Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Mikotoxinok biodegradációjára alkalmas mikrobák szelekciója és alkalmazásuk lehetőségei Kukolya József, Cserháti Mátyás, Krifaton Csilla, Háhn Judit, Táncsics.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Mikotoxinok biodegradációjára alkalmas mikrobák szelekciója és alkalmazásuk lehetőségei Kukolya József, Cserháti Mátyás, Krifaton Csilla, Háhn Judit, Táncsics."— Előadás másolata:

1 Mikotoxinok biodegradációjára alkalmas mikrobák szelekciója és alkalmazásuk lehetőségei Kukolya József, Cserháti Mátyás, Krifaton Csilla, Háhn Judit, Táncsics András, Szoboszlay Sándor, Kriszt Balázs

2 Aratás utáni biológiai mikotoxin szint csökkentési lehetőségek Toxin adszorpció: 1.Lactobacillusok alkalmazása takarmányadalékként toxinok sejtfelszínen történő megkötésére 2. élesztőből preparált mannooligoszacharidok alkalmazása takarmányokban toxin megkötésre Toxinbontó mikrobák direkt alkalmazása: takarmányadalékkénti alkalmazás- Nocardia corynebacteroides aflatoxinos csirketáp mentesítésre (Tejada-Castaneda et al. 2008) Nem specifikus enzimek alkalmazása:peroxidáz enzimek alkalmazása (nem specifikus enzim, 30-40%-os aflatoxin konverzió, igen nagy enzim igény- Das et al. 2000) A toxinbontás/inaktiválás kulcsenzimeinek izolálása és alkalmazása: Biomin Mycofix Plus Iránymutató a mikotoxin mentesítési eljárásokhoz (Jemme 1989) -inaktiválja, elbontsa, eltávolítsa a toxint -ne maradjon toxikus bomlástermék -a tápanyagtartalom ne változzon -a termék technológiai jellemzői ne változzanak -ne kerüljön többe mint a dekontaminálandó anyag

3 Mikotoxinok biotranszformációjára alkalmas mikroorganizmusok MikroorganizmusVizsgált mikotoxinReferencia Flavobacterium aurantiacumAflatoxinCiegler et al., 1966 Aspergillus flavusHamid and Smith, 1987 Rhodococcus erythropolisAlberts et al Rhodococcus pyridinivoransCserháti et al Trichosporon mycotoxinivoransZearalenoneSchatzmayr et al., 2006 Pseudomonas putida ZEA-1Altahi and El-Deeb, 2009 Rhodococcus erythropolis Norcardia globulera Rood and Duvick, 1998 Rhizopus stolonifer, Aspergillus niger Ochtratoxin AVágvölgyi et al., 2005 Acinetobacter calcoaceticusHwang and Draughon, 1994 Trichosporon mycotoxinivoransSchatzmayr et al., 2006 Exophiala piniferaFumonisinsDuvick et al., 1998 Rhinocladiella atrovirens Bacterium sp.ATCC Comamonas sp. NCB 1492Benedetti et al Agrobacterium sp.DeoxynivalenolShima et al., 1997 Eubacterium sp. BBSH797Binder et al., 1998 Butyrvibrio fibrisolvensT-2 toxinWestlake et al., 1987 Selenomonas ruminantium Anaerovibrio lipolyticaWestlake et al., 1987 Curtobacterium sp.Ueno et al., 1983

4 A Trichosporon mycotoxinivorans Zearalenon biotranszformációja észteráz segítségével 0h 2h 5h 24h 48h Trichosporon mycotoxinivorans A zealarelon bontási kísérlet kromatogramjai (Molnár et al. 2004)

5 A MYCOSTOP projekt előzményei -Az Agruniver Holding Kft.: kiváló aromásbontó aktivitású mikroba törzsgyűjtemény, melyek tagjai nagyobbrészt a rhodococcus nezettségbe tartoznak - a rhodococcusok a prokarióták között a legnagyobb genommal rendelkeznek: 9 Mbp -katabolit represszió hiánya -aromás szerkezeti elemet tartalmazó szubsztrátok bontásának hatékonysága (203 különböző oxigenáz) -A R. equi kivételével törzseik nem patogének -nemzetközi kapcsolatok rhodococcus-laborokkal ban a dél-afrikai van Zyl professzor és csoportja először publikál a rhodococcusok Aflatoxin-bontó képességéről -Előkísérletben az AH Kft. rhodococcus kollekciója igen figyelemre méltó degradációs aktivitást mutatott

