Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

A kromatográfia alapjai Olyan elválasztási módszer, amelynél a vizsgálandó minta alkotóinak elválasztása egy helyhez kötött állófázis és az ezzel érintkező,

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "A kromatográfia alapjai Olyan elválasztási módszer, amelynél a vizsgálandó minta alkotóinak elválasztása egy helyhez kötött állófázis és az ezzel érintkező,"— Előadás másolata:

1 A kromatográfia alapjai Olyan elválasztási módszer, amelynél a vizsgálandó minta alkotóinak elválasztása egy helyhez kötött állófázis és az ezzel érintkező, mozgó fluid fázis közötti anyagátmeneten, valamint az egyes alkotóknak az álló fázissal való eltérő kölcsönhatásán alapszik. Előzmények 1906: M. Cvet ( ), orosz botanikus - levél színanyagainak elválasztása CaCO3 állófázison. Kromatográfia. (Adszorpciós oszlop kromatográfia) 1938-ig: Mikro-kromatográfia: Kísérletek az oszlopátmérő lecsökkentésére (1mm- ig). Probléma: oszlop előállítása (töltése), nagyon kis anyagmennyiség vizsgálata. 1937: vékonyréteg kromatográfia elve. A zárt (oszlop) helyett nyitott (vékonyrétegű) állófázis alkalmazása. (Ismailov és Shraiber) 1940/50: Archer és Synge: A megoszlásos kromatográfia alapelvei-> folyadékkromatográfia

2 A kromatográfiás elválasztás lehetőségei: - frontális - kiszorításos - elúciós elválasztás A kromatográfia alapjai Gyakorlati alkalmazás szintjén a manapság alkalmazott eljárások leginkább az elúciós kromatográfiás eljárások. Elúciós kromatográfia: a mintát az állófázisra (oszlop vagy réteg) juttatjuk és onnan egy eluenssel (mozgó fázis) folyamatosan „lemossuk”, eltávolítjuk. Az egyes komponensek az álló és mozgófázis közötti eltérő megoszlásuk miatt különböző sebességgel vándorolnak végig az állófázison.. -> kémiai megoszlás jelensége

3 A kromatográfia alapjai Mozgófázis áramlása Szelektivitás Az elúció során végbemenő megoszlás elve. K:megoszlási hányados C s : koncentráció az állófázisban, C m : koncentráció a mozgófázisban

4 A kromatográfiás módszerek csoportosítása

5 A molekulatömeg és a kromatográfiás módszerek kapcsolata A kromatográfia alapjai Az elúciós elválasztás elve

6 Kromatográfiás módszerek csoportosítása A kromatográfiás ágy alakja szerint: - Síkkromatográfia: 1. Vékonyréteg kromatográfia (állófázis: vékonyréteg (0.2 mm vastag réteglap), mozgófázis: folyadék. Nem illékony vegyületek elválasztása) 2. Papírkromatográfia (állófázis: cellulóz, mozgófázis: folyadék. Nem illékony vegyületek elválasztása. elavult..) - Oszlopkromatográfia 1. Folyadékkromatográfia. (állófázis: töltött oszlop, mozgófázis: folyadék. Nem illékony vegyületek elválasztása.) 2. Gázkromatográfia. (állófázis: töltött oszlop, mozgófázis: gáz. Illékony vegyületek elválasztása.) A mozgófázis halmazállapota szerint: 1. Gázkromatográfia (..) 2. Folyadékkromatográfia (..) 3. Szuperkritikus folyadékkromatográfia (mozgófázis: kritikus állapotú folyadék) Az elválasztás mechanizmusa szerint: 1. Ioncserés kromatográfia (állófázis: ioncserélő gyanta) 2. Méretkizárásos kromatográfia (állófázis: porózus gél. Polimerek elválasztása.) 3. Affinitáskromatográfia (biológiai kölcsönhatáson (pl. antigén/antitest, enzim/szubsztrát, receptor/lignadum) alapuló kromatográfiás rendszer)

