Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

ANTIGÉN, ELLENANYAG -immunogenitás, tolerogenitás -antigén fogalma -epitop (B-, T-sejt epitop) -haptén -hordozó -antigén prezentáció -T independens antigének.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "ANTIGÉN, ELLENANYAG -immunogenitás, tolerogenitás -antigén fogalma -epitop (B-, T-sejt epitop) -haptén -hordozó -antigén prezentáció -T independens antigének."— Előadás másolata:

1 ANTIGÉN, ELLENANYAG -immunogenitás, tolerogenitás -antigén fogalma -epitop (B-, T-sejt epitop) -haptén -hordozó -antigén prezentáció -T independens antigének -szuperantigének -immunoglobulinok -ellenanyag szerkezete -izotípusok -ellenanyagok funkciói -poliklonális és monoklonális ellenanyagok -passzív immunizálás -humanizált ellenanyagok -ellenanyagok felhasználása gyakorlat: -monoklonális ellenanyag termelő hibridóma sejt előállítása -sejtszámolás -gyorsklónozás -ellenanyagok tisztítása affinitás oszlopon

2 ANTIGÉN IMMUNOLÓGIAI FOGALOM Az adaptív immunválasz fogalomkörébe tartozik, B-, T-limfocitákkal, antigén receptorokkal, ellenanyagokkal kapcsolatban beszélünk antigénről. Szinte bármilyen kémiai szerkezet ((de olyan anyagok amik képesek fehérjékkel másodlagos kémiai kötést kialakítani!)) Oldott vagy részecske természetű Egyszerű vagy összetett Szervezetben képződő vagy külső környezetből bejutó Genetikailag saját vagy nem saját Természetes vagy mesterséges

3 Definíciók Antigén (Ag) - bármely olyan anyag, amelyet az érett immunrendszer felismer és vele szemben specifikus, fajlagos módon reagál (specifikus antigén receptor ismeri fel) Antigenitás: immunogenitás – az antigén képessége az (adaptív) immunválasz beindítására tolerogenitás – az antigén képessége az immunológiai tolerancia kiváltására, specifikus „immun-nemválaszolás” Ilyenek pl. a saját fehérjék

4 Az immunogenitást befolyásoló tényezők I. A szervezet szempontjából: Idegen-saját (immunogén-tolerogén) Genetikai háttér o faji hovatartozás (filogenetikai távolság: rokon fajoknak hasonlóak a fehérjéi) o egyéni különbségek (pl. MHC molekulák eltérései) Életkor (újszülött – még nincsenek reagáló sejtjei, időskor – nem képződnek új limfociták) A szervezet fiziológiai állapota (pl. immunodefficiencia, éhezés) Az antigén szempontjából: Az antigén fizikai-kémiai sajátságai o méret/komplexitás (nagyobb antigén  több epitop, „hordozó” szerepe) o korpuszkula (sejt, kolloid) vagy oldott o denaturált vagy natív (epitopok!) o lebonthatóság (antigén prezentáció APC által) Hozzáférhetőség (saját szemlencse fehérjék elzártak az immunrendszertől)

5 Az immunogenitást befolyásoló tényezők II. Immunizálási szempontból: Dózis Bevitel módja és útja –Intradermális/szubkután > intravénás > orális > intranazális (a sorrend függ az antigéntől is!) Adjuvánsok –fokozzák az immunrendszer antigén ingerre adott válaszát, de maguk nem immunogének pl: aluminiumsók, Freund-adjuváns, TLR ligandumok AZ ADJUVÁNS HATÁS ÖSSZETETT: depó hatás  az antigén hosszantartó jelenléte a természetes immunitás aktiválása járulékos sejtek aktivációja

6 Antigén (animált ábra) Antigén: amit az immunrendszer felismer, és vele specifikus módon reagál (antigén receptorokkal, ellenanyagokkal) Antigén determinánsok avagy epitopok: az antigén azon részei amihez az antigén receptorok vagy az antigén specifikus ellenanyagok közvetlenül kötődnek (másodlagos kémiai kötőerők)

7 Az antigén azon része, melyet egy meghatározott immunglobulin (B sejt receptor vagy ellenanyag) vagy T sejt receptor ismer fel. Antigén determináns avagy epitop Az antigénnek az antigén receptorhoz közvetlenül kapcsolódni tudó része

8 B sejt epitop T sejt epitop (B sejtek ismerik fel) fehérjék szénhidrátok lipidek nukleinsavak szteroidok stb. szöveti vagy oldott (T sejtek ismerik fel) peptidek (8-23 aminosav) (szigorú méretbeli kötöttség!) APC által történő bemutatás szükséges! (MHC molekulákon) glikolipidek, lipopeptidek - MHC szerű CD1 molekulák segítségével mutatja be az APC. A T sejtek néhány százaléka ismer fel ilyen antigéneket.

9 Antigén determináns (avagy epitop) az antigén azon része, amelyet egy adott immunglobulin (B-sejt receptor, ill. ellenanyag), vagy T- sejt receptor felismerni képes A KOMPLEX ANTIGÉNEK ELVI FELÉPÍTÉSE Hordozó az immunglobulinnal vagy T- sejt receptorral közvetlenül nem reagáló rész (immunizálással, vakcinákkal kapcsolatban kerül elő ez a fogalom) Ezek a fogalmak csak az antigén és egy adott immunglobulin vagy T-sejt receptor viszonylatában értelmezhetők!

