Ent 547: Fundamentals of Biological Control

Ent 547: Fundamentals of Biological Control
A molekuláris genetikai módszerek helye, jelentősége a mikológiai diagnosztikában Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Dr. Kredics László SZTE TTK Mikrobiológai Tanszék

Fall 2003 Invazív mikózisok: Folyamatosan növekvő esetszám A rizikócsoportokba sorolható személyek száma nő Jobb kimutatási módszerek Szervátültetésben alkalmazott módszerek fejlődése Új immunszupresszív hatóanyagok Antimikrobiális szerek használata a kórmegelőzésben Antifungális szerekkel szemben rezisztens fajok, törzsek jelennek meg (a legtöbb „emerging” fajnál ez tapasztalható)

Humán patogén fonalasgombák
Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Humán patogén fonalasgombák Predomináns etiológiai ágens Aspergillus spp. Felbukkanó („emerging”) fonalasgombák Járomspórás gombák Trichoderma spp. Fusarium spp. Penicillium marneffei Scedosporium spp. One consequence of the profound immunocompromise required for HSCT is an increased risk of life-threatening opportunistic infections. More than 90% of patients experience prolonged periods of fever, and half of them have documented infections during the posttransplant course. The most common fungi causing invasive disease are Candida species and Aspergillus species, although numerous other fungi once thought to be innocuous are emerging as opportunistic pathogens. Mortality in patients with IFI is high. In patients with Aspergillus infection who have undergone allogeneic HSCT, it can exceed 90%, and virtually all patients with Fusarium and Trichosporon infections die. Even candidemia may be associated with a mortality rate as high as 50%.

Fall 2003 Klasszikus diagnosztika problémái Makromorfológia alapján történő azonosítás nehézkes A mikromorfológiai jellegze-tességek gyakran csak hosszú idő után jelentkeznek Molekuláris módszerek alkalmazása (diagnosztika, taxonómia, epidemiológia) A methenamine silver stain of the skin biopsy specimen shows septate hyphal elements with irregular forms, arranged in a radial fashion. Magnification, 3750.

Fall 2003 Fungi Divisio: Zygomycota Entomophthorales rend Mucorales rend Divisio: Ascomycota Hypocreales rend Eurotiales rend Microascales rend

ZIGOMIKÓZIS Klinikai manifesztáció
Ent 547: Fundamentals of Biological Control ZIGOMIKÓZIS Klinikai manifesztáció Fall 2003 I. RHINOCEREBRÁLIS (67% mortalitás) Érintett lehet: orr, paranazális szinuszok, szem, agy, agyhártya II. PULMONÁRIS (83% mortalitás) Pulmonáris léziók, parenchimális nekrózis III. KUTÁN (16% mortalitás) Égést, vagy sebészeti beavatkozást követő bőrfertőzés IV. GASZTROINTESZTINÁLIS (100% mortalitás) V. DISSZEMINÁLT (100% mortalitás)

Fall 2003 Mucorales rend Hagyományosan Rhizopus oryzae, R. microsporus Egyéb fajok növekvő számban: Actinomucor, Mucor, Rhizomucor, Absidia, Syncephalastrum, Saksanea, Apophysomyces, Cunninghamella nemzetségek Forrás: talaj, növényi anyagok, romló élelmiszerek Prediszponáló tényezők: égési sérülések, leukémia, immunszupresszió, diabetikus ketoacidózis, művesekezelés Halálozás 75-99% alapbetegségtől és a fertőzés módjától függően

