Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az immunrendszer sejtjeinek elválasztása 8. szeminárium.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Az immunrendszer sejtjeinek elválasztása 8. szeminárium."— Előadás másolata:

1 Az immunrendszer sejtjeinek elválasztása 8. szeminárium

2 Szeparálás eredményességét jelezi: tisztaság kinyerés avagy visszanyerés hatékonysága (veszteség) sejtek életképessége A számunkra érdekes sejtek fizikai elválasztása a heterogén populációból A különböző sejtek eltérő tulajdonságai alapján történik a szétválasztás (jó esetben ez a tulajdonság élő sejteken is megragadható – az élő sejtekkel további vizsgálatok végezhetők) fizikai – sűrűség, méret sejtbiológiai – adherencia, fagocitózis, érzékenység a közegre immunológiai – eltérő (sejtfelszíni) antigének Szeparáció

3 Kétféle alap hozzáállás: pozitív szeparáció – a kívánt sejtek megjelölése és elkülönítése a többitől Pl. a sejtek valamelyik felszíni molekuláját (receptorát!) fluoreszcens ellenanyaggal jelöljük. A sejteket a szeparálási procedúra körülményei mellett a receptorához között ellenanyag direkt módon befolyásolhatja! A pozitív szeparáció viszont gyakran nagyobb tisztaságot eredményez. negatív szeparáció – a nemkívánatos sejtek megjelölése, és megszabadulás tőlük A szeparálandó sejtet csak a procedúra egyéb körülményei befolyásolják. Funkcionális vizsgálatok esetében inkább ezt használják. Szeparáció

4 Sejtes elemek egyszerű elválasztása a vérplazmától: Szeparáció szűréssel (egyszerű membrán v. holofiber „membrán”) Pore diameter for plasma separation: 0.2 to 0.6μm Ember esetében a vér viszonylag egyszerűen hozzáférhető „alapanyag” az immunrendszer egyes sejttípusainak izolálásához Plazma szeparálásához használják

5 A sűrűségkülönbség miatt az alvadás gátolt vér idővel magától is három részre szeparálódik: alul: leülepedett vörösvérsejtek felül: sejtmentes vérplazma a kettő között a vörösvérsejtekre rétegződő buffy coat  fehérvérsejtek és vérlemezkék rétege A folyamat centrifugálással gyorsítható

6 Ha valamelyik alkotót valamilyen célból eltávolítják  Aferezis Aferezis (ógörög, ἀ φαίρεσις) -“elvétel” A szeparált komponensen kezelés végezhető és a többi komponenssel együtt visszaadható. Donációs célú aferezis Terápiás aferezis Donor aferezis: Plazmaferezis – feldolgozva (pl.IVIG) vagy friss fagyasztott plazmaként immundefficiens személyeknek vagy akut fertőzésekkor passzív immunizáláshoz Vérlemezkék (trombocitaferezis) – koncentrált formában örökletes vagy indukált trombocitopénia (fertőzések, kemoterápia, besugárzás) vagy trombocita diszfunkció esetén Vörösvérsejtek (eritrocitaferezis) - különféle anémiás betegek számára (örökletes vagy műtéti, baleseti, belső és külső vérzések esetében, sarlósejtes anémia) Leukociták (leukaferezis) – buffy-coat, főként autotranszplantációhoz pl. kemoterápiás kezelést megelőzően a leukociták védelme miatt monociták szeparálásához dendritikus sejt terápia céljára őssejt terápiás célra a csontvelői őssejtek mobilizációja után végzett leukaferezis (ugyanez az autológ és allogén csontvelő átültetés egyik lehetőségeként is szóbajöhet)