10 Epitop és „hordozó” Ellenanyag 1. Ellenanyag 2. Epitop 1. „hordozó” (1.) Epitop 2. „hordozó” (2.) Antigén (animált ábra)

11 Az antigén bemutatás vázlatos folyamata antigén prezentáló sejt (APC) MHC IMHC II CD8+ Citotoxikus T sejt CD4+ Helper T sejt Endogén fehérjék Exogén fehérjék Az MHC molekulák chaperonnak tekinthetők, amik az antigénből származó (konformáció nélküli) peptid fragmentumot elnyújtott, stabilizált, bemutatható állapotban tartják a prezentáló sejt felszínén. (animált ábra)

12 Ab1 Ab2 rejtett/feltárt determináns denaturáció új/neoantigén determináns konformációs determinánsok hasítás konformációs/lineáris determinánsok AZ ANTIGÉN DETERMINÁNSOK TÍPUSAI lineáris determináns konformációs determináns (TCR, BCR, Ig)(BCR, Ig) sejtfelszíni/hozzáférhető determináns WB  SDS hatására eltűnhet a konformációs determinánsok egy része, de előkerülhetnek rejtett determinánsok

13 PepScan: Az antigénből származó peptideket (amik lehetnek egymással átfedő szekvenciájúak is) microarray-szerűségre viszik, és ezt reagáltatják a a tesztelendő ellenanyaggal. Konformációs epitopok esetében nem hatékony. T sejt epitopok esetében megfelelő antigén prezentáló sejtekhez adják a különböző peptideket, és figyelik mely peptidek esetében történik sejtaktiváció. Epitop térképezés (Epitop mapping) fehérje antigén (aminosavlánc) peptidek VLGTRNIPS Ala-Scan: Ha már ismert melyik peptidre specifikus az ellenanyag/T sejt, a peptid szekvenciában meghatározhatók a konkrét kontaktusokat kialakító aminosavak. Peptidszintézissel kisebb peptidkönyvtárak hozhatók létre. Az aminosavakat egyesével módszeresen eltérő egyszerű aminosavra pl. alaninra cserélik, és figyelik hogy történik-e változás az ellenanyag kötődésben/T sejt aktivációban. Genetikai módszerek: Site directed mutagenesis Phage display library ALGTRNIPS VLGARNIPS VLATRNIPS VGTRNIP A S stb.

14 Az LPS antigén vagy PAMP/DAMP? Antigén ha antigénreceptor v. ellenanyag ismeri fel PAMP ha mintázat felismerő receptor ismeri fel TLR4 MD2 LPS Fc Az LPS molekula egy glökózamin epitopját specifikusan felismerő ellenanyag Fab

15 A B sejtek antigén általi aktivációja gyakran csak segítő T sejtek jelenlétében lehetséges Vannak olyan antigének (pl. poliszaharidok) amik nem prezentálódnak citokinek Mindkét sejt aktivációjával jár B sejt aktiváció, memória CD40 antigén CD40L

16 B SEJT T INDEPENDENS ANTIGÉN TI-1 T INDEPENDENS ANTIGÉN TI-2 A B SEJTEK AKTIVÁLÁSA A T SEJTEK KÖZREMŰKÖDÉSE NÉLKÜL – „Tímusz independens antigének” Az antigén különböző részei a BCR-hez és más sejtfelszíni receptorokhoz (pl. LPS-kötő receptor /CD14) egyidejűleg kötődnek Sűrűn elhelyezkedő, ismétlődő, azonos epitópok (pl. szénhidrát komponensek a mikroorganizmusok falában) BCR keresztkötéseket hoznak létre B SEJT AKTIVÁCIÓ más aktivációs szignált biztosít az antigén receptoré mellett extenzív receptor keresztkötés/aggregáció jön létre

17 Baktériumok elleni immunizálásnál problémát jelent, hogy a vakcinában felhasználandó tisztított bakteriális poliszaharidok nem prezentálódnak, ezért nem aktiválnak T sejteket, így nem jön létre pl. memória B sejt válasz, ami a védettséget biztosítaná Ezért sok poliszaharid vakcinában a cukorláncokat immunogén fehérjéhez konjugálják, hogy T sejt dependens választ tudjon kiváltani. Egy ilyen célra használt fehérje a CRM197  módosított diftéria toxin (toxoid) (az eredeti fehérje egy aminosavát kicserélték (Glu  Gly) ami így nem toxikus) A toxoid megőrzi az immunogenitását és önmagában is képes lehet toxin ellenes blokkoló antitestek indukciójára. Gyakorlati példa (pl. Prevenar - pneumokokkusz vakcina) pneumokokkuszból származó poliszaharidok toxin Glu  Gly toxoid

18 B sejt poliszaharid segítő T sejt BCR TCRMHCII citokinek, CD40-CD40L toxoid toxoidból származó peptid A poliszaharid epitopot felismerő B sejt képes a hordozó fehérje peptidjeit prezentálni a T sejteknek poliszaharidot felismerő memória B sejtek (  ellenanyag termelő effektor sejtek)

19 hordozó + haptén Kis méretű molekulák, amelyek önmagukban nem képesek immunválaszt indukálni haptén (pl. DNP: dinitrofenil) ‒ + HAPTÉNEK Nem kellően immunogén anyagok immunogenitása is növelhető azok hordozóhoz kötésével. Ilyen történhet egyes gyógyszerekel, reaktív vegyületekkel – pl. gyógyszerérzékenység immunválasz

20 szabad hapténhordozóhoz kötött haptén Limfocita aktiváció sajátságai Az antigén receptorokhoz asszociált Src típusú protein kinázok aktivációjának első lépése „auto”foszforiláció. A receptoroknak egymás közelébe kell kerülniük (antigén általi keresztkötés/aggregáció) 0