Fall 2003 Rhizopus spp. Betegségek: gasztrointesztinális, pulmonáris, disszeminált, rhinocerebrális fertőzések Antifungális terápia (amphotericin B), sebészeti beavatkozás Betegségek: kután, pulmonáris, rhinofaciális és disszeminált zigomikózisok főként neutropéniás betegekben Rhizomucor pusillus Ecology Rhizopus is a cosmopolitan filamentous fungus frequently isolated from soil, decaying fruit and vegetables, animal feces, and old bread. Aside from being known as common contaminants, Rhizopus species are also occasional causes of serious, and often fatal, infections in humans. Certain species are plant pathogens as well. Species The genus Rhizopus contains several species. The most common ones are, namely, Rhizopus arrhizus, Rhizopus azygosporus, Rhizopus microsporus, Rhizopus schipperae, and Rhizopus stolonifer. Morphological features, such as the length of rhizoids and sporangiophores, the shape of columellae, the diameter of sporangia, and the size, shape and surface texture of sporangiospores, help in species differentiation of Rhizopus. Maximum growth temperature also varies from species to another. Pathogenicity and Health Effects Rhizopus species are among the fungi causing the group of infections referred to as zygomycosis. Zygomycosis is now the preferred term over mucormycosis for this angio – invasive disease. Rhizopus arrhizus is the most common cause of zygomycosis and is followed by Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis. Zygomycosis infection includes mucocutaneous, rhinocerebral, genitourinary, gastrointestinal, pulmonary, and disseminated infections. The most frequent predisposing factors for zygomycosis include diabetic ketoacidosis and immunosuppression due to various reasons, such as organ transplantation and other factors such as desferoxamine treatment, renal failure, extensive burns, trauma, and intravenous drug use which may also predispose to development of zygomycosis. Heatstroke has been described as a risk factor for disseminated zygomycosis as well. Contaminated adhesive tapes and wooden tongue depressors have been reported to lead to nosocomial outbreaks of zygomycosis. Vascular invasion that causes necrosis of the infected tissue, and perineural invasion are the most frustrating features of these infections. Zygomycosis is frequently considered as fatal infection. Macroscopic Appearance Ø Growth rate is very rapid and colonies are typically cotton – candy like in texture; Ø The surface colony color is initially white becoming gray to yellowish brown in time while reverse is white to pale; and Ø Pathogenic Rhizopus species can grow well at a temperature of 37°C. Microscopic Appearance Ø Non – septate or scarcely septate broad hyphae with diameter ranging from 6 – 15 µm, rhizoids, sporangiophores, sporangia, and sporangiospores are present; Ø Sporangiophores are usually unbranched, brown in color, solitary or appear in clusters; Ø Rhizoids are found at the point where the stolons and sporangiophores meet; Ø Sporangia are round with flattened bases, located at the tip of the sporangiophores, and with diameter ranging between µm; Ø Sporangiospores are unicellular, hyaline to brown in color, smooth or striated in texture, and with size ranging between µm in diameter; and Ø Apophysis is absent or rarely evident while the columellae are hemispherical. Laboratory Precautions General laboratory precautions are required, no special safety measures needed. Susceptibility Limited data are available on the in vitro susceptibility profile of Rhizopus species. Amphotericin B, based on the study comparing the in vitro activity of amphotericin B, ketoconazole, itraconazole, and voriconazole against Rhizopus arrhizus strains, yielded low MICs. The MICs of ketoconazole, itraconazole, and voriconazole were similar to one another while slightly higher than those of amphotericin B. Considerably high MICs were detected against Rhizopus arrhizus by fluconazole. Caspofungin and anidulafungin appeared to have limited activity against Rhizopus species. Azasordarin derivatives and posaconazole, on the other hand, were found to be active in vitro against Rhizopus arrhizus. Appeared to be active against Rhizopus species were posaconazole and ravuconazole compared to voriconazole as well. Treatment of Rhizopus infections remains difficult due to its ability to invade vascular tissues, infarction of the infected tissue is common and mortality rates are very high. Surgical debridement or surgical resection and well as antifungal therapy are usually required. The most commonly used antifungal agent is amphotericin B. In some cases of zygomycosis, liposomal amphotericin B and other lipid – based amphotericin B formulations such as amphotericin B colloidal dispersion have also been used as treatment. Frequently, clinical response to therapy is unsatisfactory in zygomycosis. Enhanced clinical response has been anecdotally associated with adjuvant therapy with cytokines, especially the colony stimulating factors. For further validation is the successful use of fluconazole and terbinafine as treatment for zygomycosis. Furthermore, a combination of fluconazole with trovafloxacin or ciprofloxacin proved to be effective in a murine model of pulmonary zygomycosis.

Fall 2003 Apophysomyces elegans Forrás: talaj, lebomló növényi részek Betegségek: poszttraumás fertőzések immunkompetens betegekben Terápia: amphotericin B Égési sérülés után kialakult szubkután léziók (ausztrál őslakos)

Apophysomyces elegans Fall 2003 Beteg kora (év)/neme (M/F) Prediszponáló betegség Fertőzött testrész Sérülés Hely 49/F Diabetes mellitus Láb Kis trauma Arizona 56/M Nincs Vesehúgyhólyag N/A Texas 45/M Boka Égés Ausztrália 38/M Kar, láb Elesés 59/M Váll Harapás/fullánk Florida 27/M Has, comb, herék Műtét India 31/M Hát, tüdők, aorta, csigolyák Motorbaleset 29/M Bal vese 70/M Mellkas Trauma 69/M Kar, váll Karib-térség 19/M Szem, szájpadlás, sinusok Mexikó 50/M Veseátültetés Alkar Oklahoma 30/F Arm Injekció 32/F Hasfal 6/M Medence, hát, vese, hasnyálmirigy, 55/M Alkoholizmus,cirrhosis Térd Szem, sinusok Traumás sérülés

Fall 2003 Zygomycota kórokozók diagnosztikája Klinikai azonosítás gyakran csak „zygomycosis”, „mucormycosis” rDNS nagy alegység D2 domén szekvenciaanalízise (Hall és mtsai. 2004) MicroSeq D2 Large-Subunit Ribosomal DNA Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) PCR, cycle sequencing, azonosító szoftver, szekvencia adatbázis Mucor, Rhizopus, Rhizomucor, Zygorhynchus, Cokeromyces, Syncephalastrum Hibridizációs próbák Mucor és Rhizomucor 18S rDNS-ére (Wu és mtsai. 2003) 28S rRNS gén szekvenciái alapján 13 klinikai Zygomycota taxonra specifikus primerpár (Voigt és mtsai. 1999) Zygomycota Phylogeny and PCR Identification of Clinically Important Zygomycetes Based on Nuclear Ribosomal-DNA Sequence Data KERSTIN VOIGT,* ELIZABETH CIGELNIK, AND KERRY O’DONNELL Thirteen taxon-specific primer pairs that amplify a fragment of the 28S rDNA from Zygomycetes

Fall 2003 Zygomycota Phylogeny and PCR Identification of Clinically Important Zygomycetes Based on Nuclear Ribosomal-DNA Sequence Data KERSTIN VOIGT,* ELIZABETH CIGELNIK, AND KERRY O’DONNELL Thirteen taxon-specific primer pairs that amplify a fragment of the 28S rDNA from Zygomycetes

