Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: deléció izolálása P elem remobilizációval.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: deléció izolálása P elem remobilizációval."— Előadás másolata:

1 Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: deléció izolálása P elem remobilizációval

2  P elem: mozgó genetikai elem- ugrásához transzpozáz szükéges  Vad típusú P elem Laborban használt P elem  P elem mobilizációhoz szükséges: mutátor elem mutátor elem transzpozáz elem transzpozáz elem  Inszerció - nem mindig génbe inszertálódik - lehet a vizsgált gén közelében  Remobilizáció lehet - precíz - nem precíz: inszerció, deléció - nem precíz: inszerció, deléció  Deléciós mutánsok izolálása Bevezetés:

3 Deléció előállítása P elem remobilizációval vizsgált gén P elem transzpozá z szomszéd gén

4 Deléciós mutánsok azonosítása  Fenotípus alapján: létfontosságú génben történt deléció letalitást okoz  PCR-al: megfelelő primerekkel a kapott deléció mérete meghatározható P elem deléció PCR primer vizsgált gén

5 1. Jumpstarter hímek előállítása: w, P(w + )/Y; +/ TM3, Sb P(Δ2-3) ♂ Jumpstarter hímek: Jumpstarter hímek: piros szem, rövid szőr A legyek szeme piros a w + miattSb: rövid szőr fenotípus Deléció létrehozása egy X kromoszómás génben w, P(w + ) / w, P(w + ) ♀ ♀ X +/Y; Df(3L)C4/TM3, Sb P(Δ2-3) ♂ ♂ Utódok: Jumpstarterek ivarsejtjeiben játszódik le a P elem mobilizációja.

6 2. P elem-hiányos kromoszómák azonosítása ΔPΔP w, P(w + )/Y; +/ TM3, Sb P(Δ2-3) ♂ Df(1)6C, w/FM6, w; +/+ ♀ ♀ jumpstarter hím balanszer kr-t hordozó nőstény X FM6: első kromoszómás balanszer, Bar domináns mutációt hordozza G 1 utódok: w, ΔP/FM6, w; +/+ ♀ fehér és Bar szemű, valamint hosszú szőrű ΔP jelöli a P elem hiányt w, ΔP/FM6 A w, ΔP/FM6 genotípusú G 1 utódok egy-egy olyan kromoszómát hordoznak, amelyből a P elem kiugrott. Ezt úgy is mondhatjuk, hogy a G1 utódok egy- egy „mutagenizált” kromoszómát reprezentálnak. A P elem kiugrása lehet pontos, vagy pontatlan.

7 3.lépés: törzsalapítás FM6, w/Y ♂ ♂ w, ΔP/FM6, w ♀ X w, ΔP/Y ♂ w, ΔP/FM6, w ♀ FM6, w/Y ♂ törzsfenntartás  A törzsalapító keresztezéseket a nem balanszeres w, ΔP/ Y hímek megjelenésére, vagy hiányára teszteljük.  A w, ΔP/ Y hímek hiánya azt mutatja hogy a w, ΔP kromoszómán letális mutáció képződött.  A keresztezésből származó fertilis utódok átrázásával fenntartható az új mutációt hordozó törzs. X FM6, w/FM6, w ♀

8 A deléció kimutatása és méretének meghatározása A kapott mutáns törzsekből genomikus DNS-t kell izolálni, majd megfelelő primerek segítségével a deléció mérete meghatározható. Vad típusú PCR termék mutáns PCR termék P elem Vizsgált gén Deléció képződése esetén: A deléciók mérete néhány bázispártól citológiailag látható nagyságig terjedhet. mutánsvad típus

9 Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: deléció izolálása hímrekombinációval