21 hordozó specifikus haptén specifikus hordozó+haptén specifikus (konformációs epitop) hordozó+haptén ellenanyag/antitest A HORDOZÓHOZ KÖTÖTT HAPTÉNEK ELLEN IRÁNYULÓ ELLENANYAGOK TÍPUSAI

22 SZUPERANTIGÉNEK Mikrobiális fehérjék. Immunválasz elkerülő mechanizmusok egyik fajtája. Antigén prezentáló sejt (APC) jelenlétében sokféle Vβ típusú T sejt receptort (TCR) hordozó T-sejthez tudnak kötődni. Poliklonális aktiválást eredményeznek. A kötődés nem függ a TCR antigén specificitásától. Hagyományos antigén prezentáció MHC+peptid komplex A szuperantigén az MHC molekulán és a TCR-on nem a peptidkötő helyre kötődik, hanem „kívülről” kapcsolja össze az MHC molekulát a TCR-ral Az ilyen módon aktivált T sejtek anergiásakká válnak vagy aktiváció indukált sejthalál áldozatai lesznek

23 Szuperantigének Konvencionális Antigén Monoklonális/Oligoklonális T sejt válasz  klonális osztódás 1: :10 5 aktiválódó sejtek aránya Szuperantigén Poliklonális T sejt válasz és aktiváció indukált sejtpusztulás 1:4 - 1:10 aktiválódó sejtek aránya Fehérjék, melyek több – megfelelő TCR-t hordozó – T- sejthez tudnak kötődni és aktiválják azokat.

24 B sejt szuperantigének (sokan a szuperantigéneket csak a T sejtekkel hozzák összefüggésbe, pedig a B sejt szuperantigénak is nagyon hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek) Az ellenanyag molekuláknak nem az antigén kötő részéhez hanem valamely más részéhez kötődnek. (pl. Fc rész) Kötődésük független az ellenanyag molekula specificitásától A szuperantigénhez kötött ellenanyag nem képes effektor funkciókat aktiválni. Képes lehet a B sejtek poliklonális aktiválására (SpA)

25 SZUPERANTIGÉNEK OsztályozásForrás Endogén Exogén B sejt 1.Mouse mammary tomor virus (MMTV) (retrovírus, integrálódik a genomba  endogén) 2.Epstein-Barr virus asszociált szuperantigén (EBV) (az EBV valódi endogén retrovírális sz.antigént reaktivál)(HERV-K18, ERKV-18) 1.Staphylococcal enterotoxins (SEs): A, B, C1 to C3, D, E, G to Q 2.Staphylococcal toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1) 3.Staphylococcal exfoliative toxins: exoliatin A, exfoliatin B 4.Staphylococcal enterotoxin-like toxins formed due to recombination within enterotoxin gene cluster: U2, V 5.Streptococcal pyrogenic exotoxins (SPEs): A1 to A4, C, G to M 6.Streptococcal mitogenic exotoxins: SMEZ 7.Streptococcal superantigen :SSA 8.Yersinia pseudotuberculosis: Yersinia pseudotuberculosis-derived mitogen (YAM) 9.Mycoplasma species: Mycoplasma arthritidis-derived mitogen (MAM) 10.Cholera toxin: subunit A of cholera toxin 11.Prevotella intermedia* 12.Mycobacterium tuberculosis* 13.Viral superantigens: (a) Mouse leukemia virus (b) IDDMK1222- Ppol-ENV-U3 (c) HIV-Nef (d) Rabies virus-nucleoside protein 1.Staphylococcal protein A 2.Protein G 3.Protein Fv (PFv).

26 Az immunglobulinok (Ig) szerkezete és funkciója

27 Immunoglobulinok (glikoproteinek) Mobilitás alapján gamma-globulin Immunológiai funkció alapján antigén-specifikus fehérjék B sejt membránban antigén felismerő receptor BCR – B sejt receptor Testfolyadékokban (pl. szérum) ellenanyagok, antitestek

28 Az immunoglobulin szerkezete Könnyű és nehéz láncok Diszulfid hidak –láncok közötti –láncon belüli C H1 VLVL CLCL VHVH C H2 C H3 kapocs régió szénhidrát Variabilis és konstans részek Kapocs régió Domének –V L & C L –V H & C H1 - C H3 (C H4 pl. IgM) Oligoszaharid diszulfid híd immunoglobulin domén NH 2 COOH

29 Ribbon structure of IgG

30

31 ELLENANYAGOK IZOTÍPUSAINAK SZERKEZETI JELLEMZÉSE

32 Immunoglobulin fragmentek: Struktúra/Funkció összefüggések Fab ( F ragment a ntigen b inding) –Ag kötés (valencia=1 monovalens) –Specificitást a V H és a V L domének határozzák meg Papain Fc Fab Fc ( F ragment c rystallizable) –Effektor funkciók VHVH VLVL

33 Pepszin Fc peptidek F(ab’) 2 Immunoglobulin fragmentek: Struktúra/Funkció összefüggések F(ab’)2 –Antigén kötés bivalens! valencia=2 + Az effektor funkciók egy részét nem képes indukálni, de képes lehet pl. agglutinációra/precipitációra (lásd következő szeminárium)

34 Az immunglobulinok enzimes hasítása segített a szerkezet és funkció sajátságainak vizsgálatában antigén- kötés komplement kötő hely placentális transzfer kötődés az Fc receptorokhoz