Fall 2003 Járomspórás gombák molekuláris tipizálása rDNS szekvenciák elemzése filogenetikai kapcsolatok vizsgálata a Mucorales és Entomophthorales rendeken belül ITS RFLP Rhizomucor izolátumok taxonómiai helyzetének vizsgálata Apophysomyces elegans elkülönítése más klinikai szempontból releváns járomspórás gombáktól Cunninghamella echinulata és C. bertholletiae elkülönítése (ITS RFLP + PCR fingerprinting) PFGE kariotipizálás Mucor circinelloides, M. bainieri, M. mucedo, M. plumbeus, M. racemosus, Parasitella parasitica, Micromucor sp. RAPD P. parasitica, M. piriformis, M. genevensis, Gilbertella persicaria, Rhizomucor miehei, R. pusillus, Rhizopus stolonifer, R. oryzae Zygomycota Phylogeny and PCR Identification of Clinically Important Zygomycetes Based on Nuclear Ribosomal-DNA Sequence Data KERSTIN VOIGT,* ELIZABETH CIGELNIK, AND KERRY O’DONNELL Thirteen taxon-specific primer pairs that amplify a fragment of the 28S rDNA from Zygomycetes

Fall 2003 Fungi Divisio: Zygomycota Entomophthorales rend Mucorales rend Divisio: Ascomycota Hypocreales rend Eurotiales rend Microascales rend Chaetothyriales rend Dothideales rend

Fall 2003 Fusarium spp. Forrás: Talaj, elhalt növényi részek (növénypatogén, raktári kártevő fajok, mikotoxintermelés) Betegségek: Felszíni és szisztémás mikózisok Keratitis, endophthalmitis, sinusitis, otitis media, onychomikózis, kután fertőzések égési sérülések következtében, tüdőmikózis, endocarditis, peritonitis, disszeminált fertőzések Legvirulensebb képviselő: Fusarium solani, széleskörű rezisztenciát mutat antifungális szerekkel szemben magas mortalitás (akár 80%) Pathogenicity and Clinical Significance As well as being common plant pathogens, Fusarium species. are causative agents of superficial and systemic infections in humans. Infections due to Fusarium spp. are collectively referred to as fusariosis. The most virulent Fusarium spp. is Fusarium solani. Trauma is the major predisposing factor for development of cutaneous infections due to Fusarium strains. Disseminated opportunistic infections, on the other hand, develop in immunosuppressed hosts, particularly in neutropenic and transplant patients. Fusarium infections following solid organ transplantation tend to remain local and have a better outcome compared to those that develop in patients with hematological malignancies and bone marrow transplantation patients. Keratitis, endophthalmitis, otitis media, onychomycosis, cutaneous infections particularly of burn wounds, mycetoma, sinusitis, pulmonary infections, endocarditis, peritonitis, central venous catheter infections, septic arthritis, disseminated infections, and fungemia due to Fusarium spp. have been reported. Outbreaks of nosocomial fusariosis have also been reported. Existence of Fusarium in hospital water distribution systems may result in disseminated fusariosis in immunosuppressed patients. Fusarium may also exist in soil of potted plants in hospitals. These plants constitute a hazardous mycotic reservoir for nosocomial fusariosis. Fusarium species produce mycotoxins. Ingestion of grains contaminated with these toxins may give rise to allergic symptoms or be carcinogenic in long-term consumption. Fumonisins are the mycotoxins produced by Fusarium moniliforme and Fusarium proliferatum in maize. They may cause oesophageal cancer. Another group of mycotoxins, zearalenones, may also be produced by some Fusarium spp. growing in grains. Studies on reduction or elimination of Fusarium mycotoxins from contaminated agricultural and food commodities are in progress. Clinical manifestations of hyalohyphomycosis caused by Fusarium; include cutaneous and subcutaneous infections, endophthalmitis, osteomyelitis, and arthritis following traumatic implantation. Peritonitis has also been reported in patients on continuous ambulatory peritoneal dialysis (CAPD). Disseminated infections are similar to disseminated aspergillosis, however fungemia and ulcerated skin lesions are often more pronounced. The typical patient is granulocytopenic and receiving broad-spectrum antibiotics for unexplained fever. Macroscopic Features Fusarium species grow rapidly on Sabouraud dextrose agar at 25°C and produce woolly to cottony, flat, spreading colonies. The only slow-growing species is Fusarium dimerum. From the front, the color of the colony may be white, cream, tan, salmon, cinnamon, yellow, red, violet, pink, or purple. From the reverse, it may be colorless, tan, red, dark purple, or brown. A sclerotium, which is the organized mass of hyphae that remains dormant during unfavorable conditions, may be observed macroscopically and is usually dark blue in color. On the other hand, sporodochium, the cushion-like mat of hyphae bearing conidiophores over its surface, is usually absent in culture. When present, it may be observed in cream to tan or orange color, except for Fusarium solani, which gives rise to blue-green or blue sporodochia. Microscopic Features Hyaline septate hyphae, conidiophores, phialides, macroconidia, and microconidia are observed microscopically. In addition to these basic elements, chlamydospores are also produced by Fusarium chlamydosporum, Fusarium napiforme, Fusarium oxysporum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, and Fusarium sporotrichoides. Phialides are cylindrical, with a small collarette, solitary or produced as a component of a complex branching system. Monophialides and polyphialides (in heads or in chains) may be observed. Macroconidia (3-8 x µm) are produced from phialides on unbranched or branched conidiophores. They are 2- or more celled, thick-walled, smooth, and cylindrical or sickle- (canoe-)shaped. Macroconidia have a distinct basal foot cell and pointed distal ends. They tend to accumulate in balls or rafts. Microconidia (2-4 x4-8 µm), on the other hand, are formed on long or short simple conidiophores. They are 1-celled (occasionally 2- or 3-celled), smooth, hyaline, ovoid to cylindrical, and arranged in balls (occasionally occurring in chains). Chlamydospores, when present, are sparse, in pairs, clumps or chains. They are thick-walled, hyaline, intercalary or terminal. Macroscopic and microscopic features, such as, color of the colony, length and shape of the macroconidia, the number, shape and arrangement of microconidia, and presence or absence of chlamydospores are key features for the differentiation of Fusarium species. Molecular methods, such as 28S rRNA gene sequencing, may be used for rapid identification of Fusarium strains to species level. Laboratory Precautions No special precautions other than general laboratory precautions are required. Susceptibility Fusarium is one of the most drug-resistant fungi. Among the Fusarium spp., Fusarium solani in general tends to be most resistant of all. Fusarium strains yield quite high MICs for flucytosine, ketoconazole, miconazole, fluconazole, itraconazole, and posaconazole. The novel triazole, Syn-2869, has no activity against Fusarium. Fusarium spp. are intrinsically resistant to the novel glucan synthesis inhibitors, caspofungin, anidulafungin, and micafungin. Despite the lack of its activity alone, the combination of caspofungin with amphotericin B appears synergistic against some Fusarium isolates. The only antifungal drugs that yield relatively low MICs for Fusarium are amphotericin B, voriconazole, and natamycin. Compared to itraconazole, voriconazole yields notably lower MIC. Terbinafine may show good in vitro activity against some isolates. Fusarium infections are difficult to treat and the invasive forms are often fatal. Amphotericin B alone or in combination with flucytosine or rifampin is the most commonly used antifungal drug for treatment of systemic fusariosis. Lipid formulations of amphotericin B, such as liposomal amphotericin B and amphotericin B lipid complex are also used. However, most cases remain resistant and fail to respond to amphotericin B treatment. Granulocyte and GM-CSF transfusions concommitant to amphotericin B therapy may be life-saving in some immunosuppressed patients with disseminated fusariosis. Despite its limited in vitro activity, posaconazole appears effective in murine fusariosis. Human data are awaited for verification of this finding. Topical natamycin is used for treatment of keratitis due to Fusarium. In addition to antifungal therapy, keratoplasty is required for several patients. Patients with mycetoma due to Fusarium may respond to itraconazole. Onychomycosis due to Fusarium, on the other hand, may be treated with itraconazole and cycloprox nail lacquer.

