Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

A laboratórium lehetőségei a thrombotikus és prethrombotikus állapotok diagnosztikájában Katona Éva DE OEC, Klinikai Kutató Központ.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "A laboratórium lehetőségei a thrombotikus és prethrombotikus állapotok diagnosztikájában Katona Éva DE OEC, Klinikai Kutató Központ."— Előadás másolata:

1 A laboratórium lehetőségei a thrombotikus és prethrombotikus állapotok diagnosztikájában Katona Éva DE OEC, Klinikai Kutató Központ

2 Epidemiológia: CAD> stroke> VTE A puerperium és a postoperativ halálozásban vezető szerep Diagnosztika: Az elmúlt évtizedben jelentősen megváltozott: 1. Szemléletváltás: MVT=PE  VTE 2. Új non-invazív dg. lehetőségek: kompressziós UH és D-dimer

3 A PE betegek 79%-ának van kimutatható MVT-a A DVT-s betegek 50%  PE USA, Minnesota, inception cohort of patients study: 1: ,000 haláleset acut PE miatt / év / USA Tapson VF. N Engl J Med 2008: 358:

4 A vénás thromboembolia rizikó tényezői Öröklött faktorok Antitrombin deficiencia Protein C deficiencia Protein S deficiencia Faktor V Leiden APC rezisztencia Protrombin gén mutáció Diszfibrinogenémia Plazminogén deficiencia Szerzett faktorok Csökkent mobilitás Előrehaladott kor Tumor Akut betegség Nagyobb műtét Trauma Gerincagy sérülés Terhesség és postpartum Polycythemia vera Antifoszfolipid szindróma Orális fogamzásgátlók Hormonpótló terápia Heparinok Kemoterápia Elhízás Centrális véna katéter immobilizálás Feltételezett faktorok Emelkedett lipoprotein (a) (?) Csökkent TFPI szint (szöveti faktor útvonal inhibítor ) Emelkedett homocystein, faktor VIII, IX, XI fibrinogén TAFI

5 Tematika 1. Thrombosisok pathobiokémiája, pretrombotikus, trombotikus állapotok kimutatásának laboratóriumi lehetőségei 2. A VTE diagnosztikájának mai szemlélete, a laboratóriumi vizsgálatok helye, szerepe a diagnosztikában

6 Az alvadás intravascularis aktivációjának következményei 1/ Lokális: Thrombosis, thromboembolia 2/ Generalizált: Disszeminált intravasculáris coagulatio (DIC)

7 FPA, FPB D-Dimer Protrombin fragment ATIII

8

9 A véralvadás intravasculáris aktivációját jelző paraméterek Direkt markerek 1/ Protrombin fragment / Trombin-antitrombin (TAT) komplex 3/ Fibrinopeptid A (FPA) 4/ Szolubilis fibrin Indirekt marker Fibrin degradációs produktum (FbDP) beleértve a D-dimer

10 A protrombin aktivációja S-S Fragment B láncA lánc Trombin S-S Pretrombin Fragment Meizotrombin S-S A lánc S-S Protrombin FXa hasítási hely

11 Protrombin fragment 1+2 A protrombin <1%-a aktiválódik trombinná, a keletkező trombin gyorsan neutralizálódik (AT-III). A mintavétel kritikus, ajánlatos heparin, vagy trombin gátló (PPACK= Phe-Arg-Pro-klorometilketon). Szendvics ELISA Dade-Behring Enzygnost F1+2 (Pelzer, Thromb Haemost, 1991) Poliklonális kötő (elfogó) antitest: a fragment 1+2 C-terminális 14 aminosava ellen, mely az intakt protrombinnal nem reagál. Poliklonális jelző antitest: protrombin ellenes, peroxidázzal jelzett. Ref. tart.: 0,32-1,20 nmol/L

12 Alkalmazásai: Acut MVT, DIC, AMI, stroke, diagnosztikája Antikoaguláns terápia monitorozása APC rezisztenciában, PS deficienciában, ösztrogén terápia mellett, OAC szedésekor az alvadás aktivációjának követésére (Thromb Res 1995, Br J Haematol 1991, Thromb Haemost 1993, Blood 1992) Probléma: Relative bonyolult, időigényes, költséges Gyors diagnosztikára nem alkalmas.