6 A MYCOSTOP projekt biodegradációs ágának célkitűzései A hároméves kutatási szakaszt három fázisra osztottuk 1.fázis: -mikotoxinok degradációjára alkalmas mikrobák screenelése (rhodococcus törzsek bioremediációs gyűjteményekből +referencia törzsek, minél szélesebb törzsgarnitúra ~200 törzs!) -a toxindegradáció követése analitikai és ELISA rendszerekkel 2. fázis: -biztonságos törzsek kiválasztása: molekuláris taxonómiai azonosítás, olyan mikrobák szelekciója, melyek a bontás során nem termelnek citotoxikus, genotoxikus metabolitokat (SOS-Chromo teszt, Aliivibrio fischeri toxikológia) –a törzsek aktivitás fokozása genetikai eszközökkel (UV- és transzpozon mutagenezis) 3. fázis: -toxinbontó mikrobák alkalmazása, immobilizált élősejtes biofilterek fejlesztése -gyakorlati felhasználás, a szeszmoslék detoxifikációja fluidágyas reaktorban 4. fázis: -a mikotoxinbontás metabolizmusának feltárása (nem szerepelt az eredeti célok között!)

7 1. fázis: Mikroba törzsek mikotoxin bontó képességének meghatározása A screen rendszer elemei: -vizsgált toxinok: Aflatoxin, Zearalenon, T-2 toxin, Ochratoxin, DON -vizsgálatba vont mikrobák: 200 törzs -bontási teszt: LB-táptalaj, 2-4 ppm toxinszint, 3 napos inkubáció -Toxin monitoring: napi mintavétel, a felülúszóból ELISA (SoftFlow) és analitikai (Wessling) mikotoxin kimutatás

8 1. fázis: Rhodococcus törzsgyűjtemény mikotoxin bontó képességének meghatározása ZearalenonDON Ochratoxi nT2Aflatoxin B1 Soft Flow Wessli ng Soft Flow Wessli ng Soft Flow Wesslin g Soft Flow Wesslin g Fajtörzs % %% %% R. erythropolisAk R. globerulusAK R. pyridinivoransAK R. pyridinivoransK R. aetherivoransAK R. rhodochrousATTC R. erythropolis DSM R. erythropolisDSM R. coprophilusN R. ruberN R. gluberulusN R. erythropolisNi AflatoxinB1 OchratoxinA Fumonizin B1 Zealarenon T-2 toxin

9 1. fázis: A Rhodococcus törzsgarnitúra toxinbontó képessége Rhodococcus faj ZeaDONOchraT2AF1 Multitoxin bontás R. erythropolis R.pyridinivorans R. globerulus R. ruber R. gordoniae R. coprophilus R. rhodochrous R. aetherivorans rhodococcus faj 32 törzsét szkreeneltük eddig, a R. erythropolis Ni1- törzs három toxin, a Zearalenon, T2-toxin és az aflatoxin bontására is képes

10 1. fázis: Nem rhodoccocus genuszba tartozó mikroba fajok toxinbontó képessége (28 tétel) NemzetségekFajok száma ZeaDONOchraT2AF1 Pseudomonas Streptomyces Chryseobacterium Cupriavidus Pseudoxanthomonas Paracoccus Microbacterium Raoultella Serratia Sphingopyxis Ochrobactrum Gordonia Arthrobacter Piros: 95%-fölötti bontás (Cupriavidus basiliensis Őr16: 99%!); sárga: 66% fölötti bontás

11 Aliivibrio fischeri lumineszcencia-teszt Ökotoxikológiai vizsgálatokban használt tesztszervezet A. fischeri strain NRRLB (ISO/EN/DIN 11348) Módosított akut teszt (Sarter et al, 2008) 24 órás sejttenyészetre kifejtett gátlás 3.5, 10, 15, 25 h órás kontaktidő után A módszert adaptáltuk ELISA rendszerhez Nagy mennyiségű minta feldolgozása, UV-mutagenezis és transzpozon mutagenezis rendszerekhez (több ezer klón!)

12 SOS-Chromoteszt Escherichia coli PQ37 mutáns Genetikai háttér: Operon fúzió: lacZ gén az SOS regulonba van integrálva → normál lac régió törölve β-galaktozidáz aktivitás az SOS repair rendszer indukciójától függ → színreakcióból következtethetünk a mutagenitási potenciálra Direkt/Indirekt hatású genotoxinok kimutatása, S9 patkánymáj-kivonat Indukciós faktor (IF): I (Indukciós faktor) = (A405 nc x A620 t)/(A405 t x A620 nc) ahol:nc: negatív kontroll; t: tesztelt oldat Genotoxikus hatás: IF>1,5 Eredményeink alapján az AFB1 kimutathatósági határa: 78 ppb 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 S9 mix hígítási szint4NQOAFB12AAAFB1 1:110,795,630,984,30 1:210,693,882,234,03 1:49,512,353,083,97 1:84,641,813,323,66 1:162,911,203,59 1:321,651,393,502,88 1:641,701,412,892,54 1:1281,501,232,162,01