Fusariosis klinikai manifesztációja
Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Fusariosis klinikai manifesztációja Disszeminált F. oxysporum fertőzés jellegzetes bőrléziói (makulák, papulák, szubkután csomók nekrotikus udvarral) Fusarium keratitis

Fall 2003 Fusarium keratitis Fejlődő országok (India, Kína, Nigéria, Tanzánia, Paraguay) Európában, USA-ban ritka Bizonyos területeken predomináns (klímafüggő) Leggyakoribb etiológiai ágens a nemzetségen belül: F. solani Rizikócsoport: mezőgazdasági dolgozók Prediszponáló tényezők: Trauma (faág, tüske, pálmalevél, magvak, rovarok, por, talaj, kő, űveg, fém, macskakarmolás, kakas csőre, tehén farka, stb…) Topikális kortikoszteroidok Korábbi szembetegség, szemműtét Szisztémás betegségek, pl. diabetes mellitus HIV pozitivitás Kontaktlencse viselése Terápia: topikális natamycin, szisztémás ketokonazol, keratoplasztika

Fall 2003 Fusarium keratitis

Klinikai Fusarium izolátumok diagnosztikája
Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Klinikai Fusarium izolátumok diagnosztikája 28S rDNS 480 bp-os fragmentjének szekvenciaanalízise 3 napos tenyészetből, F. dimerum, F. oxysporum, F. solani, F. moniliforme azonosítására (Hennequin és mtsai. 1999) In situ hibidizáció rDNS szekvenciákra specifikus próbákkal Fusarium, Pseudallescheria és Aspergillus törzsek gyors elkülönítésére szövetmintákban (Hayden és mtsai. 2003) MicroSeq D2 Large-Subunit Ribosomal DNA Sequencing Kit (Hall és mtsai. 2004): F. solani, F. chlamydosporum, F. verticillioides rDNS-alapú primerpár Fusarium izolátumok más, klinikai szempontból releváns fajoktól történő elkülönítésére, (szövetmintákból, vérből is) specifikus primerpárok tervezése RAPD termékek szekvenciája alapján (Hue és mtsai 1999)

Fall 2003 P58SL és P28SL primerek 1, F. moniliforme IP ; 2, F. moniliforme IP ; , F. solani IP ; 4, F. solani IP ; 5, F. solani IP ; 6, F. oxysporum 9582; 7, F. oxysporum IP ; 8, F. oxysporum 9026; 9, F. proliferatum 68G; 10, F. dimerum IP ; 11, F. semitectum 2239; 12, F. subglutinans 2241; 13, F. nivale 2238. 1, Candida albicans; 2, Cryptococcus neoformans; , Penicillium purpurogenum; 4, Aspergillus fumigatus; , Acremonium strictum; 6, Trischoporon cutaneum; , Malassezia furfur; 8, Exophiala jeanselmei; 9, Trichophyton rubrum; 10, Alternaria alternata; 11, Aspergillus flavus; , Neocosmospora vasinfecta; 13, F. solani IP ; T2, negative control. M, 100-bp mólsúlymarker. Specific Detection of Fusarium Species in Blood and Tissues by a PCR Technique FRANCOIS-XAVIER HUE,1* MICHEL HUERRE,2 MARIE ANGE ROUFFAULT,1 AND CLAUDE DE BIEVRE1 Specificity of PCR with primer pair P58SL and P28SL. An ethidium bromide-stained agarose gel of PCR products amplified from 1 ng of genomic DNA templates from various fungi is shown. (A) Lanes: 1, F. moniliforme IP ; 2, F. moniliforme IP ; 3, F. solani IP ; 4, F. solani IP ; 5, F. solani IP ; 6, F. oxysporum 9582; 7, F. oxysporum IP ; 8, F. oxysporum 9026; 9, F. proliferatum 68G; 10, F. dimerum IP ; 11, F. semitectum 2239; 12, F. subglutinans 2241; 13, F. nivale (B) Lanes: 1, Candida albicans; 2, Cryptococcus neoformans; 3, Penicillium purpurogenum; 4, Aspergillus fumigatus; 5, Acremonium strictum; 6, Trischoporon cutaneum; 7, Malassezia furfur; 8, Exophiala jeanselmei; 9, Trichophyton rubrum; 10, Alternaria alternata; 11, Aspergillus flavus; 12, Neocosmospora vasinfecta; 13, F. solani IP ; lane T2, negative control. Lanes M, 100-bp DNA ladder.

