Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Mennyire különbözik két ember genomja? Genetikai polimorfizmusok és azok azonosításának alapelvei Mennyire különbözik két ember genomja? Genetikai polimorfizmusok.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Mennyire különbözik két ember genomja? Genetikai polimorfizmusok és azok azonosításának alapelvei Mennyire különbözik két ember genomja? Genetikai polimorfizmusok."— Előadás másolata:

1 Mennyire különbözik két ember genomja? Genetikai polimorfizmusok és azok azonosításának alapelvei Mennyire különbözik két ember genomja? Genetikai polimorfizmusok és azok azonosításának alapelvei Dr. Rónai Zsolt Semmelweis Egyetem, Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet

2 A humán genom, genetikai polimorfizmusok két nem rokon személy genetikai állománya közötti különbség: 0,1% bázispár variációs lehetőségek száma: = 9,41 ·

3 Genetikai polimorfizmusok „Mutáció” ritka allél < 1%betegség „Polimorfizmus” ritka allél > 1%jelleg, hajlam, tulajdonság Egyetlen bázisra kiterjedő variáció Hosszabb variábilis szakasz (ismétlődési polimorfizmusok) egypontos nukleotid polimorfizmus (SNP), pontmutáció, single nucleotide variation: 1 bázispár inzerció, deléció, szubsztitúció különböző hosszúságú szakaszok ismétlődése

4 Genetikai polimorfizmusok Ismétlődési polimorfizmusok  Transzpozon eredetű ismétlődések  long interspersed element (LINE)  short interspersed element (SINE)  retrovírus-szerű elemek hosszismétlődés 6–8 kb 100–300 bp 3–11 kb  Szegmentális duplikáció  1–200 kb blokkok ismétlődése ugyanazon vagy másik kromoszómán  Egyszerű direkt ismétlődések  1–13 bp hosszú szakasz: mikorszatelliták; trinukleotid ismétlődések  14–500 bp-os szakaszok: minszatelliták / VNTR-ek (variable number of tandem repeats)

5 Genetikai polimorfizmusok A „rövid szakaszt érintő” polimorfizmusok (SNP és VNTR) hatása SNP VNTR kódoló szakaszonnem kódoló szakaszon báziscsere: semmi AS-csere splicing nonsense ins / del: frame-shift 3-mal osztható: ismétlődő peptidszakasz 3-mal nem osztható: frame-shift semmi / nem ismert / transzkripciós aktivitás / mRNS élettartam… semmi / nem ismert / transzkripciós aktivitás / mRNS élettartam…

6 Genetikai polimorfizmusok A „rövid szakaszt érintő” polimorfizmusok (SNP és VNTR) hatása SNP VNTR kódoló szakaszon báziscsere: semmi AS-csere splicing nonsense ins / del: frame-shift 3-mal osztható: ismétlődő peptidszakasz 3-mal nem osztható: frame-shift sarlósejtes anémia fruktóz intolerancia cisztikus fibrózis „0” vércsoport Huntington-betegség 21-hidroxiláz deficiencia

7 Genetikai polimorfizmusok A „rövid szakaszt érintő” polimorfizmusok (SNP és VNTR) hatása SNP VNTR nem kódoló szakaszon semmi / nem ismert / transzkripciós aktivitás / mRNS élettartam… semmi / nem ismert / transzkripciós aktivitás / mRNS élettartam… öröklődő tulajdonság, hajlam bizonyos betegségekre öröklődő tulajdonság, hajlam bizonyos betegségekre

8 Polimorfizmusok vizsgálatának elve  PCR: bázissorrendtől – genotípustól – függően különböző méretű és/vagy színű DNS-molekulákat hozunk létre,  elektroforézis ill. fluoreszcens detektálás: egy speciális technikával az első lépés során keletkezett reakciótermékeket nagyság szerint elválasztjuk („sorba rendezzük”) és láthatóvá tesszük, méretüket leolvassuk,  értékelés: a keletkezett termékek mérete alapján következtetünk a genotípusra, mivel az első reakció elvét ismerve tudjuk, hogy a különböző méretű fragmentumok mit jelentenek.