13 Miért az aflatoxin volt az első leírt mikotoxin és mi közük van ehhez a pulykáknak? 1.Aflatoxin inaktiválása háziállatokban: AFB1 AFB1-8,9-epoxid AFB1GSH 2.Aflatoxin inaktiválása pulykákban: AFB1 AFB1-8,9-epoxid AFB1GSH CYP 1A DNS-kötés, mutáció, toxicitás Glutation transzferáz GST cytochromes P450 (CYP) 1960 pulyka X-kór: az aflatoxin felfedezése

14 Aktív és biztonságos törzsek kiválasztása SOS-Chromotest ELISA- rendszer Kémiai analitika Indukciós Faktor Bontási (%) Bontási idő 24 h48 h72 h Mikroszervezetek E. coli 2,42,12,3<20 R. globerulusN58––2,620,79<20 R. ruberN361––3,0<20 R. erythropolisZFM 23,1––1,872,8771,69 R. erythropolisOM 7-23,12,11,779,284,3 R. erythropolisN112,01,41,397,6481,71 R. coprophilusATTC ,31,41,297,996,05 R. erythropolisNCIMB 97842,11,81,297,1198,55 R. erythropolisDSM 43062,11,31,297,5699,98 R. erythropolisIFO 12538––1,696,494,52 R. rhodochrousK402–1,91,498,1199,92 R. globerulusCW251,81,31,297,9799,98 Különböző rhodococcus törzsek különböző bontási útvonalat használhatnak az AFB1 bontásához Különböző bakteriális biotesztek használata Eltérő hatások: genotoxicitás vs. citotoxicitás

15 3. Fázis: A R. pyridinivorans AK37 törzs aktivitásának fokozása UV-mutagenezissel -A mutagenezishez UV-transziluminátort használtunk, 25 sec kontaktidővel ami kb. egy ezrelékes túlélést eredményezett -A mutáns klónokból 2000-et szelektáltunk, majd felszaporítás után ELISA lemezeken, 30%-os glicerolban -80C-on tároltuk -A klónok aktivitás screenjét 2ppm Aflatoxin B1-el kontaminált, és 10ppm zearalenont tartalmazó rendszerben, Aliivibrio fischeri toxicitásteszttel végeztük -Tíz megnövekedett aktivitású klónt szelektáltunk, ezeket használtuk az immobilizált élősejtes konstrukciókhoz

16 3. Fázis: Immobilizált élősejtek előállítása -Az immobilizáláshoz az elterjedten használt es molekulatömegű polivinil-alkoholt (Sigma-Aldrich) használtuk -Speciális polimerizációs és kérgesítő technikát fejlesztettünk ki -A gyöngyök rendkívül ellenállóak, 4hétig képesek intaktak maradni 200rpm kevertetés mellett A PVA-gyöngy SEM képén jól látható annak nyitott micellás szerkezete PVA-micella falában immobilizált R. pyridinivorans sejtek

17 2. Fázis: Rhodococcus pyridinivorans zearalenon-bontó képességének vizsgálata patkányon, uterotropikus bioassay módszerrel OECD Guideline for the testing of chemicals Uterotrophic Bioassay in Rodents (440) 18 napos (választás előtti) nőstény Wistar patkányok (MTA-KOKI Orvosi Géntechnológiai Részleg) Marker: uterus tömege

18 Kísérletek ZEARALENON DÓZIS-HATÁS VIZSGÁLAT kontroll: tiszta olivaolaj E2: 17  -ösztradiol (pozitív kontroll) 0,04 mg/kg bw Zearalenon több dózisban 0,1 ; 1 ; 5 ; 10 mg/kg bw Eredmények: Szignifikáns hatás uterus tömegére: E2 Zearalenon 5 mg/kg ; 10 mg/kg A testtömeg-növekedésre egyik kezelés sem volt hatással. BIODEGRADÁCIÓ-VIZSGÁLAT: kontroll: LB tápoldat LB tápoldat+20ppm Zearalenon R. pyridinivorans -sal 3 napig inkubálva, majd liofilizálón 20X koncentrálva (~47ppm toxin) LB tápoldat+ Zearalenon (20x koncentrálás után ~425ppm toxin) Eredmények: Szignifikáns hatás uterus tömegére: Zearalenon A testtömeg-növekedésre egyik kezelés sem volt hatással.