Klinikai Fusarium izolátumok molekuláris tipizálása
Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Klinikai Fusarium izolátumok molekuláris tipizálása Epidemiológia: kórházi fusariosis és a kórházi vízvezetékek Fusariumok általi kolonizációjának lehetséges kapcsolata: RAPD, RFLP, interrepeat (IR) PCR: 2 betegben környezeti izolátumokkal azonos genotípusú F. solani törzs, bizonyos betegpárokban megegyező genotípusú törzs (Anaissie és mtsai. 2001) RAPD: nincs egyezés a betegekből és a vízmintákból izolált törzsek között, a fertőzés forrása valószínűleg a külső környezet (Raad és mtsai.2002) Betegek esetleg kontaminálhatják a vízvezetékrendszert Phylogenetic relationships within the genus Fusarium showing the positions of the members of the Fusarium solani clade and its substituents Acremonium falciforme and Cylindrocarpon lichenicola in relation to those of other pathogenic and nonpathogenic species. One of 60 most parsimonious trees derived from parsimony analysis of positions 116 to 615 of the 28S rDNA is shown. See the text for methods, scores, and other details. Abbreviations for genus names: Alb., Albonectria; Acr., Acremonium; Cal., Calonectria; Ccl., Cylindrocladium; Cos., Cosmospora; Cyl., Cylindrocarpon; F., Fusarium; H., Haematonectria; L., Leuconectria; Nec., Nectria; Nen., Neonectria; Neo., Neocosmospora; P., Plectosphaerella; V., Verticillium.

Neocosmospora vasinfecta
Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Neocosmospora vasinfecta Növénypatogén gomba (gyapot, dinnye, borsó) Trópusi, szubtrópusi területeken elterjedt Forrás: talaj, gyapotnövény (rizikófaktor) Betegség: 5 ismert eset granuloma lábon veseátültetett betegben poszttraumás osteoarthrithis immunokompetens betegben fatális disszeminált fertőzés leukémiás betegben égés utáni fertőzés gyermekben poszttraumás szaruhártyafekély (keratomikózis)

Neocosmospora vasinfecta keratitis
Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Neocosmospora vasinfecta keratitis poszttraumás szaruhártyafekély (keratomikózis) topikális natamicin-kezelésre, majd szisztémás ketokonazolra nem reagált Keratoplasztika posztoperatív beszűrődés amphotericin B + clotrimazol Probléma: Fusarium-hoz hasonló klinikai manifesztáció nehezíti az azonosítást, natamycin-rezisztencia

Fall 2003 Neocosmospora vasinfecta ITS-alapú azonosítása Keratomikózisból izolált fonalasgomba 472 bp-os ITS szekvenciájához leginkább hasonlító GenBank szekvenciák N. vasinfecta

Fall 2003 Trichoderma nemzetség Ökológiai szerep: elhalt növényi részek lebontása a talajban Biotechnológiai jelentőség: cellulózbontás (T. reesei) Mezőgazdasági alkalmazás: biológiai növényvédelem - növénypatogén gombákkal szemben (kompetíció, mikoparazitizmus, antibiózis) Kártétel a gombatermesztésben: „zöldpenész” Klinikai jelentőség: opportunista fertőzések immunszuprimált betegekben

Fall 2003 A Trichoderma nemzetség klinikai jelentősége A Legfontosabb rizikócsoportok: - immunszuprimált szervátültetettek - HIV fertőzöttek - peritoneálisan dializált betegek Dokumentált esetek száma: - 60 körül - évről évre nő Review:

Trichoderma fertőzésekről tudósító esetleírások a szakirodalomban Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 M = férfi, F = nő; APD = automatizált peritoneális dialízis, CAPD = krónikus ambuláns peritoneális dialízis; 5FC = 5-fluorocitozin, AB = amfotericin B, F = flukonazol, I = itrakonazol, K = ketokonazol, M = mikonazol; TX = transzplantáció; NA = nincs adat

Trichoderma longibrachiatum
Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Trichoderma longibrachiatum Forrás: Talaj, elhalt növényi részek, épületek fala Betegségek: kután léziók, sinusitis, stomatitis, dializált betegekben peritonitis, immunszuprimált betegekben disszeminált fertőzések

T. longibrachiatum által okozott bőrlézió Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Bőrlézió anémiás gyermek könyökhajlatában (infúzióbemenet) A methenamine silver stain of the skin biopsy specimen shows septate hyphal elements with irregular forms, arranged in a radial fashion. Magnification, 3750. Bőrbiopsziából származó minta szeptált hifaelemekkel, 3750-szeres nagyítás. Munoz et al. (1997): J. Clin. Microbiol. 35,

T. longibrachiatum által okozott nekrotizáló stomatitis Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Orális léziók limfómás betegben Histopathologically, fungal septate hyphae show dichotomous branching at acute angles in necrotic gingiva. Magnification 200. Elágazó, szeptált hifák a nekrotizálódó ínyszövetben Myoken et al. (2002): Int. J. Oral Maxillofac. Surg. 37,

Klinikai Trichoderma izolátumok molekuláris diagnosztikája és taxonómiája Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Szekció Faj Longibrachiatum T. longibrachiatum T. citrinoviride T. pseudokoningii Pachybasium T. harzianum Trichoderma T. viride T. koningii Valóban ilyen sok potenciális opportunista faj van a nemzetségben????