7 A vékonyréteg kromatográfia 1944: Consden, Gordon, Martin: Aminosavak elválasztása szűrőpapír vékonyrétegen (papírkromatográfia). Megoszlásos kromatográfia. Nagy népszerűség. Hátrányai: állófázis poláros, összetétele nem állandó. Csak egyes anyagcsoportok elválasztása. Nehezen reprodukálható elválasztás, kis felbontású. Nem standardizálható. 1958: Vékonyréteg kromatográfia. Előnyei: - Könnyen standardizálható (réteg vastagsága, szemcsemérete, előállítás, kifejlesztő kamra, stb.) - Segédeszközök alkalmazása (mintafelvitelhez, kiértékeléshez, stb..) - Sokoldalúan használható pontosan ismert összetételű szorbensek (állófázis) kifejlesztése (Al 2 O 3, szilikagél (SiO 2 ), módosított szilikagél, stb.). - Alkamazási területek kiterjesztése 1962: E. Stahl: A modern vékonyréteg kromatográfia alapjai.

8 Vékonyréteg kromatográfia A vékonyréteg kromatográfiás analízis paraméterei: - Állófázis - Mintafelvitel - Kifejlesztés - Megjelenítés - Minőségi azonosítás - Mennyiségi kiértékelés

9 Vékonyréteg kromatográfia Állófázis Anyaga: 1. szilikagél (SiO 2 ). Olcsó, hatékony, könnyen előállítható. 10-ből 9 rétegkromatográfiás elválasztás szilikagél állófázison történik. Szemcseméret: 5-15 μm (HPLC töltet: μm). 2. módosított szilikagél (CN, NH 2, C18, C8). Nem olcsó. Speciális alkalmazásokhoz. Vastagsága: mm Hordozó: Alumíniumlemez vagy üveglap. Elméleti Elméleti tányérszám tányérmagasság VRK μm HPLC μm A HPLC és a VRK maximális elválasztóképessége 10 cm-es elválasztási távolságon. Hátrány: alacsony felbontás és elméleti tányérszám. Csak kis számú komponens választható el megfelelő elbontással.

10 Vékonyréteg kromatográfia Mintafelvitel Módja: pontszerű vagy sávszerű mintafelvitel. Mennyisége: feladatnak megfelelően megválasztható (2 pg – 1 mg). Előny: - Nincs szükség a minta koncentrálására, ha nem elég tömény. - Egy réteglapra akár 20 minta is felvihető. Egyszerre több minta meghatározható. Kisebb időigény. - Mintafelvitel hossza a feladatnak megfelelően meghatározható (akár 15 cm is lehet) Pont- és sávszerű mintafelvitelKifejlesztés után

11 Vékonyréteg kromatográfia Kifejlesztés - Dinamikus fázisérintkeztetés. A mozgófázis áramlása a kapilláris erők következtében történik. A fázisérintkeztetés nem-egyensúlyi! - Horizontális és felszálló kifejlesztés. - A gőztér jelenléte befolyásolja az elválasztás hatékonyságát. Felszálló kifejlesztés Horizontális kifejlesztés 1. Mozgófázis párolgása a kamra gőzterébe. 2. Lepárolgás a rétegről 3. Mozgófázis gőzinek adszorpciója a rétegre. 4. Mozgófázis megoszlása az állófázison (α, β, γ frontok) - A mozgófázis áramlása időben nem egyenletes (lassul). - A gőztér jelenléte befolyásolja az elválasztást. - A mozgófázis ha több komponensű önmaga is megoszlik az állófázison - Nehezen leírható. ÁllófázisMozgófázis

12 Vékonyréteg kromatográfia Megjelenítés A vizsgált komponensek láthatók (pl. festékelegy). A legtöbb komponens azonban nem színes. Ezek megjelenítésére a szilikagél állófázis néhány százalékban tartalmaz ZnSiO 3 -t (cink-szilikát), amely 254 nm-es UV fénnyel megvilágítva fluoreszkál. A komponensek elfedik a réteget és sötét foltként láthatók. Több vegyület 366 nm-es UV fénnyel megvilágítva önmaga is fluoreszkál. Látható fény UV (254 nm) UV (366 nm) Stephania kivonat elválasztása szilikagél állófázison. Megjelenítés különböző hullámhosszakon.