13 Trombin-antitrombin komplex (TAT) meghatározása Trombin képződés esetén irreverzibilis TAT komplex keletkezik. Szendvics ELISA ( Dade-Behring) Kötő antitest: trombin ellenes Jelző antitest: antitrombin ellenes. Plazma minta -30  C-on tárolható. Jellemzők: Jól reprodukálható teszt, időigényes, drága. VTE: kiváló szenzitivitás és specificitás

14 Fibrinogén-fibrin átalakulás Fibrinogén Fibrin monomer + 2FPA, +2FPB Fibrin polimer Keresztkötött fibrin Trombin FXIIIa

15 Fibrinopeptid A 16 aminosav, a trombin hasítja le a fibrinogén A  lánc N-terminális végéről. Félélétideje a keringésben nagyon rövid, 3-5 perc. A vérben nagyon kis koncentrációban (  1,3 nmol/L) A megfelelő antikoaguláció rendkívül fontos (PPACK vagy heparin-aprotinin). Az FPA ellenes antitest keresztreagál a fibrinogénnel, amit bentonit abszopcióval előzetesen el kell távolítani. A meghatározás RIA-val történik. ELISA létezik, de forgalmazása megszünt.

16 Szolubilis fibrin (monomer) A fibrin monomerek, oligomerek fibrinogénnel komplexet képeznek és ha a koncentrációjuk alacsony, oldatban maradnak. Solubilis fibrin kimutatására szolgáló eljárások: 1/ Szemikvantitatív agglutinációs teszt, 2/ tPA-t aktiváló hatás mérése kromogén szubsztráttal, 3/ Szendvics ELISA (elfogó antitest: fibrin specifikus monoklonális antitest) Szignifikánsan emelkedett VTE, DIC (Bos, TH, 1998)

17 Szemikvantitatív agglutinációs teszt szolubilis fibrin kimutatására 0, Rh- vvt.-k felületére fibrin monomereket kötnek. 1/A liofilizált vvt.-ket feloldjuk és hozzámérjük a csőben előinkubált vizsgálandó plazmához. 2/10 perc inkubáció 37  C-on. 3/A mintát üveglapra öntjük és 6 percig folyamatosan keverjük. 4/Vizsgáljuk az agglutináció mértékét. Értékelés: - nincs aggregáció + kis aggregátumok ++ nagy aggregátumok +++ teljes összecsapzódás. Nagy koncentráció esetén már a csőben megtörténhet az összecsapzódás.

18 tPA aktivációs teszt szolubilis fibrin kimutatására A fibrin potenciálja a tPA indukálta plazminogén aktivációt. Solubilis fibrin jelenlétében több plazmin keletkezik, amit kromogén szubsztráttal mérünk. 1/ Plazminogén aktiváció: 2/ A keletkezett plazmin spektrofotometriás mérése A plazmin inhibitort antitesttel gátolják. plazminogén plazmin tPA + fibrin S R-pNA R + pNA plazmin

19 Fibrinogén/fibrin degradációs produktumok (FDP) kimutatása 1/ Mindkettő együttes kimutatása 2/ Csak fibrin degradációs termékek (FbDP, D-dimer) kimutatása 3/ Csak fibrinogén degradációs termékek (FgDP) kimutatása Alalcsony cc miatt csak immunológiai módszerek alkalmazhatók. Modern módszerek a kimutatást plazmából végzik, fibrinogénnel nincs kereszt- reakció (mAb).

20 A fibrin hasítása plazminnal Y/D XX/D X/YY/D

21 A D-Dimer meghatározás indikációja A fibrinolitikus rendszer aktiválódásának/működésének kimutatása. Minden olyan esetben, amikor a véralvadási rendszer aktivációja feltételezhető. Fibrinolízissel járó állapotok, mint: DIC (disszeminált intravaszkuláris koaguláció) DVT (mélyvénás trombózis) kizárása PE (pulmonáris embólia) kizárása trauma, műtét után bizonyos malignus (szolid) monitorozása terhességi komplikációk megelőzése

22 D-dimer mérése D-dimer specifikus monoklonális antitestek segítségével (X fragment oligomereket is detektál) a. Szemikvantitatív latex agglutináció (nem elég szenzitív) b. ELISA és egyéb heterogén immunoassayk c. Nefelometriás, turbidimetriás mikrolatex assay

23 D-dimer kvantitatív turbidimetriás mérése Plazma minta + puffer + Mikrolatex partikulák felületéhez kötött két D-dimer specifikus monoklonális antitest  Latex agglutináció A turbiditás változás követése 540 nm-en

24 Kvantitatív D-dimer assay Szenzitivitás megfelelőbb A VTE diagnosztikában játszott szerepe még mindig nem egyértelmű A különböző tesztekkel kapott eredmények összehasonlítása meglehetősen nehéz, a cut-off értékek különböznek. Oka: - különböző mAb-t alkalmaznak, melyek más-más hosszúságú D-dimer tartalmú fragmenteket ismernek fel - a kalibrátorok eltérőek

25 Stein et al. Ann Intern Med, tanulmány metaanalízise: Objektív vizsgálómódszerekkel igazolt VTE MVT prevalencia: 20-78%, PE prevalencia: 8-62% Szenzitivitás: ELISA>kvantitatív LA >szemi kvant. LA Specificitás: Kvantitatív LA >szemi kvant. LA >ELISA A VTE-t nagy biztonsággal kizárják, azonban a dg megerősítéséhez nem járulnak hozzá nagy mértékben. Cut off 500 ng/mL-nél optimális.