Fall 2003 Trichoderma nemzetség Módszerek: PCR-fingerprinting, ITS-szekvencia analízis 6 klinikai törzs vizsgálata: T. longibrachiatum: 5 T. citrinoviride: 1 Klinikai Trichoderma törzsek filogenetikai helyzete a nemzetségen belül ITS-szekvenciák alapján

Vizsgált klinikai Trichoderma izolátumok Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Faj Törzs Izolátum forrása T. longibrachiatum UAMH 9515 peritoneális folyadék, Kanada ATCC bőrlézió, TX, USA ATCC HIV+ páciens, TX, USA CBS tüdő, Bécs, Ausztria CNM-CM 2171 bőrlézió, Spanyolország T. pseudokoningii IP agyi biopszia, Villejuif, Franciaország UAMH 7955 szinusz, Pennsylvania, USA UAMH 7956 tüdő, máj, bélfal, Iowa, USA T. citrinoviride UAMH 9573 peritoneális katéter, Kanada T. koningii CNM-CM 382 peritoneális folyadék, Las Palmas T. harzianum CBS agyi- és tüdőtályogok, Spanyolország T. viride CNM-CM 1798 hemokultúra, Spanyolország CNM-CM 2277 TBC-s beteg köpete, Spanyolország

Fall 2003 ITS-szekvenciákon alapuló törzsazonosítás TrichOKey v. 2.0 Druzhinina és mtsai (2005): An oligonucleotide barcode for species identification in Trichoderma and Hypocrea. Fungal Genet Biol 42,

ITS-szekvenciákon alapuló törzsazonosítás Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Szekvenciaelemzés: TrichOkey 2.0 ( Törzs Faj Identitás CBS T. harzianum igazolt ATCC T. longibrachiatum/H. orientalis igazolt ATCC T. longibrachiatum/H. orientalis igazolt UAMH T. longibrachiatum/H. orientalis igazolt CBS T. longibrachiatum/H. orientalis igazolt CNM-CM T. longibrachiatum/H. orientalis igazolt UAMH T. longibrachiatum/H. orientalis átsorolandó UAMH T. longibrachiatum/H. orientalis átsorolandó IP T. longibrachiatum/H. orientalis átsorolandó UAMH T. longibrachiatum/H. orientalis átsorolandó CNM-CM 382 T. longibrachiatum/H. orientalis átsorolandó CNM-CM T. longibrachiatum/H. orientalis átsorolandó CNM-CM T. longibrachiatum/H. orientalis átsorolandó

Fall 2003 Klinikai Trichoderma törzsek taxonómiai helyzete a nemzetségen belül ITS-szekvenciák alapján ITS 1 – 5,8 S rDNS – ITS2 Primerek: ITS1 ITS4 Termék:  600 bp fragment

Fall 2003 Klinikai Trichoderma törzsek taxonómiai helyzete a nemzetségen belül tef1-szekvenciák alapján Transzlációs elongációs faktor génjének (tef1) 4. és 5. intronja Primerek: EF1-728F TEF-LLErev Termék:  700 bp fragment

Klinikai Trichoderma izolátumokról rendelkezésre álló molekuláris adatok Fall 2003 Ismert esetek száma: körül Molekuláris azonosítás: törzs T. longibrachiatum 26 H. orientalis T. citrinoviride T. harzianum Az opportunista patogén Trichoderma törzsek döntő többsége a nemzetség Longibrachiatum szekciójába tartozik, a más fajok előfordulásáról szóló tudósítások a morfológiai azonosítás nehézségeiből adódóan számos esetben pontatlanok voltak.

Penicillium marneffei
Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Penicillium marneffei Trichocomaceae család Forrás: Délkelet-Ázsia (Thaiföld, Vietnam, Hong Kong, Taiwan Dél-Kína) Betegségek: kután léziók, immunkompetens és immunszuprimált betegekben, az indokínai HIV-pozitív betegek fő opportunistájává vált. bambuszpatkánnyal asszociált További prediszponáló tényezők: lymphoproliferatív rendellenességek autoimmun betegségek tuberkulózis kortikoszteroid terápia Text slide.

Fall 2003 P. marneffei „Molluscum contagiosum”-szerű léziók HIV+ betegben Papula-szerű, elvakart léziók HIV+ betegben

Penicillium marneffei molekuláris diagnosztikája
Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Penicillium marneffei molekuláris diagnosztikája Filogenetikai helyzet magi és mitokonfriális rDNS régiók szekvenciája alapján: Biverticillium klád (Talaromyces) ITS-régió három jellegzetes szakasza alapján specifikus primerek tervezése PM2-PM4 primerpárral kimutatták a kórokozót AIDS-beteg bőrmintájából (Tsunemi et al. 2003)

Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Penicillium marneffei molekuláris diagnosztikája Nested PCR Fajspecifikus hibridizációs próba a 18S rDNS primerekkel amplifikált szakaszára (Vanittanakom és mtsai. 1998) Ugyanezen szakaszra specifikus primerpár tervezése, egyszerű, és nested PCR reakció, szérumból is (Vanittanakom és mtsai. 2002) Nested PCR szövetmintából is (Zeng és mtsai. 2009) Egycsöves seminested PCR reakció vérből is (Prariyachatigul és mtsai. 2003) Nested PCR amplification of DNA from various organisms with the universal fungal primers (first primer pair) RRF1 and RRH1 (A) and with specific primers (second primer pair) Pm1 and Pm2 (B). Lanes: 1, mold form of Penicillium marneffei human isolate 497H; 2, Penicillium sp. (not P. marneffei); 3, Aspergillus fumigatus; 4 and 5, mold and yeast forms of Histoplasma capsulatum, respectively; 6, Cryptococcus neoformans; 7, Candida albicans; 8, Candida krusei; 9, Streptococcus sp.; 10, human DNA; M, size marker of 100-bp-ladder standard DNA; C, negative control. 1, Penicillium marneffei 2, Penicillium sp. (nem P. marneffei); 3, Aspergillus fumigatus; 4 és 5, Histoplasma capsulatum, 6, Cryptococcus neoformans; 7, Candida albicans; 8, Candida krusei; 9, Streptococcus sp.; 10, humán DNS; M, mólsúlymarker C, negatív kontrol. A: univerzális gombaprimerpár, B: P. marneffei specifikus primerpár

Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Penicillium marneffei molekuláris diagnosztikája TaqMan real-time PCR (Pornprasert és mtsai. 2009) Nested PCR amplification of DNA from various organisms with the universal fungal primers (first primer pair) RRF1 and RRH1 (A) and with specific primers (second primer pair) Pm1 and Pm2 (B). Lanes: 1, mold form of Penicillium marneffei human isolate 497H; 2, Penicillium sp. (not P. marneffei); 3, Aspergillus fumigatus; 4 and 5, mold and yeast forms of Histoplasma capsulatum, respectively; 6, Cryptococcus neoformans; 7, Candida albicans; 8, Candida krusei; 9, Streptococcus sp.; 10, human DNA; M, size marker of 100-bp-ladder standard DNA; C, negative control.

Penicillium marneffei tipizálása
Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Penicillium marneffei tipizálása HaeIII RFLP 46 thaiföldi izolátumra (22 klinikai): két DNS-típus különíthető el (Vanittanakom és mtsai. 1996) RAPD 6 random primerrel: 20 taiwani izolátum, 8 mintázat (Hsueh és mtsai. 2000) PFGE NotI restrikciós emésztéssel: 69 thaiföldi izolátum, 54 különböző makrorestrikciós profil 2 fő klaszterben (Trewatcharegon és mtsai. 2001)

Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Penicillium marneffei tipizálása 3 polimorf mikroszatellita marker (PMM) analízise: 35 izolátum, 22 allélikus típus (Lasker and Ran 2004) multilokusz mikroszatellita tipizálás: 23 lokusz vizsgálata 24 izolátum esetében: két fő klád (Fisher és mtsai. 2004)

Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Penicillium marneffei tipizálása multilokusz szekvenciatipizálás: 8 lokusz vizsgálata 24 izolátum esetében, egy sejtfalglikoprotein antigén génfragmentje (MP1) nagy variabilitást mutatott (Lasker 2006) MP1 és 4 homológjának tesztelése 44 törzs esetében: 183 polimorf hely, 35 típus (Woo és mtsai. 2007)

Fall 2003 Scedosporium spp. (S. prolificans, S. apiospermum/Pseudallescheria boydii) Forrás: talaj, szennyvíz, komposzt, trágya Betegség: szubkután fertőzések, osteomyelitis, arthritis, légúti fertőzések Rizikócsoport: cisztikus fibrózisos betegek Multirezisztencia antifungális szerekkel szemben, kombinációs terápia Microscopic morphology of the anamorphic state Scedosporium apiospermum showing numerous, single - celled, pale brown, broadly clavate to ovoid conidia, borne singly or in small groups on elongate, simple or branched conidiophores or laterally on hyphae. Rapid growth of Scedosporium species after 5 days on Sabouraud’s medium showing the non - diffusible grayish brown pigment on both obverse (left) and reverse (right) of the plate. Ecology Scedosporium is a cosmopolitan filamentous fungus which is commonly isolated from rural soils, from polluted water, from composts, and from manure of cattle and fowl. Scedosporium occasionally causes infections in humans. Species The genus Scedosporium contains two species namely, Scedosporium apiospermum and Scedosporium prolificans. There is no sexual form or teleomorph known for Scedosporium prolificans while Pseudallescheria boydii is the teleomorph of Scedosporium apiospermum. Pathogenicity and Health Effects Both immunocompetent and immunocompromised hosts can be infected by Scedosporium prolificans. Subcutaneous infections, osteomyelitis, and arthritis are commonly post – traumatic and may affect otherwise healthy individuals. Due to various reasons, on the other hand, disseminated infections which are often fatal are generally encountered in immunosuppressed neutropenic patients. Scedosporium prolificans is now the known common causative agent of disseminated phaeohyphomycosis. Scedosporium prolificans has been reported to cause ocular infections (keratouveitis) and colonization. Cases with pneumonia, meningoencephalitis, and endocarditis have also been reported. Macroscopic Appearance Ø Growth rate is very rapid at 25°C and colonies are initially cottony and moist (yeast – like) becoming flat with fine, short, mycelial tufts in texture in maturation; and Ø The surface colony color is light gray to black becoming dark gray to black in time while reverse is gray to black; Microscopic Appearance Ø Septate hyaline hyphae, conidiogenous cells (annellides), and conidia are present; Ø Annellides may form directly from hyphae or are formed at the tips of the conidiophores, flask – shaped with swollen base part and elongated neck; Ø Conidia are oval – shaped, olive to brown in color, with a slightly narrowed, truncated base, unicellular, with size of 2 – 5 x 3 – 13 µm, and appear in clusters at the tips of the annellides; Additionally, some isolates may produce round, thick – walled conidia which are formed directly from the hyphae (present in Scedosporium asexual state); and Ø After two to three weeks of incubation, brown cleistothecia are often present in the sexual state of Pseudallescheria boydii. Laboratory Precautions General laboratory precautions are required, no special safety measures needed. Susceptibility Scedosporium prolificans is resistant to amphotericin B, flucytosine, ketoconazole, miconazole, fluconazole, and itraconazole. Showed no or very limited in vitro activities against Scedosporium prolificans isolates are voriconazole, the novel triazole Syn – 2869 and caspofungin. Although either itraconazole or terbinafine has no activity against most isolates of Scedosporium prolificans, the combination of these two drug agents proved to be active in in vitro 95% of the isolates after 48 hours of incubation. Additionally, in this combination study antagonism was not observed. Treatment of infections caused by Scedosporium prolificans is difficult due to its primary multi – resistant nature. Therapy of amphotericin B alone or in combination with flucytosine, fluconazole, or itraconazole has been used in Scedosporium prolificans - infection cases. The mortality rate, however, has been very high in most disseminated infection cases. Liposomal amphotericin B combined with G - CSF seemed to improve survival in an immunocompromised murine model with disseminated Scedosporium prolificans infection. Post – traumatic infections which include arthritis in immunocompetent cases have responded to fluconazole or surgical debridement alone. Optimal treatment of Scedosporium prolificans infections remains yet unidentified and there is a great demand for novel agents with positive activity. Significantly, the clinical outcome is closely linked with the immune status of the host, degree of the infection, and viability of concomitant surgical debridement. Finally, optimal treatment of Scedosporium prolificans infections remains yet unknown and there is a great demand for novel agents with favorable activity. Significantly, the clinical outcome is closely associated with the immune status of the host, extent of the infection, and feasibility of concomitant surgical debridement.