13 Az esetek többségében azonban a vizsgált komponensek nem láthatók (nem színesek) illetve nem különíthetők el azonnal a többi anyagtól (mátrixtól). Vékonyréteg kromatográfia Megjelenítés Szelektív megjelenítés származékképzéssel: A kifejlesztett réteg lefújása vagy bemerítése olyan anyaggal amely csak a vizsgálni kívánt komponensekkel képez lehetőleg színes vagy fluoreszkáló terméket. ? ? ?

14 Vékonyréteg kromatográfia Megjelenítés Szelektív megjelenítés származékképzéssel (előhívással) Előny: - Szelektív megjelenítés, csak a vizsgált vegyületcsoportra. - A mátrix, ill. nem vizsgált komponensek láthatatlanok maradnak. Nem szükséges a minta előkészítés során a mintát megtisztítani a mátrix- és egyéb zavaró komponensektől. - Nem jelent gondot az állófázis „elszennyezése”. Azofestékek bomlása során keletkező karcinogén aminok kimutatása festett bőranyagból. Előhívás: N-(1-naftil-)-etiléndiammónium-dikloriddal.

15 Vékonyréteg kromatográfia Megjelenítés Szelektív megjelenítés származékképzéssel Előny: Többszöri előhívás, illetve többszöri kiértékelés lehetősége. Astragalus és Hedysarum fajok vizsgálata

16 A – előhívás nélkül, 254 nm B – előhívás nélkül, 366 nm C – előhívás metanolos kénsavval, látható fény D – előhívás metanolos kénsavval majd 366 nm 1 – asztragalozid IV (szaponin típusú vegyület) 2-6 – Astragalus fajok 7- Hedysarum kivonat 8 – Astragalus minta. Teljes gyökér. 9 – asztragalozid IV 10 – Astragalus gyökér, 2 éves 11 – Astragalus gyökér, 4 éves 12 – Astragalus gyökér, 6 éves 13 – Astragalus gyökér 14 – Astragalus gyökér, föld alatti szár 15 – Astragalus gyökér szelet (kinai) 16 – asztragalozid IV

17 Vékonyréteg kromatográfia Minőségi azonosítás - Retenciós faktor (R f ) ÉS - Szín vagy egyéb optikai információ összevetése (pl. fluoreszcencia, reflexiós spektrum, stb.) alapján. start front ab A retenciós faktor értékének kiszámítása adott kromatográfiás sávra

18 Vékonyréteg kromatográfia Mennyiségi elemzés - Mennyiségi információ: a foltok mérete és optikai sűrűsége (színintenzitás) alapján. - Denzitometria: a kromatográfiás foltok optikai sűrűségének mérése 1. Pásztázó denzitometria (diffúz-reflexiós spektrofotometria). 2. Videodenzitometria (digitális képalkotás a rétegről).

19 Vékonyréteg kromatográfia Pásztázó denzitometria - Pásztázás optikai réssel, a diffúz módon visszavert fénymennyiség mérése. s1 m1 s2 m1 s3 m1 s4 m1 s5 m1 – minta s1-s5 – standard denzitogram

20 Vékonyréteg kromatográfia Pásztázó denzitometria - Kalibrációs egyenes felvétele adott komponensre. Ismeretlen mintából az adott komponens mennyiségének meghatározása. - Kalibráció csúcsterület vagy csúcsmagasság alapján. a csúcsterület anyagmennyiség (ng) Kalibrációs egyenes a komponensre s1 s2 s3 s4 A komponens elválasztása m1 mintából és mennyiségének meghatározása ötpontos kalibráció segítségével. s1 m1 s2 m1 s3 m1 s4 m1 s5 s5

21 Vékonyréteg kromatográfia Pásztázó denzitométer felépítése Denzitométer Denzitogram kiértékelése Pásztázó denzitométer felépítése

22 Vékonyréteg kromatográfia Videodenzitometria - Digitális képalkotás az előhívott réteglapról megfelelő megvilágítás (254 nm, 366 nm, látható fény) alkalmazásával. - Nagy linearitású digitális kamera. Kép szoftveres kiértékelése. - Rosszabb a mérési reprodukálhatósága mint a pásztázó denzitométernek, viszont gyorsabb és rugalmasabb annál. Képalkotás és kiértékelés Képalkotó rendszer

23 Vékonyréteg kromatográfia Denzitometria - Egy réteglap többször is kiértékelhető (pl. több hullámhosszon vagy más megvilágítás mellett. - Külön kiértékelési lehetőség előhívás előtt és után. - UV-VIS reflexiós spektrum felvételének lehetősége a pásztázó denzitométerrel.