9 Polimeráz láncreakció minta: teljes genom minta bármely szövetből származhat DNS-dependens DNS polimeráz a lánc szintézisét elkezdeni nem tudja a megsokszorozni kívánt szakaszt primerekkel „kijelöljük”, a bázispárnyi szakaszból 80– bp hosszú régiót amplifikálunk

10

11 Polimeráz láncreakció STOP 2. ciklus

12 Polimeráz láncreakció 3. ciklus

13 Polimeráz láncreakció 4. ciklus

14 Ciklus n DNS-szál 2 n Kívánt hosszú 2 n+1 – 2(n+1) Hosszabb 2(n+1) Arány % ,000 25,000 50,000 68,750 81,250 98,926 99,998 99, Polimeráz láncreakció

15 Reakció: elméleti és tényleges amplifikáció ciklusszám termék mennyisége elméleti tényleges

16

17 Elektroforézis: a detektálás Térben adott idő után hol van hagyományos agaróz gél-elektroforézis Időben adott helyen mikor van kapilláris-elektroforézis, elektroforetikus chip UV utófestésEtBr a gélben UV, lézer

18 PCR-optimalizálás Primertervezés: a „jó” primer  specifikusan csak a kívánt helyre kötődik  nem képez másodlagos szerkezeteket  a mintához stabilan kötődik, T m  53 °C, s a két primer T m -ja között nincs nagy különbség,  a GC : AT arány 53–63 % (ha ez az arány túl alacsony, akkor a primer nem kötődik stabilan a DNS-hez: az T m alacsony lesz; ha a GC arány túl nagy, akkor erősebben kötődik a DNS egyéb, nem teljesen komplementer részeihez),  a 3’ végen lévő 1–2 bázis G vagy C, mert így ez stabilan kötődik  jobb extenzió,  a primer 3’ végén lévő 10 bázisból álló szekvencia nem komplementer 80%-osan a DNS más részével — ellenkező esetben, különösen, ha ez a szakasz GC-gazdag, akkor nem kívánt helyre is kötődni fog a primer.

19 PCR-optimalizálás Az anneálási hőmérséklet függése – gradiens PCR

20 Egyetlen bázisra kiterjedő variáció Hosszabb variábilis szakasz (ismétlődési polimorfizmusok) egypontos nukleotid polimorfizmus (SNP), pontmutáció, single nucleotide variation: 1 bázispár inzerció, deléció, szubsztitúció különböző hosszúságú szakaszok ismétlődése Polimorfizmusok kimutatásának alapelve PCR + elektroforézis a hosszkülönbség közvetlenül kimutatható az egyes allélok hossza azonos a szekvencia eltérését hossz- különbséggé kell alakítani

21 Hosszúság-polimorfizmusok vizsgálata A DRD4 exon III 48 bp VNTR          III. exon – G-fehérje 48 bp (16 AS) 2–10  ismétlődik

22 xy48n P1P1 P2P2 M bp 300 bp 500 bp 700 bp 1000 bp 2  :  :  :  :  :  :  :  :  : 763 A DRD4 exon III 48 bp VNTR vizsgálata

23 M8 200 bp 300 bp 500 bp 700 bp 1000 bp 2 ismétlődés 3 ismétlődés „heteroduplex”: az egyik szál 2 , a másik 3  A legkisebb elektroforetikus mobilitású termék:

24 Hosszúság-polimorfizmusok vizsgálata Az „allél-kiesés”: rövid termék preferenciális képződése N N N N R PPP O H dGTPdITP N N N N R PPP O H H2NH2N

25 SNP-k vizsgálata P1P1 P2P2 –521CT 1. PCR Restrikciós fragmentum hosszúság polimorfizmus (RFLP) Restrikciós endonukleáz II.: felismernek egy 4–8 bázispár hosszúságú szekvenciát, s a DNS-t ott elvágják. Fsp I: TGCGCA 2. RFLP –521T TGCGCA –521C CGCGCA hasított hasítatlan CCCTTT

26

27 SNP-k vizsgálata Allél-specifikus amplifikáció (ARMS) C-spec.P2P2 CT P2P2 T-spec.P2P2 CT P2P2 C-specifikus reakcióT-specifikus reakció Elválasztás eredménye C T C T C T külső allél-spec.