7 Terápiás aferezis: Vér abnormális oldott vagy sejtes komponensének eltávolítása Diszfunkcionális komponens eltávolítása és helyettesítése az egészséges donor aferezis termékeivel Vér komponensének megváltoztatása (ex vivo terápia) Leukaferezis – leukémiák esetében az extrém magas fehérvérsejtszám hemosztázis problémákhoz vezethet (nehéz légzés, látás zavarok), krónikus gyulladásos megbetegedéseknél csökkenthető vele a gyulladásos sejtek száma (colitis ulcerosa, rheumatoid arthritis) LDL aferezis – pl. familiáris hiperkoleszterinémia esetében (ApoB affinitás oszloppal, vagy acetátos kémiai precipitációval) Trombocitaferezis – esszenciális trombocitémia/trombocitózis esetén (trombózisok és vérzések) a diszfunkcionális magas trombocitaszám gyors csökkentése, az életveszély elkerülésére Eritrocitaferezis - pl. sarlósejtes anémiában sarlósejtes krízis felléptekor a rendellenes vvs- ek eltávolítása/cseréje Plazmacsere – autoimun betegségekben, az autoellenanyagokat tartalmazó plazma eltávolítása, és helyettesítése (immunszuppresszióval kombinálva) (pl. Myasthenia gravis, Guillain-Barré szindróma, lupus, Goodpasture szindróma, Antifoszfolipid antitest szindróma, Behcet szindróma, stb….) Immunadszorpció protein A v. G oszloppal – auto- vagy allo-ellenanyagok eltávolítása a plazmából autoimmun-, transzplantációs kilökődési- esetleg hemofíliás zavarokban protein A v. protein G oszlopon keresztül vezetéssel

8 Continuous Flow Centrifugation (CFC) Folyamatos áramú centrifugálás Régi típusú mosható/újra felhasználható aferezis centrifuga betét keresztmetszeti képe Folyamatos áramú aferezis rendszerek Megfelelő centrifugálási módszerrel trombociták és trombocita mentes plazma is kinyerhető F cf

9 Plasma Line RBC, WBC, PltLine WB Line Single Stage Channel (egy szeparációs terű) Eldobható, steril műanyag betétes centrifugák

10 Detail of Single Stage Channel

11 Platelet out Plasma out whole blood in RBC Line Dual Stage Separation Channel for plasma and platelet separation Second Stage First Stage Control Line (lásd a megjegyzésben) (kettős szeparációs terű, plazma és trombocita szeparálására is alkalmas)

12 Vérplazma előállítása szűréssel & WBC Vérplazma, vörösvérsejt készítmény és buffy coat előállítás folyamatos áramú centrifugálással Összegyűjtött platelet előállítása buffy coatokból

13 A vérből ilyen módon szeparált fehérvérsejtek még túl „szennyezettek” vörösvérsejtekkel további vizsgálatok számára Ficoll-Paque (1.077g/ml)

14 (Nature Protocols (from Google pictures)

15 Ficoll-Paque sűrűség alapú sejtszeparáció perifériás vér vékony pipettával a sejtek alá töltött Ficoll centrifugálás szeparált, tisztított sejtek plazma ficoll vvt-k mononukleáris sejtek (MNS, PBMC) neutrofil granulociták mononukleáris sejteket tartalmazó „gyűrű” átpipettázása

16 Percoll – neutrofil granulociták szeparálásához lépcsős vagy folyamatos pecoll gradiensen a neutrofil granulociták is elkülöníthetőek Romanian J. Biophys., Vol. 14, Nos. 1–4, P. 53–58, Bucharest, 2004 Physical chemical characterization of Percoll. I-III. Laurent, T.C. et al. Colloid Interface Sci. 76, 124–145 (1980).

17 Rozetta képzést felhasználva a Ficoll szeparáció felhasználható a nemkívánatos sejtek eltávolításához is ÉRDEKESSÉGKÉPPEN Negatív szeparáció

18 Az adherens sejtek kinyerése vagy eltávolítása (negatív és pozitív szeparáció) Olcsó, egyszerű, de csak az adherens sejtek elválasztására alkalmas, és alacsony tisztaságú

19 Ellenanyag ”panning” kitapasztott ellenanyagok (negatív és pozitív szeparáció)

20 Komplement mediált lízis ellenanyagok komplement LÍZIS (A vörösvérsejtek enyhén hipotóniás ammónium-klorid pufferben lizálhatóak) (negatív szeparáció)