24 Vékonyréteg kromatográfia Vékonyréteg kromatográfia alkalmazása (+)-katechin (-)-epikatechin C: EC: C EC KKBKKKBKKKBK - (+)-katechin meghatározása kocsányos tölgy kérgéből Külső kéreg (KK) Belső kéreg (BK) Szíjács A kocsányos tölgy kérge Kalibrációs görbe (+)-katechinre Katechinek elválasztása tölgy kéregből. Állófázis: szilikagél, mozgófázis 9:1 diizopropil-éter.hangyasav. Előhívás vanillin-H 3 PO 4 reagenssel.

25 Vékonyréteg kromatográfia Túlnyomásos rétegkromatográfia (OPLC) Hagyományos VRK hátrányai: alacsony elméleti tényérszám, gőzfázis okozta reprodukálhatósági problémák; rövid kifejlesztési táv (6-10 cm); időben változó és nem optimális áramlási sebesség; lassú elválasztás (20 perc/ 6 cm) Az OPLC előnyei: - Zárt állófázison történik a szétválasztás. Nincs gőztér. - A mozgófázis (a HPLC-hez hasonlóan) kényszeráramlással mozog. - Állandó és optimális áramlási sebesség. - Nagy kifejlesztési távolság (akár 20 cm). - Gyors elválasztás. (10 perc/20 cm) - Alacsony oldószerigény Az OPLC hátrányai: - Speciálisan előkészített réteglapot igényel, ami drágább.

26 Vékonyréteg kromatográfia Túlnyomásos rétegkromatográfia (OPLC) Mozgófázis frontja (mm) Kifejlesztési idő (s) 1 – telített gőzterű felszálló kamra 2 - telítetlen gőzterű felszálló kamra 3 - OPLC 20 cm Festékelegy OPLC elválasztása

27 Vékonyréteg kromatográfia Túlnyomásos rétegkromatográf (OPLC) OPLC - túlnyomásos rétegkromatográf

28 Vékonyréteg kromatográfia Túlnyomásos rétegkromatográfia alkalmazása Szénhidrátok minőségi és mennyiségi meghatározása sörmintából. Szénhidrátok elválasztása sörmintából glükóz maltóz fruktóz xilóz szacharóz s1 s2 s3 s4 s1 s2 s3 s4 s1 s2 s3 s4 - Párnanyomás: 50 bar. - Mozgófázis: 9:1 acetonitril:víz - Kifejlesztés 250 μl/perc - 2 x 4500 μl mozgófázis - Megjelenítés: anilin-difenilamin reagenssel. - Kiértékelés: 540 nm-en (látható tartomány)

29 Túlnyomásos rétegkromatográfia alkalmazása Szénhidrátok elválasztása és azonosítása termikusan módosított faanyagból. Hőkezeléssel módosított faanyag megjelenítés: naftorezorcin reagenssel anilin-difenilamin reagenssel Szénhidrátok elválasztása hőkezeléssel módosított faanyagból Kromatogárfiás körülmények: árnanyomás: 50 bar; Mozgófázis: 9:1 acetonitril:víz; Kifejlesztés 250 μl/perc; 2 x 4500 μl mozgófázis; Előhívás naftorezorcin reagenssel, vagy anilin-difenilamin reagenssel. Vékonyréteg kromatográfia

30 Folyadékkromatográfia A folyadékkromatográfiás analízis paraméterei: - Állófázis - Mozgófázis - Elúció - Detektálás (analitikai jel) - Minőségi azonosítás - Mennyiségi kiértékelés