35 Miért szükséges az Fc régió? felismerni az antigént precipitálni az antigént (bivalencia!) blokkolni a toxinok vagy patogénnel asszociált molekulák aktív helyét (neutralizáció) blokkolni a gazdasejt és a patogénnek molekulái közötti kölcsönhatásokat (neutralizáció) az F(ab’) 2 fragmentum képes sejtekkel kapcsolatos gyulladásos és effektor funkciókat a komplement rendszer gyulladásos és effektor funkcióit fagocitózist és az azt követő antigén prezentációs folyamatokat de Fc régió hiányában nem képes aktiválni

36 OSZTÁLY/ALOSZTÁLY ANTIGÉNKÖTŐ HELY A H-lánc (nehézlánc) konstans régiójának típusai, eltérő aminosav szekvencia Ig osztályok: IgG, IgA, IgE, IgD, IgM; alosztályok: IgA1-2, IgG1-4 (könnyűlánc izotípusok: κ, λ) A H- és L-lánc variábilis (V) régióinak egyedi szekvencia variabilitása (klón-specifikus) (Ez felel a sokféle antigén specifikus megkötéséért!) A konstans szekvenciákban található allélikus változatok IgG – Gm allélek Egyeden belüli típusok Egyeden belüli különféle antigéneket felismerő változatok Egyedek közötti változatok

37 Humán Immunglobulin Osztályok IgG - gamma (  ) nehézláncok IgM - mü (  ) nehézláncok IgA - alfa (  ) nehézláncok IgD - delta (  ) nehézláncok IgE - epszilon (  ) nehézláncok könnyűlánc típusok kappa (  ) lambda (  ) Izotípusok!

38 A izotípusok között funkcionális különbségek vannak vagy hexamer

39 Szabad IgM pentamer (”csillag”) Antigénhez kötött IgM (”rák”) Az ellenanyagok valenciája (kötésszáma) vagy 12

40

41 szekunder válasz az A antigénnel szemben primer válasz az A antigénnel szemben ellenanyagszint napok primer válasz a B antigénnel szemben Izotípusok a primer és szekunder immunválasz során Miért pentamer/hexamer a szolubilis IgM molekula?

42 Az antigén determináns és az ellenenyag antigénkötő ”zsebe” közötti kölcsönhatás modellje A kapcsolatok kialakításáért a leginkább a variábilis régión belüli hivervariabilis részek felelősek

43 Complementary Determining Region (CDR) aminosav pozíció az Ig-lánc szekvenciájában Variábilitás (a különböző aminosavak száma)

44 AZ ELLENANYAGOK EFFEKTOR FUNKCIÓI neutralizáció antigén kijelölése az effektor mechanizmusok számára

45 Az ellenanyagok effektor funkciói

46 Későbbi szeminárium

47 NEUTRALIZÁCIÓ (az antigén kötéssel direkt módon összefüggő funkció) Immunizálás során a szervezetben képződő, vagy a passzív immunizálás során bejuttatott ellenanyagok így védenek: pl. vírusfertőzésk ellen, vagy toxinok hatását blokkolhatják, vagy baktériumok adhézióját gátolhatják az epitélsejteken (pl. vírus receptor és gazdasejt kapcsolódásának allosztérikus gátlásával) A sejtek károsodnak/fertőződnek A sejteket megvédik a patogént/toxint neutralizáló ellenanyagok

48 Fc receptor mediált funkciók Fc γR : Fc εR : Fc αR : γ  IgG kötés ε  IgE kötés α  IgA kötés FcRn„neonatális” Fc receptorPlacenta, epitél sejtek, stb.IgG transzfer pIgRpoli Ig receptorepitél sejtekIgA, IgM transzfer Fő FcR típusok:

49 OPSZONIZÁLÁS Opszonizáció nélkül a fagocitózis nagyságrendekkel kisebb hatékonyságal megy végbe

50 Az ellenanyag kötődis a sejtfelszíni antigénhez Az NK sejtek receptorai érzkelik a kötött ellenanyagokat Az Fc-receptor keresztkötések aktiválják az NK sejt ölőmechanizmusait A célsejt apoptózissal elhal nagyméretű sejt/patogén ellenanyaggal borítva Citotixikus granulumok tartalmának ürítése Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC) antitest függő celluláris citotoxicitás

51 Az előző ábrákon az ellenanyagok (több ellenanyag!) először hozzákapcsolódtak az antigénhez, és a kis affinitású Fc receptorok csak így voltak képesek kellően erős aviditással hozzákötni az antigén-antitest komplexhez. A nagy affinitású Fc epszilon receptor képes szabad IgE molekula megkötésére is

52 FcεR általi HÍZÓSEJT DEGRANULÁCIÓ KIVÁLTÁSA antigén specifikus IgE ellenanyagokkal patogén eliminálása (allergiás tünetek) degranuláció IgE ellenanyaggal „felfegyverzett / szenzitizált” hízósejt Az FcεR-ok keresztkötése a specifikus IgE molekulákhoz kapcsolódó patogénen/allergénen keresztül

53 Ellenanyag izotipusok kapcsolata az effektor funkciókkal

54 Epitéliális sejt J C C S S S S C C S S S S C C ss A poli Ig receptor, a szekretoros IgA és a transzcitózis J C C S S S S C C S S S S C C ss J C C S S S S C C S S S S C C ss J C C S S S S C C S S S S C C ss A pIgR és az IgA internalizációja A pIgR elhasadása teszi lehetővé az IgA leválását, ami a továbbiak során ezt a receptor darabot mint – szekretoros fragmentumot hordozza J C C S S S S C C S S S S C C ss Az IgA és pIgR aktív folyamat révén vezikulákban átkerül az apikális felszínre A szubmukóza B sejtjei dimer IgA-t termelnek B A “poli Ig receptorok” (pIgR) az epiteliális sejtek bazolaterális felszínén találhatóak. Az itt található IgA (és IgM) ellenanyagokat szállítják az apikális felszínre bélrendszer, légzőrendszer nyálkahártya felszín

