Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK."— Előadás másolata:

1 ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK

2 Immunaffinitás kromatográfia ELISA – Enzim kötött immunszorbens esszé ELISA plate különböző koncentrációjú mintákkal a szubsztrát hozzáadását követően ELISA plate különböző koncentrációjú mintákkal az enzimreakció leállítását követően

3 AZ IMMUNOESSZÉK ÉRZÉKENYSÉGE

4 ELLENANYAG TISZTÍTÁS ANTIGÉN IMMUNSZORBENSEN oszlop polimer gyöngyök rákötött antigének oszlop töltelék „affinity purified antibody” : a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják

5 1)Tisztítandó ellenanyagok hozzáadása 2)Kötődés 3)Mosás 4)Elúció A TISZTÍTÁS LÉPÉSEI

6 hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok oszlop oszlop töltelék Tisztított antigénANTIGÉNTISZTÍTÁS 1)Tisztítandó oldat felvitele 2)Kötődés 3)Mosás 4)Elúció polimer gyöngy

7 IMMUNPRECIPITÁCIÓ egy adott fehérje izolálása és koncentrálása sok fehérjét tartalmazó mintákból fehérje kölcsönhatások vizsgálata (pl. jelátvitelben résztvevő molekulák vizsgálata)

8 ELISA plate (lemez) lyuk avagy kút Különböző lemezek – különböző természetű molekulákhoz ELISA Enzyme Linked Immune Sorbent Assay

9 enzyme linkedimmune sorbent ellenanyaghoz konjugált enzim enzim felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok

10 AZ ELISA VIZSGÁLATBAN AZ MENNYISÉGÉVEL ARÁNYOS MÉRTÉKŰ VÁLTOZÁST DETEKTÁLUNK Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén- ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay

11 AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Direkt módszer Indirekt módszer Antigén Primer ellenanyag Jelzés Szekunder ellenanyagok

12 AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Enzim-antienzim rendszer PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz Antigén Primer ellenanyag Szekunder ellenanyag (faj v. izotípus specifikus) A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyag Enzimek

13 AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni Egyszerű ABC Antigén Biotinált ellenanyag Avidin Avidin-enzim komplexek Biotin-enzim komplex Avidin Biotin Complex Jel felerősítése

14 Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. liquor). nem kötődő anyagok kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges fehérjék kimosása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása felesleges ellenanyagok kimosása avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása citokin tartalmú minta hozzáadása felesleges konjugátum kimosása KOMBINÁLT „SZENDVICS” ELISA

15 EGYSZERŰ INDIREKT ELISA LÉPÉSEI Antigén specifikus ellenanyag, vagy az antigén egyszerű kimutatásához az antigén kitapasztása (coating avagy fedés) felesleges antigén kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges fehérjék kimosása specifikus ellenanyagok hozzáadása enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása felesleges ellenanyagok kimosása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával - rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid segítségével HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid

16 KOMPETITÍV ELISA Érzékenysége miatt szolubilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez. - A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás - Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazóvagy nem tartalmazó minta hozzáadása - Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés - Mosás - Kromogén anyagok hozzáadása

17 koncentráció Ismeretlen koncentrációjú minta OD A standard hígítási sora Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne ? Az összehasonlíthatósághoz az ismeretlen mintából is hígításokat kell csinálni! Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani.

18 BIOAKTÍV ANYAGOK KIMUTATÁSA hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek Tumor antigének kimutatása Citokinek, hormonok kimutatása doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása szendvics technikával vagy kompetitív tesztekkel

19 TUMORDIAGNOSZTIKA A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak Tumor antigén (pl. a beteg szérumából) Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor Ag specifikus capture ellenanyaggal (a kit része) fedett felület Prosztata daganatok prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hiperpláziás (BPH) és prosztatitiszes páciensekben  nem specifikus, de a PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával (monitorozásra alkalmas) hasonlóan felhasználható a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

20 AZ ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK immunoblot (Western blot) immunhisztokémia

21 WESTERN BLOT Lépések: 1)minta előkészítés (szöveti vagy sejtes) 2)gél elektroforézis 3)blotolás 4)jelölés 5)előhívás Felhasználás: fehérje keverékek egyes komponenseinek ellenanyag segítségével történő kimutatására Anode(+) Cathode(-)

22 Az egyik leggyakrabban alkalmazott olyan módszer a molekuláris biológiában amiben ellenanyagokat használnak SDS-PAGE gél  a minta fehérje komponenseinek elválasztása molekulatömegük alapján (átfedés is lehetséges) Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik Standard Protein minta SDS-PAGE Membrán Western blot Fehérje detektálás specifikus ellenanyag- epitóp kölcsönhatás alapján WESTERN BLOT

23 Segítségével egy adott fehérje jelenléte kimutatható a mintában Az egymástól elektroforézissel elszeparált fehérjéket /Nátrium-Dodecyl Szulfát- Polyacrylamid Gélelektroforézis (SDS- PAGE)/, membránra transzferálják Primer ellenanyagot (monoklonális vagy poliklonális) használnak a vizsgált fehérje kimutatásához Enzimmel (pl. torma-peroxidáz) konjugált szekunder ellenanyag segítségével mutatják ki a primer ellenanyag kötődését WESTERN BLOT

24 Kimutatási eljárások: Kolorimetriás (peroxidáz enzim – denzitometria / spektrofotometria) Kemilumineszcens (ECL) Radioaktív (izotóp – RTG) Fluoreszcens (jelölés – CCD camera)

25 Fab Fc Epitóp a protein felszínén Primer ellenanyag Szekunder ellenanyag Torma- peroxidáz Immobilizált proteinek Membrán H2O2H2O2 H2OH2O luminol enhancer h detektálás MEGNÖVELT KEMILUMINESZCENCIA /Enhanced chemiluminescence (ECL)/ H 2 O 2 jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidálja a diacilhidrazidokat (pl luminol) Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával detektálható A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák (pl 6-hidroxi-benzothiazol) jelenlétében körülbelül 1000-szeresére növelhető (enhancer) luminol

26 IMMUNCITOKÉMIA / IMMUNHISZTOKÉMIA Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban Immunfluoreszcencia fluoreszcensen jelzett ellenanyag FITC – fluoreszcein izotiocianát (zöldessárga) PE – fikoeritrin (narancssárga) Immunoenzim módszer enzimmel konjugált ellenanyag P – peroxidáz AP – alkalikus foszfatáz ( a szubsztrátból oldhatatlan, színes csapadékot képeznek)

27 Szövetminta FIXÁLÁS Festés előtti metszet FAGYASZTÁS METSZÉS IMMUNHISZTOKÉMIA

28 IMMUNHISZTOKÉMIA Avidin Szövetmetszet Sejtek (sejttenyészetek) Tárgylemez Primer antitest Biotin Szekunder antitest Enzim ABC komplex: biotinált ellenanyag avidin biotinált enzim

29 Hagyományos hisztokémia Akut bronchopneumonia (hematoxilin-eozin festés) Viszonylag kevés sejttípus azonosítható

30 Immunhisztokémia (CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)

31 Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában (Hep- 2), immunofluoreszcencia segítségével (indirekt jelölés)

32 Aktin mikrofilamentek kimutatása (TRITC) Lehetőség van részletes morfológiai információk kinyerésére (lásd a további ábrákat is)

33 Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt Mitokondrium F-aktin Sejtmag

34 Fixált és permeabilizált tüdőartéria endothel sejt Peroxiszóma Mitokondrium Sejtmag


Letölteni ppt "ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK."

Hasonló előadás


Google Hirdetések