28 SNP-k vizsgálata Kétirányú allél-specifikus amplifikáció C –521C 405 bp –521CT SNP T –521T 235 bp Elválasztás eredménye 405 bp 605 bp 235 bp TTCTCC

29 SNP-k vizsgálata MASA: multiplex allél-specifikus amplifikáció AS A P2P2 A P2P2 B C D AS B AS C AS D Kísérlet eredménye abcd ABCD külső SNP A SNP B SNP C SNP D Genotípusok Aa BB CC dd

30 SNP-k vizsgálata Primerek az allél-specifikus amplifikációhoz  primer pozíciója (3’ vége) adott  ha nem kétirányú ASA, akkor a primer iránya változtatható  T m lehet magasabb néhány fokkal, mint a külső primereké  főleg a primer hossza, és nem az olvadáspont a döntő – 20–22 bázisnál hosszabb primer mindenképp „elindul”  dITP a reakcióelegyben segít kétirányú ASA esetében

31 SNP-k vizsgálata Luminex Alapelv: „flow cytometer” – sejtek helyett gyöngyök kettős lézeres detektálás: 1.: melyik gyöngy? 2.: mi van a gyöngyön?

32 Multiplex SNP genotipizálás ASA + specifikus fluoreszcens jelölés iC:iG bázispárral + Luminex N N O NH2H2 ribóz N N N N H2NH2N O H izocitidinizoguanozin 1. PCR iC SNP-k vizsgálata Eragen (Luminex)

33 iC allél-specifikus amplifikáció AS primer 5’ végén 8 bázisos szekvencia a Luminex gyöngy felismeréséhez 2. ASA iG Luminex gyöngyök hozzáadása biotin iG biotin SNP 1 SNP 2 3. SNP-k vizsgálata Eragen (Luminex)

34 SNP-k vizsgálata streptavidin Streptavidin–fluoreszcens festék komplex hozzáadása4. 64 iG biotin SNP 1 F Detektálás (Luminex) lézer 1: gyöngy Lézer 2: allél Eragen (Luminex) SNP … 48 Lézer 1 Gyöngy … Lézer 2

35 SNP-k vizsgálata GTCAGAACTCAAG?AAGTCAAGCTAG 1. T-allél kimutatása jelölt primer + dCTP + dGTP + dTTP + jelöletlen ddATP Reakcióelegy Termék primer T C GTCTTGAACG T GTCTTGA GTCAGAACTCAAG?AAGTCAAGCTAG GTCTTGA GTTC GTTC GTCTTGA GTTCA A Primerextenzió I. C/T SNP

36 SNP-k vizsgálata GTCAGAACTCAAG?AAGTCAAGCTAG C/T SNP 1. C-allél kimutatása jelölt primer + dCTP + dATP + dTTP + jelöletlen ddGTP Reakcióelegy Termék primer T C GTCTTGAACG T GTCTTGA GTCAGAACTCAAG?AAGTCAAGCTAG GTCTTGA GTTC G AAG GTCTTGA GTTCA Primerextenzió I. G méret = melyik allél, szín = melyik SNP (Seqenom MassEXTEND)

37 SNP-k vizsgálata Primerextenzió II. GTCAGAACTCAAG?AAGTCAAGCTAG C/T SNP jelöletlen primer + 4 (min. 2) különböző színű ddNTP Reakcióelegy GTCTTGAACG T GTCAGAACTCAAG?AAGTCAAGCTAG Termék T C GTCTTGA GTTC G GTCTTGA GTTCA GTTC méret = melyik SNP, szín = melyik allél (ABI SNaPshot)

38 multiplex PE-n alapuló rendszer sok ember és/vagy sok SNP vizsgálatára egy vizsgálat: 4608 genotípus szeres PCR PE reakció ACGTACGTACGT A B L SNP 1SNP 2SNP 12 … 384-es tálca, minden pozíciója egy „4x4-es array” a megfelelő „tagekkel” +ABC +DEF +GHI –JKL pozíció színe: genotípus 12 hely: 12 SNP SNPstream SNP-k vizsgálata