55 Mit szállít a pIgR? J lánccal rendelkező (polimer) izotípusokat: IgA, IgM (ez a J lánc nem összekeverendő a VJ/VDJ átrendeződés J régiójával!!!) Hova szállít? bél- és légzőrendszeri felszínek, szekrétumok (nyál, anyatej)

56 Anyai IgG a magzatban: az IgG placentális transzportja A neonatális Fc  receptor Humán Fc  RnHumán MHC Class I A placenta sejtek felveszik az anyai ellenanyagokat az anyai keringésből. Az endoszóma savas közegében az FcRn megköti az IgG-t, átszállítja a foetális oldalra, és az ott levő neutrálisabb pH hatására elengedi azokat. (Az FcRn és az MHC I molekula szerkezeti rokonságban áll)

57 FcγRn (neonatalis Fc receptor) IgG és albumin szállítására képes. Különféle sejttípusokon van jelen: -endothel sejtek -epiteliális sejtek (emésztő és légutak) újszülött rágcsálók bélrendszerében 100x magasabb az expressziója mint az egyedfejlődés későbbi részében -immunrendszer sok sejttípusa, APC-k

58 FcRn (Fc γ Rn) működése pinocitózis Az urogenitális traktusban, a rektumban és a felső légutak egy részében több az IgG, mint az IgA. Dendritikus sejtek cross-prezentációs folyamatában is lényeges szerepe van.

59 Az FcRn miatt az IgG szérum féléletideje kiugróan magas Fc γ Rn túlexpresszáló transzgenikus állatokban nagy mennyiségű ellenanyagot termeltethetünk

60 hcIgG: tevefélék (Camelidae) teve, dromedár, láma IgG: ember, egér, patkány Nehéz láncú ellenanyag (hevy chain Ig, hcIg) immunoglobulin new antigen receptor (IgNAR): porcos halak, cápák V H H fragment/nanobody antigén (lizozim)

61 MONOKLONÁLIS ELLENANYAGOK és POLIKLONÁLIS ELLENANYAGOK

62 A TERMÉSZETES ELLENANYAG VÁLASZ POLIKLONÁLIS Ag Immunszérum Poliklonális ellenanyag Ag B-sejt készlet Aktivált B-sejtek Ellenanyag termelő plazmasejtek Antigén-specifikus ellenanyagok (Több klón termékei, különféle epitopokat ismerhetnek fel)

63 Antigén specifikus ellenanyagokhoz legegyszerűbben immunizált élőlények szérumából juthatunk. Hosszú távon újabb és újabb immunizálást igényel. - Nehezen standardizálható - Limitált mennyiségben áll rendelkezésre Ha fel tudnánk szaporítani valamelyik B sejtet, ami „felismeri” az antigént, sokkal egyszerűbb volna a helyzet. Monoklonális ellenanyagok előállítása

64 Antigén Poliklonális ellenanyagok Monoklonális ellenanyagok (animált ábra)

65 Monoklonális ellenanyagok  egyetlen B-limfocita klón termékei  homogének (antigénspecifitás, affinitás, izotípus)  előnye a poliklonális ellenanyaggal szemben, hogy a meghatározott specificitású és izotípusú ellenanyagok nagy mennyiségben és azonos minőségben állíthatók elő - „in vivo” patológiás körülmények között is előfordulhat pl. mieloma multiplex esetében egy B sejt klón malignus szaporulata miatt nagy mennyiségű monoklonális ellenanyag lehet jelen („gammopátia” – rendelleneség a gamma globulin szérum frakcióban) osztódóképes – tenyészthető, egyféle ellenanyag termelő sejteket kellene előállítani

66 A szérum elektroforézise monoklonális fehérje jelenlétét mutatja ki, amely további vizsgálattal lambda-könnyűláncú IgG-nek bizonyult. normál szérum a beteg széruma Myeloma multiplex

67 Lehetőségek? Transzformáció/immortalizálás vírussal - A vírus ott lesz a termékben is EBV – humán B sejteket transzformál/immortalizál - Az antigén specifikus klónok elkülönítése körülményes

68 Lehetőségek? Fúzió immortális sejtvonallal Követelmények a fúziós partnerrel szemben -ne legyen saját ellenanyag termelése -ne befolyásolja a B sejtek ellenanyag termelését -szelektálhatóság: könnyen megszabadulhassunk a felesleges, nem ellenanyag termelő sejtektől Kevés jó fúziós partner létezik: Egér: Sp2/0-Ag14 (SP2) Humán: nincs igazán jó általános fúziós partner! heteromielómákat, triómákat használnak fúziós partnerként: (maga a fúziós partner is 2-3 sejt hibridje - gyakran egér-humán hibrid) CB-F7, K6H6B5, H7NS, NAT-30, HO-323, A4H12

69 Lehetőségek? Mikromanipuláció (műszerigényes) „FuCell”

70 -Előre szelektált antigén specifikus B sejttel történik (jelölt antigénnel festés) -A B sejtet kontaktusba hozzák a fúziós partnerrel -Elektromos tér segítségével történik a fúzió -Mivel nem szükséges szelektálni, jóval többféle humán fúziós partner szóba jöhet (szinte bármely immortális sejtvonal megfelelő) B sejt fluoreszcens/paramágneses jelzés antigén A fúzió folyamata