21 Mágneses sejtszeparálás (MACS) paramágneses szemcse specifikus ellenanyag Egyszerű mágneses sejtszeparálás Fagocita sejtek apró vasszemcséket képesek fagocitálni, ezután egy erős mágnessel elválaszthatóak más sejtektől

22 MACS

23 Mágneses sejtszeparálás (MACS) MÁGNES oszlop Nem jelölt sejtek eltávolítása (negatív szelekció) jelölt sejtek kinyerése (pozitív szelekció)

24 Mágneses oszlop

25 CliniMACS – zárt rendszerű mágneses sejt szeparátor CliniMACS ® Prodigy „coming soon” CliniMACS Plus

26 A sejteket jelölő mágneses részecskék nagyon kicsik, a sejtfunkciókat általában nem befolyásolják CD8+ T cells „DETACHaBEAD” Az mágneses részecskékkel konjugált ellenanyagok Fab része ellen termeltetett poliklonális ellenanyagokkal (amelyek valószínűleg anti-idiotipus antitesteket is tartalmaznak) elérhető, hogy leváljanak a sejtekről. (kompetíció a sejtfelszíni antigén és az anti-idiotípus ellenanyag között)

27 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) elvileg bármely detektálható populáció kiválasztható, és elkülöníthető PMT 1 PMT 2 PMT 4 Laser Áramlási cella PMT 3 Minta fényszórás alapján specifikus fluoreszcencia alapján

28 CD antigénsejttípusfunkcióligand CD3T sejtek T sejt antigén receptor jelátvivő része (Intracelluláris kináz, foszfatáz) CD4helper T sejtek, (monociták, pDC) T sejt antigénreceptor koreceptora, (HIV receptor) MHC- II, HIV CD5T sejtek, (B sejt alpopuláció: B1) sejt adhézió, jelátvitel (kostimuláció) CD72 CD8citotoxikus T sejtek, (NK,  T sejt alpopuláció) T sejt antigénreceptor koreceptora MHC I CD14Monociták, makrofágok, granulociták egy része LPS receptor része LPS, LBP CD19B sejtek A CR2-vel (CD21) és a CD81 -gyel együtt a B sejt antigénreceptor koreceptor komplexe C3d, iC3b  CD21 a felismerő rész CD28T sejtek kostimuláció (B7-1, B7-2) CD80, CD86 CD34hematopoietikus progenitor sejt (endotheliális sejtek) sejt adhézió CD62L (L-szelektin) CD56NK sejtek, (T és B sejt alpopuláció) homoadhézió (N-CAM izoform) CD80, CD86 (B7-1, -2) professzionális APC: DC, B, monocita, makrofág kostimuláció, sejt adhézió CD28, CD152

29 Például: B1 sejtek elválasztása (CD19/CD5) NKT sejtek elválasztása (CD3/CD56) NK sejtek NKT sejtek limfociták Mágneses szeparálással hogyan lehetne ezt megcsinálni?

30 Az áramlási cella vibrációjának hatására folyadéksugár a frekvenciától függően, adott stabil helyen cseppekre bomlik breakoff point

31 Lézer vibráció Ha a szeparálandó sejt eléri a csepp-képződési pontot, a folyadéksugárra elektromos töltés kapcsolódik (arra a rövid időre), így a leváló csepp töltötté válik. Elektromosan töltött eltérítő lemezek Gyűjtőcső

32

33 Vége

34 Folyamatos áramú aferezis rendszerek A stacionárius (fent) és a forgó rész (lent) egymáshoz illeszkedő tárcsájának ábrázolása. (fekete pöttyök – lukak ahol a befolyó vér/elfolyó vérfrakciók csatlakozik) vörösvérsejtek bemenő teljes vér buffy coat (fehérvérsejt gazdag rész) plazma vissza a diához


Letölteni ppt "Az immunrendszer sejtjeinek elválasztása 8. szeminárium."

Hasonló előadás


Google Hirdetések