19 3. Fázis: Aflatoxin B1 bidegradációs kísérlet immobilizált törzsekkel Törzsek: -AK 37 (Rhodococcus pyridinivorans), -AK34UV (Rhodococcus pyridinivorans) Kísérleti mátrix: természetes Aflatoxin B1 szennyeződést tartalmazó kukoricából előállított szeszmoslék -Az 1ppm AFB1 tartalmú szeszmoslékhoz PVA gyöngyökben immobilizált mutáns és vad típusú AK37 törzseket adtunk (1-3,3-10mg száraz sejttömeg/ml mátrix tartalmazó, valamint üres- kontroll), majd 28 o C-on, 170 rpm-en, 3 napon keresztül rázattuk a lombikokat. -A minták maradék toxintartalmát a Wessling Hungary Kft laborjában HPLC módszerrel határoztuk meg.

20 4. fázis: A bakteriális mikotoxinbontás metabolizmusának feltárása De novo genom projekt indítása a R. pyridinivorans AK37 törzsből a BayGen Intézettel közösen: -a genom 5,27Mb-pár méretű, 60 contigba rendezve ( kb contigméret) Transzkriptóma analízis Zealarenon és Aflatoxin B1tartalmú táptalajon tenyésztett mikrobából Transzpozon mutagenezis könyvtár készítés és nullmutánsok szkreenelése az adaptált fluorimetriás és SOS-chromoteszttel 2D-proteom elválasztás és az indukált fehérjék peptid térképezése

21 4. Fázis: A toxinbontásban résztvevő enzimek azonosítása kétdimenziós proteom elválasztással kontroll ZearalenonAflatoxin B1 -A 2D protein térképezés lehetővé teszi induktív közegben expresszálódó enzimek azonosítását -A fehérjék első elválasztása izoelektromos pont (pH strip 3-11), -A második méret szerint (10%SDS-PAGE) történik -A kivágott foltok analízise, peptidszekvenálás MS/MS módszerrel

22 4.Fázis: A tandem tömegspektrometriával nyert peptidszekvenciák azonosítása a Rhodococcus pyridinivorans AK 37 genomjában LVTPELSGSLLPGITR10,002077Contig_16100Contig_16100 TMIQSPSGVILQEAADVHAR12,55596Contig_1867Contig_1867 ADVLTTGAGNPVGDK16,32116Contig_3453Contig_3480 FSTVAGESGSADTVR20,358313Contig_3580Contig_3580 DLPIYVVCPGR10,036984Contig_3791Contig_37100 ISGVGIDQPPYGIFVINQK13,62421Contig_4256Contig_4269 AQSILEKSGVNPDIR10,265346Contig_4967Contig_4987 AEIEGEMGDSHVGLQAR10,000159Contig_7100Contig_7100 ALELALAQIDK12,01249Contig_7100Contig_7100 EGSLIDMGVEQGFIR10,002031Contig_7100Contig_7100 FLLENTDVRDEIEK10,022029Contig_7100Contig_7100 IGVMFGSPETTTGGK10,004303Contig_7100Contig_7100 MTGALNNSGTTAIFINQLR19,76E-06Contig_7100Contig_7100 QAEFDILYGQGISK10,005468Contig_7100Contig_7100 SAAIDVIVIDSVAALVPR10,00487Contig_783Contig_794 SGSWYTYEGDQLGQGK10,000106Contig_7100Contig_7100 Peptid szekvencia találat E-value Contig Ident.% Posit.%

23 További célkitűzések A MYCOSTOP projekt 2011-es befejezéséig immobilizált toxinbontó mikroba alapú, félüzemi szeszmoslékmentesítő technológia kidolgozása Multimikotoxin-bontó mikrobatörzs nemesítése, aktivitás fokozása UV- és transzpozon mutagenezis technikákkal (R. erythropolis Ni1) A metabolizmus kutatáshoz nélkülözhetetlen genetikai alapok megteremtése: de novo genom projekt a Cupriavidus basiliensis-ből (ochratoxin) reszekvenálás a Rhodococcus erythropolis Ni1 törzsnél, fizikai térkép a R. pyridinivorans AK37 törzsből A toxin metabolizmus feltárása Aflatoxin B1, Zearalenon, T2-toxin és Ochratoxin esetében A toxin metabolizmusért felelős enzimek expressziója, biokémiai jellemzése Takarmányadalékként alkalmazható, mikotoxin dekontaminációra alkalmas enzimkészítmények előállítása


Letölteni ppt "Mikotoxinok biodegradációjára alkalmas mikrobák szelekciója és alkalmazásuk lehetőségei Kukolya József, Cserháti Mátyás, Krifaton Csilla, Háhn Judit, Táncsics."

Hasonló előadás


Google Hirdetések