CELLULÁRIS SZÍV-ELEKTROFIZIOLÓGIAI MÉRÉSI TECHNIKÁK

Az előadások a következő témára: "CELLULÁRIS SZÍV-ELEKTROFIZIOLÓGIAI MÉRÉSI TECHNIKÁK"— Előadás másolata:

1 CELLULÁRIS SZÍV-ELEKTROFIZIOLÓGIAI MÉRÉSI TECHNIKÁK
Dr. Virág László

2 Intracelluláris mikroelektród technika
Voltage clamp technika Patch clamp technika

3 Intracelluláris mikroelektród technika

4

5

6

7 Ag/AgCl 3 M KCl Re ~ MOhm m

8 erősítő számítógép ingerlő A/D d e r Detektált jel P szervfürdő
d: ingerlő elektróda e: mikroelektróda r: referens elektróda P: preparátum számítógép A/D ingerlő erősítő Detektált jel P d e r 100 ms 50 mV 0mV

9 20 mV 100 ms 50% APA Vmax 90% RP APD50 APD90 előinkubáció anyag
kimosás 60 perc 20-60 perc 60 perc

10 Két mikroelektródás voltage clamp
teszt potenciál parancsjel (voltage command) holding potenciál “makroszkópikus” nátrium-áram

11 A voltage clamp áramkör felépítése

12 Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete

13 Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete
(1) Szívjunk be egy kis membrán darabot a mikropipetta hegyének belsejébe (átmérő ~ 1 µm) Sejt

14 Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete
(2) “Gigaohm-seal” R > 1 GOhm Sejt

15 Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete
(3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva. Sejt

16 Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete
(3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva. zárt nyitott Sejt

17 Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete
(3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva. zárt zárt nyitott Sejt

18 Nátrium csatornák tulajdonságai
parancsjel (voltage command) 10 msec

19 Nátrium csatornák tulajdonságai
A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak

20 Nátrium csatornák tulajdonságai
A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. “makroszkópikus” nátrium áram

21 Nátrium csatornák tulajdonságai
A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik “makroszkópikus” nátrium áram

22 Nátrium csatornák tulajdonságai
A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik A csatornák nyitási valószínűsége hasonló a makroszkópikus áramhoz 300 felvétel szummája “makroszkópikus” nátrium áram

23 Nátrium csatornák tulajdonságai
A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik A csatornák nyitási valószínűsége hasonló a makroszkópikus áramhoz A csatornák inaktivációja miatt a másodszori nyitás nagyon ritka 300 felvétel szummája “makroszkópikus” nátrium áram

24 Slowly inactivating K current channel (Ram & Dagan, 1987)
A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus áramhoz viszonyítva. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik A csatornák nyitási valószínűsége hasonló a makroszkópikus áramhoz A csatornák többször is kinyílhatnak, ha nincs inaktiváció Slowly inactivating K current channel (Ram & Dagan, 1987)

25 Patch clamp technika konfigurációi
On-Cell Cell-Attached

26 Patch clamp technika konfigurációi
Inside-out patch On-Cell

27 Patch clamp technika konfigurációi
On-Cell Whole Cell

28 Patch clamp technika konfigurációi
Whole Cell

29 Patch clamp technika konfigurációi
outside-out patch Whole Cell

30

31 Whole cell konfiguráció
Rs Cm Rc

32

33 Run-down jelenség ATP-függő kálium áram

34 Run-down jelenség L típusú kalcium áram

35 Patch clamp technika konfigurációi
Whole Cell, perforated patch Whole Cell - amphotericin-B - nystatin

36 Run-down jelenség L típusú kalcium áram

37 Sejtizoláció - Ca2+ - mentes perfúzió - emésztés (kollagenáz...)
- mechanikai agitáció

38 L típusú kalcium áram

39 L típusú kalcium áram

40 L típusú kalcium áram

41 L típusú kalcium áram

42 L típusú kalcium áram

43 L típusú kalcium áram

44 L típusú kalcium áram

45 Áram-feszültség (I-V) karakterisztika
L típusú kalcium áram Áram-feszültség (I-V) karakterisztika anyag 5-10 perc 3-5 perc 10-15 perc kimosás előinkubáció