31 Folyadékkromatográfia Állófázis Anyaga: 1. szilikagél (SiO 2 ). Olcsó, hatékony, könnyen előállítható. Gyakorlatban ritkán alkalmazzák, mivel az elúcióhoz szerves oldószerek szükségesek – nagyon költséges! Szemcseméret: μm. 2. módosított szilikagél (-CN, -NH 2, -C 18, -C 8 ). Az elúció vizes oldatokkal történik – költséghatékonyabb mint a szilikagél állófázis. Elméleti Elméleti tányérszám* tányérmagasság VRK μm HPLC μm A HPLC és a VRK maximális elválasztóképessége 10 cm-es elválasztási távolságon. Előny: nagy felbontás és elméleti tányérszám. Nagy számú komponens választható el megfelelő elbontással. * Egyensúlyi egységek száma adott mértű állófázison

32 Folyadékkromatográfia Mozgófázis: A, Ha az állófázis normálfázisú (poláros, pl. SiO 2 ): etil-acetát, hangyasav, furán, diklórmetán, stb. (apoláros szerves oldószer). B, Ha az állófázis fordított fázisú (apoláros, pl. -C 18, -C 8, stb.): víz, metanol, acetonitril, stb. (poláros oldószer).

33 Folyadékkromatográfia A szilikagél felületi módosítása

34 Folyadékkromatográfia A HPLC módszerek osztályozása

35 Folyadékkromatográfia Elúció: Mozgófázis áramoltatása a szorbenságyon (állófázison) keresztül történhet: - Nehézségi erők hatására (hagyományos oszlopkromatográfia. Lassú, rossz felbontású, alacsony elméleti tányérszám). - Flash kromatográfia (Still, 1978): mozgófázis átvitele az oszlopon nyomás hatására. Gyorsabb, hatékonyabb. - HPLC: nagy nyomású/hatékonyságú folyadékkromatográfia. Nagy nyomás, ideális áramlási és elválasztási körülmények (ld. van Deemter-egyenlet) HPLC (High Performance Liquid Chromatography) - Izokratikus és gradiens elúció (állandó összetételű, illetve változtatott összetételű mozgófázis alkalmazása).

36 Folyadékkromatográfia Elúció: A van Deemter egyenlet - H: elméleti tányérmagasság - A: örvénydiffúzió - B: hosszirányú diffúzió - C: komponens átadás az álló- és a mozgófázis között - u: lineáris áramlási sebesség Ideális áramlási sebesség :2, 3: Mozgófázis sebessége u (cm/sec) Ideális sebesség

37 Folyadékkromatográfia A kromatográfiás elválasztás analitikai jellemzése

38 Folyadékkromatográfia Detektálás: Analitikai jel érzékelése. Az oszlopról távozó mozgófázisban oldott komponensek észlelése azok valamely specifikus tulajdonsága alapján ún. „átfolyó cellás” detektorban. Nem destruktív detektálás - Törésmutató változás (pl. szénhidrátok) - Fényabszorpció (UV, VIS, legtöbb szerves vegyületre alkalmazható) - Vezetőképesség mérése - Fluoreszcencia - … alapján Destruktív érzékelés (komponensek szabályozott átalakítása, roncsolása) - Oszlop után vagy előtt történő on-line vagy off-line származékképzés - MS-dektektálás (ionizáció, fragmentáció, majd tömegszelektív detektálás)

39 Folyadékkromatográfia A: mozgófázis tartályok; B: keverő szelep és gradienspumpa; C: Túlnyomás szabályozó; D: pulzáláscsökkentő; E: keverőkamra; F: mintabemérő szelep; G: kromatográfiás oszlop (állófázissal töltve); H. vezérlőegység; I: detektor (pl. UV fotométer); J: számítógép interfész (A/D konverter); K: számítógép; L: nyomtató Egy HPLC rendszer felépítése