10 Bevezetés: A P elem mobilizációja crossing overt okoz Drosophila ivar- és szomatikus sejtekben is, ahol rekombináció normálisan nem történik.A P elem mobilizációja crossing overt okoz Drosophila ivar- és szomatikus sejtekben is, ahol rekombináció normálisan nem történik. A P elem indukált rekombinációt tanulmányozták osztódó ivarsejtekben a rekombináns kromoszómák struktúrájának vizsgálatával.A P elem indukált rekombinációt tanulmányozták osztódó ivarsejtekben a rekombináns kromoszómák struktúrájának vizsgálatával. Korábbi tanulmányok szerint a legtöbb P elem indukált hímrekombinációs esemény az inszercióval szomszédos szekvenciák delécóját vagy duplikációját váltja ki.Korábbi tanulmányok szerint a legtöbb P elem indukált hímrekombinációs esemény az inszercióval szomszédos szekvenciák delécóját vagy duplikációját váltja ki.

11 Három modell a P elem indukálta rekombinációs folyamatok magyarázatára 1.A P elem transzpozáz random vág a genomban, ahol a transzpozáz expresszálódik. Ezek rekombináns helyeket produkálnak. 2.A hímrekobináció egy mellékterméke azoknak a kettősszálú töréseket javító mechanizmusoknak, amelyek a P elem kivágódása után következnek be. 3.A P elem egy másik DNS duplexen elhelyezkedő P elemmel transzpozáz bekötődésével „hibrid elemet” alkot a sister kromatidákon.

12 Első lépésben a P elem jobb végéhez és a sister kromatidán lévő P elem bal végéhez transzpozáz kapcsolódik „hibrid elemet” formálva. Midkét végen duplaszálú törés következik be. A P elemek szabad végei target helyhez tapadnak, amivel rekombinációs mechanizmust indukálnak A P elemet hordozó kromatidák rekombinánsok. A duplaszálú törések kijavításával a kromoszóma funkcionális lesz, de valószínűleg nem rekombináns. P elem A B C C D D

13 P elem A BC D A BC D D A B C C D A B B C D A független rekombinánsok rekombinánsok száma száma Hímrekombináció során a P elem mindkét oldalán képződik deléció, vagy duplikáció

14 A hímrekombináció egy hőmérsékletfüggő folyamat

15 Rekombinánsok vizsgálata: PCR-el DNS szekvenálással Komplementációs teszttel A kromoszómák citólógiai vizsgálatával ABCDMs 5 kb 3 kb 1 kb 0,5 kb Mutáns jelöltek P-elem 3 kb

16 Az ábrán egy hímrekombinációval indukált deléció látható, amelynek mérete az 50C20-23 régiótól az 50D4-7 régióig terjed. A deléciók mérete néhány bázispártól néhány száz kb.-ig terjedhet. A nagyobb deléciókat nem lehet PCR amplifikációval kimutatni. A nagyobb deléciók méretét komplementációs teszttel, és nyálmirígy óriáskromoszóma preparátumok citológiai analízisével határozzák meg. A deléciók mérete

17 Mikor alkalmazzunk hímrekombinációt?  A vizsgálni kívánt gén közelében van P elem inszerció.  Túl nagy génsűrűség esetén, amikor a P elem remobilizációval indukált deléció érintheti a szomszédos géneket. Vizsgált gén P elem Szomszéd gén DELÉCIÓ

18 Kísérlet deléciós mutánsok izolálására hímrekombinációval P(w + ) Y w-w-w-w- w-w-w-w- mutátor törzs CyO,P(Δ2-3) transzpozáz forrás w-w-w-w- w-w-w-w- m m marker mutációt hordozó törzs w-w-w-w- m m

19 P(w + ) marker + marker A rekombináns kromoszómákat a P elem és egy marker mutáció szegregációjának változása alapján lehet azonosítani gén gén gén

20 P(w + ) w-w-w-w- w-w-w-w- CyO,P(Δ2-3) w-w-w-w- m Y m mutátor törzs X P(w + ) w-w-w-w- m Y CyO,P(Δ2-3) „jumpstarter” hím X w-w-w-w- m m w-w-w-w- w-w-w-w- m m w-w-w-w- P(w + ) w-w-w-w- m m Y