71  A számunkra értékes tulajdonsággal rendelkező, de korlátozott élettartamú immunsejtet kiválasszuk, és korlátlan ideig fenntarthatóvá, szaporíthatóvá tegyük.  Antigén specifikus immunsejteket fuzionáltatunk korlátlanul szaporodó tumorsejtekkel. A kapott hibridek közül számunkra azok értékesek, amelyek kromoszomálisan stabilak, rendelkeznek az adott immunsejt tulajdonságaival (ellenanyag termelő vagy APC felismerő* képesség) és korlátlanul szaporodnak. * antigén specifikus, citokin termelésre képes, T sejt hibridómák is létrehozhatóak  A megfelelő hibrid sejteket többlépéses szelekció végeredményeként, sejtklónok formájában kapjuk meg. Monoklonális ellenanyagok előállítása (Több módszer is létezik. A leg elterjedtebb: egér SP2 sejtvonallal végzett sejtfúzió alapú „hibridóma” módszert tekintjük át a következőkben) Georges J.F. Koehler és Cesar Milstein (Nobel díj 1984-ben) A hibridóma technika

72 Monoklonális ellenanyag előállítás menete Vázlatosan - egér/patkány beoltása antigénnel - a célsejteket tartalmazó lép vagy nyirokcsomók izolálása, homogenizálása - lépből származó plazmasejtek és B-sejt eredetű egér tumorsejtek (plazmacitóma/ mielóma sejtek) fúziója - Az ellenanyag termelő klónok szelekciója/azonosítása (több lépésben) A létrejövő hibridómák folyamatosan szaporodnak és ellenanyagot termelnek, ami a tápoldatukból kinyerhető (1.) (2.)

73 lépsejtmielómasejt (SP2) Napok alatt maguktól elpusztulnak Szaporodó sejtek Sejtfúzió (animált ábra) PEG, Sendai virus, mikromanipulátor+nagyfrekvenciás elektromágneses mező

74 mielómasejt (SP2) Szaporodó sejtek Szelektív tápfolyadék („HAT”) érzékeny HGPRT + TK + lépsejt 1. szelekciós lépés HGPRT - TK - (animált ábra) a normál sejtek napokon belül elpusztulnak

75 Antigén specifikus ellenanyagot termelő hibridek Nem antigén specifikus ellenanyagot termelő, vagy ellenanyagot nem termelő hibridek 2. Szelekciós lépés: Az ellenanyag termelő sejtek kiválasztása Vannak a sejtkultúrában az antigénnel reagálni képes ellenanyagok. Nincs jelen az antigénnel reagálni képes ellenanyag. Eldobjuk Tovább tenyésztjük, sejtklónozzuk. (animált ábra)

76 A sejtklónozás célja Különféle monoklonális ellenanyagokat termelő B sejt hibridóma klónok közül az antigénre specifikusakra van szükségünk (ellenőrzés pl. ELISA módszerrel – lásd a későbbi gyakorlatokon) (animált ábra) A kapott hibridómák összessége poliklonális ellenanyag keveréket termelne, melyek között előfordul antigénre nem specifikus is

77 A „HAT” szelekció biokémiája Hipoxantin, Aminopterin, Timidin tartalmú tápfolyadék nukleotid prekurzor gátlószer A szelektív tápfolyadék:

78 ”de novo” útvonal ”salvage” útvonal aminopterin nukleozid trifoszfátok DNS ”elemi” építökövek, egyszerü szerves anyagok, aminosavak, cukrok egyéb enzimek nukleinsav lebontási termékek felhasználása, purinok, hipoxantin, timin HGPRT, TK (hipoxantin guanin foszforibozil transzferáz, timidin kináz) A DNS szintézis két fő útja (animált ábra) Az SP2 mielóma sejtekben csak ez a „de novo” útvonal működőképes! (HGPRT ‒, TK ‒ )

79 A fúziós partner SP2 sejtvonalnak nincs saját ellenanyag termelése, és nincsenek HGPRT és TK enzimei. Ez teszi ideális fúziós partnerré! Technikai nehézségek: A transzformált sejtvonalak sajnos gyakran genetikailag instabilak. Ez a létrehozott hibridómákra is igaz. Rendszeresen ellenőrizni kell az ellenanyag termelésüket és antigénspecificitásukat – adott esetben újraszelektálni/klónozni Megtörténhet, hogy az SP2„magához tér”és aktív HGPRT és TK jelenik meg benne! Az ilyen SP2 sejtektől egy másik fajta szelekcióval szabadulhatunk meg:

80 ”Abortív” hipoxantin és timidin analógokkal HGPRT - és TK - fúziós partner sejtek szelektálhatóak Ezek a pirimidin és purin vegyületek a HGPRT + vagy TK + sejtek esetében osztódáskor a ”salvage” útvonalon az örökítőanyagba épülve a sejtek pusztulásához vezetnek, élve hagyva a HGPRT - TK - sejteket. Hogyan hozható létre/tartható fent a HGPRT -, TK - (defficiens) fúziós partner sejtvonal?