40 Folyadékkromatográfia Egy modern HPLC rendszer felépítése HPLCMS

41 Minőségi analitikai információk: - Retenció: az állófázis azon tulajdonsága, hogy az alkotóval való kölcsönhatása révén a komponens előrehaladását késlelteti az inert eluenshez képest. - Bruttó retenciós idő (t R ) -Redukált bruttó retenciós idő (t ’ R ) t ’ R =t R - t 0 független a geometriától, függ az áramlási sebességtől, állófázis tömegétől, a hőmérséklettől -t o : holtidő. Az az idő amely alatt a visszatartással nem rendelkező komponens a rendszeren végigér. -V 0 : holttérfogat. A kromatográfiás rendszer (állófázis pórusai közti tér, vezetékek, stb.) térfogatának összege. -F: térfogati áramlási sebesség (ml/min) Folyadékkromatográfia

42 Minőségi azonosítás: - A kromatográfiás csúcs retenciós ideje (t R ) alapján (szükséges feltétel, de nem elégséges) standard minta ? ? ? ? - Azonosság megerősítése: Spektrális tulajdonság alapján (UV-VIS abszorpciós spektrum) Molekulatömeg alapján, fragmentáció alapján, stb. tRtR tRtR detektorjel

43 Folyadékkromatográfia Mennyiségi analizis: - A kromatográfiás csúcs alatti terület vagy a csúcsmagasság alapján - Kalibráció készítése különböző koncentrációjú standard oldatokkal c1c1 c5c5 Standard oldatok kromatogramja Kalibrációs egyenes c1c1 c5c5 Koncentráció (ng/ml) Csúcsterület

44 Folyadékkromatográfia Mennyiségi analizis: Detektorjel Retenciós idő (perc) Vörösfenyő kivonat elválasztása HPLC-vel Mintabemérés: 1 mikroliter Mozgófázis A: víz Mozgófázis B: acetonitril Mozgófázis C: víz/acetonitril 95:5 + H 3 PO 4 pH=1.56 Mozgófázis D: víz/acetonitril 95:5 + puffer pH=4.22 Mozgófázis gradiens program: perc: 27-33%B (73-67%A) – 16 perc: 33-80%B (67-20%A) 16 – 20 perc: 80%B (20% A) Kiértékelés Név retenciós idő Terület % Csúcsterület Arány % Mozgófázis gradiens

45 1.Gázbeviteli rendszerek 2.Mintabeviteli rendszerek 3.Kolonnák (állófázis) és kolonnatér 4.Detektorok 5.Számítógépes rendszer Gázkromatográfia

46 - Mozgófázis: gáz (He, H 2, N 2, stb.) - Állófázis: szilárd (adszorpció) v. megosztó folyadék (abszorpció) Kolonna típusok: szemcsés töltetű (töltött kolonna) nyitott cső (kapilláris) (d belső < 1 mm) PLOT, WCOT, SCOT kolonnák Megosztó folyadék típusok: - polisziloxán vázúak, polietilén-glikolok, poliglikol-észterek, ftálsav-észterek Gázkromatográfia

47 Gázkromatográfiás készülékek Gázkromatográfia A gázkromatográfiás készülékek általános felépítése

48 Gázkromatográfia A mintaáram osztó (splitter) vázlata

49 Gázkromatográfia A hidrogénláng-ionizációs detektor felépítése

50 Gázkromatográfia Minőségi azonosítás a retenciós idők közvetlen összehasonlításával

51 Folyadékkromatográfia Felhasznált források: Qtrap LC/MS/MS system – Applied Biosystems (termékkatalógus) - Morlock, G (2003): Workshop – Planar Chromatography – Part2, HPTLC, Lyon, Camag Bibliographic Service: Parameters of Planar Chromatography - Morlock, G (2003): Workshop – Planar Chromatography – Part1, HPTLC, Lyon, Morlock, G (2003): Workshop – Planar Chromatography – Part2, HPTLC, Lyon, Camag Bibliographic Service: Parameters of Planar Chromatography - Camag application notes: Detection of carcinogenic amines as degradation products of azo-dyes in leathers - Camag application notes HPTLC identification of Astragalus and Hedysarium


Letölteni ppt "A kromatográfia alapjai Olyan elválasztási módszer, amelynél a vizsgálandó minta alkotóinak elválasztása egy helyhez kötött állófázis és az ezzel érintkező,"

Hasonló előadás


Google Hirdetések