21 w-w-w-w- m m w-w-w-w- w-w-w-w- m m Y w-w-w-w- w-w-w-w- X Tm3, Sb, Ser Tm6,Tb, Hu P(w + ) w-w-w-w- w-w-w-w- m m w-w-w-w- m Y Tm6,Tb, Hu Homozigóta életképes Homozigóta letális X w-w-w-w- m P(w + ) Y Tm6,Tb, Hu / Törzsalapítás A rekombináns kromoszómák fenntarthatók a balanszerrel szemben. / /

22 Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: transzgénikus állatok előállítása

23 Transzgénikus legyek előállítása P elem mikrionjektálással A kívánt DNS szakasz vagy szakaszok P elem végek közé vannak helyezve egy plazmidban amit transzpozáz jelenlétében injektálnak M citotípusú pre- blasztoderma állapotban lévő embriókba. Transzpozáz forrás biztosítása: - tisztított transzpozáz fehérje a plazmidhoz kötve - „helper” plazmiddal történő együttes injektálás - endogén transzpozáz forrást tartalmazó legyekbe történő injektálás 5’-vég3’-vég white bakteriális szekvencia Hsp70 EcoRI, KpnI, BamHI, XbaI, HpaI, XhoI, PstI klónozó hely

24 Az embrionális fejlődés korai állapotai Megtermékenyített pete 30 percel megtermékenyítés után. A magi osztódások 10 percenként követik egymást egy sokmagvú sejtet a sinciciális blasztodermát létrehozva. Kb 9 osztódás után (512 mag) a sejtmagok kivándorolnak a felszínre A felszínen további négy osztódás történik. A sejteknek egy kis csoportja, a polsejtek kb. 2.5 óra múlva formalódnak a posterior végen. Ezekből lesznek a felnőtt állat ivarsejtjei. Három órával a megtermékenyítés után a sejtmagokat memrán zárja körül és a sejtek egy réteget képeznek az embrió felszínén, ez a sejtes blasztoderma állapot.

25 Az injektálás főbb technikai problémái 1.a pete belső nyomása 2. az injektálás során keletkező „lyuk” befedése Megoldások: 1.Az embrió kontrollált körülmények között végzett szárítása az injektálás előtt Zalokar: a lyuk befedése heptánban oldott gum demarral Ilmensee: kezelés 1.2 % sulfoszalicilsav oldattal -Geyer-Duszynska: a beavatkozás halokarbon olaj alatt történik

26 Szükséges eszközök 1.Mikroszkóp, vibráció mentes asztal 2.Mikromanipulátor Egyszerű mikromanipulátor elégséges. 3.Tű – tűhúzó - kapilláris A tű hegyének élesnek kell lennie, 1-10  m átmérővel. 3.Injektáló rendszer Lehetővé teszi a tű tartalmának folyását amikor az az embrióban van és nem engedi azt amikor a tű az olajban van. - vizzel töltött - olajjal töltött - levegős rendszer

27 Az injektálás menete 0. A kívánt konstrukt előállítása 1. Az emriók preparálása - petéztetés -dekorionálás -sorbarakás Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó -szárítás (a térfogat 1-5 %-a) 2. Injektálás pl oldat 3. Gondviselés

28 injektálás w - embriókba w - szemű G O állatok keresztezés nem transzformált, w - szemű állatokkal ivarsejt prekurzor donor DNS-t hordozó sejtmagok sejtmagok donor plazmid nem autonóm P elem transzpozáz gén marker w + allél hibás 5’-vég transzgén 3’-P 5’-P donor DNS-t hordozó és w + szemű transzgénikus utódok w - szemű nem transzgénikus utódok Összefoglalás


Letölteni ppt "Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: deléció izolálása P elem remobilizációval."

Hasonló előadás


Google Hirdetések