39 Monogénes betegségek Trinukleotid ismétlődéssel járó betegségek Betegség Fragilis X-szindróma Huntington-kór Dystrophia myotonica Lokalizáció Xq23.7 4p q13.3 Trinukleotid CGG CAG CTG normális 6–54 11–24 5–37 kóros > –82 > 50 DNS nem kódoló kódoló nem kódoló Fragilis X szindróma: második leggyakoribb mentális retardációt okozó öröklődő rendellenesség Dystrophia myotonica: dorsalis végtagizmok, arcizmok sorvadása, myotoniás reakció (relaxációs idő  ), szív, légzőizmok, GIR

40 Monogénes betegségek Huntington-betegség  CAG ismétlődés  poly-Gln fehérjerész („huntingtin”)  proteázok nem tudják lebontani  késői megjelenésű neurodegeneratív elváltozás  autoszomális domináns Kialakulás  40–50 év körül, ritkábban előbb  arc és a végtagok szabálytalan, rövid tartamú mozgásai  személyiségváltozás, depresszió, demencia  lefolyásának ideje 9–17 év Tünetek Öröklődés

41 Monogénes betegségek Sarlósejtes anaemia 22 11 Haemoglobin A 11 22 11 22 11 22 Haemoglobin S Globin láncot kódoló gének:  -család:  1,  2,  1 és  2 gén terméke:  -lánc   -család: , G , A , ,  Egészséges felnőtt haemoglobin: 96%  2  2 (HbA) kis mennyiségben:  2  2 (HbA 2 ) és  2  2 (HbF) Sarlósejtes anaemia:  -gén pont- mutációja  A–T bázis- csere  Glu–Val csere  „HbS”  megváltozott fel- színű molekula  másik  - lánccal össze tud kapcso- lódni.

42 Sarlósejtes anaemia Monogénes betegségek Diagnózis, tünetek:  sarlósejtek kapilláriselzáródást okoz- nak: végtagfájdalmak, fekélyek, fe- mur, humerus asepticus necrosisa  sarlósejtek akkumulációja a lépben  fertőzések elleni védekezés   tüdő: csökkent vérellátás  tüdő- gyulladás  agy, máj, vese, pancreas hypoxiás károsodása  preanatalis dg.: chorionboholy min- tavétel Homozigóta: letális (prenatalis dg.!) Heterozigóta: a vvs-ek kb. 1% károsodott, de: védelem malária ellen

43 21-hidroxiláz deficiencia (congenitalis adrenalis hyperplasia) Monogénes betegségek andosztendion koleszterin pregnenolon progeszteron 11-dezoxikortikoszteron kortikoszteron aldoszteron dehidroepiandrosztendion 17-OH-pregnenolon 11-dezoxikortiozl 17-OH-progeszteron tesztoszteron kortizol 21-hidroxiláz 3-  -dehidrogenáz 11-  -hidroxiláz 3-  -dehidrogenáz 11-  -hidroxiláz STOP nincs negatív feed back ACTH-szint magas 17-hidroxiláz

44 Típusok:  sóvesztő  „szimpla” virilizáló  nem klasszikus Tünetek:  lányok „fiú(s)” külső nemi szervekkel születnek  nemi érés fiúknál sem teljesen normális Háttér:  több pontmutáció (nonsense mutáció) ill. 8 bp del (pseudogén) Megoldás:  chorion boholy minta  prenatalis dg. (allél-specifikus PCR)  in utero hormonkezelés 21-hidroxiláz deficiencia (congenitalis adrenalis hyperplasia) Monogénes betegségek

45 Mutációk vizsgálatának technikai nehézsége: 21-hidroxiláz deficiencia (congenitalis adrenalis hyperplasia) Monogénes betegségek a pseudogén az „RCCX” modul részeként a 6-os kromoszóma rövid karján normálisan is megtalálható CYP21B RP1C4 TNXB CYP21B CYP21A TNXA RP2 Monomodular Bimodular Trimodular RP1C4 RP1C4 TNXB CYP21A TNXA RP2 CYP21A TNXA RP2

46 Mutációk vizsgálatának technikai nehézsége: 21-hidroxiláz deficiencia (congenitalis adrenalis hyperplasia) Monogénes betegségek a pseudogén az „RCCX” modul részeként a 6-os kromoszóma rövid karján normálisan is megtalálható aktív gén szelektív amplifikálása: deléció helyéről induló primerek alkalmazásával