81 Poliklonális ellenanyag Kis affinitású Monoklonális Ea. Nagy affinitású Monoklonális Ea. Felismert antigén determinánsok száma többegy Specificitás (keresztreaktivitás) polispecifikusgyakran polispecifikusmonospecifikus Affinitáskicsi-nagy (keverék) kicsinagy Nem-specifikus immunglobulinok koncentrációja magasalacsony (0) Hozam (koncentráció)magasalacsony Előállítási költségalacsonymagas Standardizálhatóságnem, ill. nehézkesegyszerű Mennyiséglimitáltkorlátlan Gyakorlati felhasználhatóság módszer függőgyengekiváló A poliklonális és monoklonális ellenanyagok összehasonlítása

82 Monoklonális ellenenyagok általános felhasználási lehetőségei - Immundiagnosztika (tumordiagnosztika - tumor spec mEA-gal) - Sejttípusokra jellemző markerek azonosítása (differenciációs, aktivációs markerek) Immunhisztokémia Lymphomák tipizálása CD markerek segítségével - Sejtek elválasztása (pozitív – negatív szelekció –FACS, Panning, vasszemcsék mágneses térben) CD34+ csontvelői őssejtek gyűjtése autológ/allogén transzplantációhoz perifériás vérből - Vércsoport meghatározás (anti-A, anti-B, anti-D ellenanyagokkal) - Komplex antigén keverékek analizálása (Western, ELISA……) - Sejtfelszíni és oldott molekulák funkcionális vizsgálata T-sejt aktiváltsági állapot vizsgálata / gátlása - Célzott kemoterápia CD20+ B-sejtek elleni antitestek B-sejtes Non-Hodgkin lymphomában Szervátültetés utáni kilökődés megakadályozása célzott T-sejt gátlással Kovalensen kapcsolt, liposzómába zárt toxin - Gyógyszer-eliminálás antitestekkel Digoxin-intoxikáció esetén digoxin ellenes antitestek

83 VÉDETT EGYÉN szérum ellenanyag (pl. véradás  vérkészítmény) Humán immunglobulin transzgenikus egér immunizálás egér monoklonális ellenanyagok immunizálás humán monoklonális ellenanyagok humanizált, egér monoklonális ellenanyagok Passzív immunizálás I. VESZÉLYEZTETETT EGYED Az adaptív immunrendszer nem aktiválódik Azonnal hat Átmeneti védelem/hatás (Immunoglobulin lebomlás!)

84 Passzív immunizálás II. TípusAlkalmazás Intramuszkuláris (kis mennyiségben jut be, kevésbé hatékony) HBV-Ig; Varicella-Zoster-Ig; Anti-D profilaxis Intravénás (IVIG)Humorális immundefektusok (Bruton-féle agammaglobulinaemia; hypogammaglobulinaemiával járó variábilis és kevert immundefektusok ) Méreg elleni ellenanyagok (pl. kígyómarás) Természetes passzív immunizálás: Placentán átjutó IgG – újszülött védelme az első hónapokban Anyatej: IgA – emésztőrendszer és a felső légutak védelme

85 Poliklonális ellenanyagok terápiás felhasználása mérgek elleni antiszérumok (Antivenom) kígyók, skorpiók, pókok, mérges tengeriherkentyűk mérgei elleni antiszérumok nagyméretű állatok fokozatos hiperimmunizációja (általában lovak) tisztított immunglobulin frakció kinyerése a plazmából - csökkenti az immunizálódás valószínűségét és mértékét; a többi szérumfehérje hiányában esetleg többszöri terápiás immunizálás is lehetséges

86 Monoklonális antitestek, mint beadható gyógyszerek? Az egérben termelődő antitestek emberbe oltva - fajidegen fehérjeként - immunválaszt indukálhatnak. (ld. immunogenitást meghatározó tényezők – filogenetikai távolság!) Hogyan kerülhető meg a probléma?

87 A monoklonális antitestek evolúciója Egér / Patkány Kiméra Humán Humanizált A humanizált ellenanyagok glikozilációja a termelő sejttípus (álalában egér) sajátságainak megfelelő. Létrehozhatók valódi humán monoklonális ellenanyagok humán hibridómák segítségével.

88 - Tumorterápia Lehetővé tették a célzott, szelektív kemoterápia következő lépcsőfokának elérését (Sejttípus-specifikus, de még mindig nem csak a malignus sejtekre specifikus!) -Immunszuppresszió Sejttípusra specifikus immunszuppresszió lehetősége Gyógyszerként alkalmazott monoklonális ellenanyagok

89 Monoklonális ellenanyagok a tumorterápiában 1.„Naked MAb”, nem konjugált antitest Anti-CD20 (rituximab – Mabthera/Rituxan, humanizált): B-sejtes Non-Hodgkin lymphoma Anti-CD52 (alemtuzumab – Mabcampath, humanizált): chronicus lymphoid leukaemia (3. vonalban, chlorambucil és fludara rezisztens esetekben) Anti-ErbB2 (trastuzumab – Herceptin, humanizált): emlőtumor Anti-VEGF (bevacizumab – Avastin, humanizált): colorectalis tu. (+ Lucentis!) Anti-EGFR (cetuximab – Erbitux, kiméra): colorectalis tu. (+ Vectibix, rekomb. humán!) 2.konjugált antitest Anti-CD20 + yttrium-90 izotóp (ibritumomab- Zevalin) Anti-CD20 + jód-131 (tositumomab – Bexxar, kiméra!)

90 Immunszuppresszív ellenanyagok 1.Anti-TNF-α antitestek infliximab (Remicade): 1998 óta, kiméra adalimumab (Humira): 2002, rekombináns humán 2.Etanercept (Enbrel) – dimer fúziós fehérje, TNF-α receptor + Ig Fc-vég (Nem monoklonális antitest, csak Ig Fc-véget tartalmaz!) Anti-TNF-α terápia indikációi: Rheumatoid arthritis Spondylitis ankylopoetica (SPA - M. Bechterew) Plakkos psoriasis, arthritis psoriatica Crohn-betegség, colitis ulcerosa (általában - még - nem 1. vonal!)