26 Bounameaux és Perrier X.ETRO Advanced Teaching Course on Thrombosis, Belgium, 2003 Cut off: 500 ng/mL-nél legjobb a szenzitivitás

27 Specifcitás: bár a D-dimer igen specifikus a fibrin keletkezésére, a fibrin jelenlétének specificitása a VTE- re igen rossz (tumorok, gyulladás, necrosis). Ezért az 500 ng/mL feletti D-dimer értékek pozitív prediktív értéke alacsony. Az álpozitív eredmények aránya idős betegeknél, hospitalizáltaknál magasabb. Tanulságok: A kvantitatív, magas szenzitivitású D-dimer assayk megfelelőek a VTE kizárására alacsony vagy közepesen magas klinikai valószínűség mellett, Idős és hospitalizált beteg, magas VTE klinikai valószínűség esetén azonban nem. A prethrombotikus állapotok diagnosztikájában érzékenysége nem kielégítő.

28 Kvantitatív D-dimer tesztek a nemzetközi gyakorlatban ECAT 45 db kód Abbott Axsym D-Dimer..Trinity/Sigma Auto D-Dimer EXERCISE Number of participants: 600 Number of responders:538 (89.7%) 1 qualitative 10 semi-quantitative 527 quantitative (32 outliers/1054 sample, 3.04%)

29 D-Dimer sample 1 semi-quantitative: <0.25 (4), (4), (2)

30 D-Dimer sample 2 semi-quantitative: (4), (3), (1), (2)

31 TesztNMean (mg/L, FEU/L*) DVT Excluded/Not Excl. CV Trinity/ Biopool Auto Dimer / % Dade-Behring D-dimer plus / % Hemosil D-Dimer / % Vidas D-Dimer Exclusion * % Stago Di Test * % Stago Liatest * % Kvantitatív D-dimer tesztek a nemzetközi gyakorlatban NEQAS 567 beküldő centrum, 511 kvantitatív D-dimert mér, 7.4% szemi-kv.

32 VTE diagnosztikája I. eszköztár 1. Gold standard: phlebographia, pulmonalis angiographia (invazív, veszélyes, költséges) 2. Klinikai valószínűség megállapítása score rendszer alapján (hasznosak, de önmagukban nem jobbak mint egy tapasztalt klinikus benyomása)

33 MVT

34 PE

35

36 VTE diagnosztikája I. eszköztár 3. D-dimer 4. Vénás kompressziós UH: szenzitivitás 97%, specificitás 98% tünetekkel járó MVT-ben, A PE esetek 50%-ában megtalálja a MVT-t. 5. Ventillációs/perfúziós tüdőszcintigráfia: + prediktív érték kb. 90% 6. Spirál CT: protokolltól függően 50-99% specificitás és szenzitivitás 7. Echocardiographia

37 VTE diagnosztikája II. a dg lehetőségek megítélésének szempontjai 1. A módszer technikai megítélése 2. Dg standarddal történő összehasonlítás (cut off érték megállapítása, szenzitivitás, specificitás megítélése) 3. Klinikai tanulmányokban való alkalmazhatóság, hosszú távú (legalább 3 hónap) követés a dg után, a késői események kizárása 4. költséghatékonyság

38 VTE diagnosztikája III. diagnosztikus stratégia MVT Perrier et al. Lancet 1999.

39 VTE diagnosztikája III. diagnosztikus stratégia PE Perrier et al. Ann Intern Med 2001, Gottlieb et al. AJR 2003

40 A D-dimer és a kompressziós UH haszna a PE kizárásában életkorok szerint Bounameaux és Perrier X.ETRO Advanced Teaching Course on Thrombosis, Belgium, 2003

41 Tapson VF. N Engl J Med 2008: 358:

42 Köszönöm a figyelmet!


Letölteni ppt "A laboratórium lehetőségei a thrombotikus és prethrombotikus állapotok diagnosztikájában Katona Éva DE OEC, Klinikai Kutató Központ."

Hasonló előadás


Google Hirdetések