Scedosporium prolificans molekuláris tipizálása
Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Scedosporium prolificans molekuláris tipizálása RAPD (12 primer különböző kombinációi): jól diszkriminál a különböző betegekből származó izolátumok között, 11 beteg – 11 eltérő RAPD mintázatú törzs

Scedosporium prolificans molekuláris tipizálása
Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 Scedosporium prolificans molekuláris tipizálása Nozokomiális kitörésből származó 4 klinikai izolátum + 10 más régiókban izolált törzs RAPD (2 random primer), PCR-fingerprinting (M13) 4 törzs – 3 molekuláris típus, két betegből azonos típus Inter-simple-sequence-repeat (ISSR) fingerprinting: 84 törzs, 35 genotípus (Sole és mtsai. 2003)

S. apiospermum/P.boydii molekuláris tipizálása
Ent 547: Fundamentals of Biological Control S. apiospermum/P.boydii molekuláris tipizálása Fall 2003 RAPD, 3 primerből álló szett 9 cisztikus fibrózisos beteg, 14 hónap, 129 izolátum, 16 genotípus Több betegben nem találtak azonos genotípust 5 betegben 1 genotípus, 4-ben 1 predomináns további genotípus GC UBC UBC-703 Electrophoretic patterns of the 16 genotypes identified in S. apiospermum isolates from CF patients. Amplicons generated by primers GC70 (A), UBC-701 (B), and UBC-703 (C) were separated on 1.5% agarose gels. Lanes M, DNA size markers (100-bp ladder from Amersham Pharmacia-Biotech). Electrophoretic patterns of S. apiospermum isolates from CF patients P4 (A), P8 (B), and P9 (C). Amplicons generated by primer UBC-703 were separated on 1.5% agarose gels. Lanes M, DNA size markers (100-bp ladder from Amersham Pharmacia-Biotech).

S. apiospermum/P.boydii molekuláris tipizálása
Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003 S. apiospermum/P.boydii molekuláris tipizálása Ausztráliai klinika IGS-PCR 52 izolátum cisztikus fibrózisos betegekből és környezeti mintákból 20 típus 9 betegből több típus 11 betegben ugyanaz a típus Egy másik típus 2 betegben Electrophoretic patterns of the 16 genotypes identified in S. apiospermum isolates from CF patients. Amplicons generated by primers GC70 (A), UBC-701 (B), and UBC-703 (C) were separated on 1.5% agarose gels. Lanes M, DNA size markers (100-bp ladder from Amersham Pharmacia-Biotech). Electrophoretic patterns of S. apiospermum isolates from CF patients P4 (A), P8 (B), and P9 (C). Amplicons generated by primer UBC-703 were separated on 1.5% agarose gels. Lanes M, DNA size markers (100-bp ladder from Amersham Pharmacia-Biotech).

Összefoglalás Ent 547: Fundamentals of Biological Control Fall 2003

Fall 2003 Köszönöm a figyelmet!

Ent 547: Fundamentals of Biological Control

Hasonló előadás

Az előadások a következő témára: "Ent 547: Fundamentals of Biological Control"— Előadás másolata:

Hasonló előadás

Projectumról

Visszajelzés

Bejelentkezés

A társadalmi hálózaton keresztül belépni:

Ent 547: Fundamentals of Biological Control

Hasonló előadás

Az előadások a következő témára: "Ent 547: Fundamentals of Biological Control"— Előadás másolata:

Hasonló előadás

Projectumról

Visszajelzés