91 Terápiás monoklonális antitestek elnevezése A gyógyszerként használt monoklonális antitesteket generikus névvel illetik. A nevezéktan sémáját a WHO határozza meg. A nevezéktan részei: Például:Abciximab  ab- + -ci(r)- + -xi- + -mab, egy kardiovaszkuláris megbetegedésekben használt monoklonális kiméra ellenanyag.Abciximab

92 virus-v(i)--vi(r)- miscellaneous tumor-tu(m)- prostate tumor -pr(o)- melanoma-me(l)- mammary tumor-ma(r)- ovarian tumor-go(v)- testicular tumor-go(t)- colonic tumor -t(u)- -co(l)- toxin-tox(a)--toxa- bone-s(o)--o(s)- rat/mouse hybrid (see trifunctional antibody)trifunctional antibody -axo- nervous system-n(e)-*-ne(u)(r)- chimeric/humanized hybrid-xizu-*musculoskeletal system—-mu(l)- humanized-zu-immune system-l(i)--li(m)- chimericchimeric (human/foreign)-xi-inflammatory lesionslesions—-le(s)- human-u-interleukin-k(i)--ki(n)- mouse-o-fungus-f(u)--fu(ng)- primate-i-circulatory system-c(i)--ci(r)- hamster-e-bacterium-b(a)--ba(c)- rat-a-angiogenesisangiogenesis (inhibitor)—-anibi- variable meaning newold Source substemTarget substemPrefix 'Suffix' (stem) -mab

93 Ellenanyag tisztítás antigén immunszorbensen (Affinitás kromatográfia) oszlop polimer gyöngyök rákötött antigének oszlop töltelék affinity purifed antibody : a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják.

94 tisztítandó ellenanyagok hozzáadása kötődés elúció mosás Antigén specifikus poliklonális ellenanyag (animált ábra)

95 Fehérje(antigén) tisztítás ellenanyag immunszorbensen polimer gyöngy hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok oszlop oszlop töltelék Fordítva is összeállítható a rendszer: Tisztítandó oldat felvitele Kötődés Mosás Elúció Tisztított antigén (animált ábra)

96 Immunprecipitáció (Nem azonos az antigén- ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos immunológiai reakcióknál tárgyalt precipitációs jelenséggel!!!)

97 gyakorlat

98 A POLIKLONÁLIS ELLENANYAG VÁLASZ Ag Immunszérum Poliklonális ellenanyag Ag B-sejt készlet Aktivált B-sejtek Ellenanyag termelő plazmasejtek Antigén-specifikus ellenanyagok

99 Immunoszorbens Oszlop sepharose gyöngyök BSA

100 Tisztítandó nyúl szérum hozzáadása Inkubáció (animált ábra)

101 Coomassie Brillant Blue G250 festék Nem kötődő fehérjék lemosása PBS Ha nem jön le több fehérje (pl. aspecifikus ellenanyag), a Coomassie festék barna marad. (animált ábra)

102 4-5 ml glicin-HCl pufferrel mosni Kötődő ellenanyagok eluálása az oszlopról TRIS-t tartalmazó csövekbe gyűjtjük 9-10 cseppenként a frakciókat, hogy a pH neutralizálódjon Arról, hogy a farkciószedés közben és végén az oszlopról jön-e még le fehérje, egy-egy Coomassie Brillant Blue-t tartalmazó csőbe cseppentéssel győződhetünk meg (animált ábra)

103 Monoklonális ellenanyagokat a sejtkultúra folyadékból („felülúszóból”) Bakteriális protein A v. protein G oszlopokkal lehet hatékonyan tisztítani. Protein A, Protein G  az ellenanyagok Fc részét kötik meg (a baktérium így is védekezik az ellenanyagok általi felismerés ellen: lekötött Fc rész  nincs effektor funkció)

104 Felező hígítások Újra klónozás limitált hígításos módszerrel (gyorsklónozás): 1. a hibridóma sejteket megszámoljuk lyukú szövettenyésztő lemezre lyukanként 100  l tápfolyadékot kimérünk, majd az első lyukába (A1) sejtet 100  l-ben hozzáteszünk. Belőle felező hígításban a szövettenyésztő lemez-en lefelé, majd oldalirányban is hígítást végzünk: 100  l tápfolyadék/lyuk található a szövettenyésztő lemezen; Az első oszlopban a sejteket tartalmazó (A1-es) lyukból kivett 100ul sejtszuszpenziót hígítjuk lépésekben lefelé, majd az első oszlop lukait 200  l-re kiegészítjük. Ezután sokcsatornás pipettával hasonló módon sorozathígítást végzünk oldalirányban is) A szövettenyésztő lemez jobb alsó részén, így nagy valószínűséggel lesznek olyan lukak, amelyekbe csak 1 db sejt került. Felező hígítások

105 a megszámolt sejtek száma × 10 4 × a korábbi hígításokkal =sejtszám/ml 25 négyzet (pirossal jelölve egy példa) vagy a hármas vonalak által a halványpirossal jelölt módon határolt terület nagysága: 1 mm 2 A fedőlemez és a kamra felület távolsága: 0.1 mm Az így kapott térfogat: 0.1 mm 3 = cm 3 (ml) Bürker kamra (3x3db 4x4-es rács)


Letölteni ppt "ANTIGÉN, ELLENANYAG -immunogenitás, tolerogenitás -antigén fogalma -epitop (B-, T-sejt epitop) -haptén -hordozó -antigén prezentáció -T independens antigének."

Hasonló előadás


Google Hirdetések