld. Ouchterlony-módszer). I típusú (autoimmun) diabétesz diagnosztikája a sziget sejt antigének elleni autoantitestek kimutatásával ELISA vizsgálat segítségével:  glutaminsav dekarboxiláz (GAD65): a prediabetikus személyek 70-90%-ban és a diabetikus betegekben specifikus ellenanyagot találni ellene  IA-2 (tirozin foszfatáz-szerű protein): az I típusú diabeteszes betegek 50-75%-ban és közvetlenül a betegség megjelenése előtti állapotban specifikus ellenanyagot találni. Ilyen ellenanyagok megtalálhatóak egyes GAD ellenanyag negatív személyekben is, ezért független diabetesz markernek tekinthető.  inzulin: a legfőképp de nem kizárólagosan autoimmun diabeteszes fiatal gyermekekben (<5 éves) találni ellenanyagot, (megemlítendő, hogy ezek az ellenanyagok nem megkülönböztethetőek azoktól, melyek az inzulin terápia során a szervezetben termelődnek)

24 SZÉRUM ELLENANYAG IZOTÍPUSOK MEGHATÁROZÁSA A szervezetben jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok utalnak az antigén jelenlétére (lásd pl. vírusfertőzések diagnosztikájánál). Az így kimutatott ellenanyagok izotípusa utalhat arra, hogy friss, perzisztáló fertőzésről (IgM ellenanyag dominancia), vagy korábbi fertőzést követő memória válasz eredményéről van-e szó (IgG ellenanyag dominancia). Anti-izotípus (izotípusokra specifikus) ellenanyagokkal ez eldönthető. antigén IgM IgG anti-IgM anti-IgG Megemelkedett szérum IgE szintet tapasztalni atópia esetén, bizonyos autoimmun betegségekben, és egyes parazita fertőzések esetében Egyes immundeficienciákban az ellenanyag alosztályok koncentrációja eltér a normálistól (hiper IgM szindróma) (lásd a korábbi mielóma multiplex esettanulmányt is) ellenanyag capture-ellenanyag a szérum ellenanyaga izotípus specifikus ellenanyag

25 KOMPETITÍV ELISA A szendvics módszerhez hasonlóan oldott antigének kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez. Olyan kisméretű antigének, haptének kimutatására is alkalmas, ami szendvics technikával nem volna lehetséges - A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás - Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazóvagy nem tartalmazó minta hozzáadása - Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés - Mosás - Kromogén anyagok hozzáadása

26 Aspecifikus kitapadásból eredő hiba A fehérjék aspecifikus kitapadása csökkenthető: a felszín telítésével/blokkolással detergens alkalmazásával ELISA hibák Az antigén mellett a plasztik felületre kitapadhatnak maguk az ellenanyagok is - akár közvetlenül - akár indirekten a színreakció ugyan az (MÓDSZERTAN) Hook effektus - Főleg egylépéses, egyszerű szendvics módszereknél fordulhat elő. A túl nagy koncentráció hamis kisebb koncentráció értéket mutat. Oka: Nagy koncentrációknál a kikötődött antigén a szabadon maradóval kompetitál a jelölt ellenanyagokért. Alaposabb mosásokkal vagy a tesztelendő minta hígításával elkerülhető.

27 ELKÉSZÜLT ELISA LEMEZEK

28 Mindenki látott már ehhez hasonló diagnosztikai eszközöket, vagy ha nem, találkozni fog velük későbbi pályafutása során pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből (terhességi teszt) Ezek az eszközök is az ELISA esetében már megismert elsődleges antigén-ellenanyag specifikus kapcsolódását kihasználó technikán alapulnak!

29 hCG KIMUTATÁSA IMMUNKROMATOGRÁFIÁS TESZTCSÍKKAL nitrocellulóz membrán jelölt ellenanyagokkal átitatott rész (A jelzés szabad szemmel is látható!) elölnézet oldalnézet hCG csapda ellenanyag sáv kontroll ellenanyag sáv abszorbciós rész (cellulóz, papír) abszorbciós lap, mintafelviteli rész vizeletminta üvegfilter „papír”

30 hCG csapda ellenanyag sáv kontroll ellenanyag sáv jelölt ellenanyagok hCG kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok Analóg a szendvics ELISÁval

31 hCG sáv ( kikötött hCG) kontroll ellenanyag sáv a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG Ugyanez kompetitív rendszerben Analóg a kompetitív ELISÁval

32 Az ellenanyagon található jelzés szabad szemmel is megfigyelhető, így nincs szükség enzimes folyamatokra, és egyéb reagensekre: kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek) festékkel töltött latex gyöngyök Pl.: kompetitív immunkromatográfiás tesztcsíkok aflatoxin detektálására Az eljárás szemikvantitatívá tehető Immunkromatográfiás tesztcsík egyéb felhasználási lehetőségei: élelmiszervizsgálat során toxinok kimutatása (pl. aflatoxin - aspergillus mycotoxin)

33 A KONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSA Valamilyen indikátor mennyiségi jellemzője utal a koncentrációra pl.:  szín (abszorbancia, optikai denzitás)  fluoreszcencia  sejtszám (pl. növekedési hormon koncentráció meghatározása) Számszerűsíthető értéket ismert koncentrációjú mintával való összehasonlítás segítségével kaphatunk (standard) A sztenderddel összehasonlítás alapja: Ha két minta abszorbanciája azonos  koncentrációjuk is azonos DE EZ CSAK RÉSZBEN IGAZ!!!!

34 koncentráció Ismeretlen koncentrációjú minta OD A standard hígítási sora Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne ? Az összehasonlíthatósághoz az ismeretlen mintából is hígításokat kell csinálni! Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani.


Letölteni ppt "ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK (1.) Immun affinitás kromatográfia ELISA (A diasorozat sok animációt."

Hasonló előadás


Google Hirdetések