47 Fenilketonuria Monogénes betegségek minden újszülöttet szűrnek gyakori (1:9000) tünetek kialakulása jól csökkenthető klasszikus kofaktor defektusos dopamin, szerotonin, noradrenalin szintézis is károsodik

48 Cysticus fibrosis Monogénes betegségek NH 3 + COO – NBD 2 NBD 1 MSD 1 MSD 2 R cysticus fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) fehérje ioncsatorna a légutak, GIR, nyálmirigyek, urogenitalis rendszer mirigyeiben

49 Cysticus fibrosis Monogénes betegségek Leggyakoribb életet veszélyeztető genetikai betegség a fehérbőrű népességben 1:2500autoszómális recesszív minden 25. személy hordozó elterjedésének oka: védelmet nyújt kolerával szemben leggyakoribb mutáció:  F508, de több száz más mutációt azonosítottak már – legtöbb a NBD-ekben fehérje működőképes lenne, de az ERAD lebontja

50 Cysticus fibrosis Monogénes betegségek Tünetek:  tüdő: köhögés, tüdőgyulladás  GIR: bélelzáródás (meconium ileus),  pancreas: exocrin: emésztési zavar, endocrin: diabetes mellitus  verejtékmirigy: dg.: [Cl – ] > 60 mM, a gyerek bőre „sós” Genetikai dg.:  ismert mutációk: PCR (3 bp del), ASA, RFLP, stb.  ismeretlen mutációk: pl. szekvenálás, SSCP  prenatalis dg. csak ha már született egy beteg gyerek a csalásban, sok mutáció miatt a szűrés nem megvalósítható (egyelőre) Kezelés:  szupportív: tünetek enyhítése  génterápia: a CFTR gént tartalmazó adenovírussal

51 Kapilláris-elektroforézis + – mintapuffer detektor lézer / UV lézerek kapilláris kettőstörő tükör szűrők PMT lencse szűrők Analitikai alkalmazások (DNS)  ssDNS elválasztás: primerek tisztaságának ellenőrzése, SNP- analízis (primerextenzió)  dsDNS analízis: PCR-fragmentum analízis, (szekvenálás) Mikropreparatív felhasználás (DNS)  frakciógyűjtés

52 K1K1 K2K2 1x 4x 5x6x 9x heteroduplexek 1x / 8x 4x / 9x 4x / 5x 5x / 6x 3x / 8x 1x / 7x perc 34 Mikroszatellita polimorfizmusok vizsgálata Kapilláris-elektroforézis  DNS-ujjlenyomat  linkage analysis, teljes genome scan, genom kontroll  trinukleotid ismétlődéssel járó betegségek

53 Kapilláris-elektroforézis „DNS-ujjlenyomat”: apasági vizsgálat STR: Short Tandem Repeat (mikroszatellita): 2–7 bp hosszúságú ismétlődési polimorfizmus nem kódoló génszakaszban A lókusz B lókuszC lókusz Polimorfizmus A lókusz B lókusz C lókusz Ismétlődési szám 2–11 20–40 8–27 Variáció = Kombinációs lehetőség: 10 2 · 21 2 ·

54 Kapilláris-elektroforézis „DNS-ujjlenyomat”: apasági vizsgálat STR: Short Tandem Repeat (mikroszatellita): 2–7 bp hosszúságú ismétlődési polimorfizmus nem kódoló génszakaszban A lókusz B lókuszC lókusz Anya Gyerek Férfi 1 Férfi 2 bp

55 Komplex jellegek genetikai háttere Multifaktoriális: genetikai + környezeti jellegek „A” gén „B” gén „C” gén „D” gén „E” gén környezet jelleg „Klasszikus genetikai” vizsgálatok  egypetéjű ikrek, családvizsgálatok, örökbefogadottak vizsgálata  számos nem monogénes betegség is családi halmozódást mutat szív- és érrendszeri betegségek, daganatok, személyiség jegyek, pszichiátriai rendellenességek

56 Komplex jellegek genetikai háttere A jelleg kialakításában szerepet játszó gének azonosítása „Linkage analysis” családfák vizsgálata Asszociáció vizsgálat populációk vizsgálata kiválasztott genetikai „markerek” teljes genom scan: mikro- szatelliták anatómiai, élettani „megfontolás” megfelelő kromoszóma- szakasz azonosítása kandidáns gén és polimorfizmusai

57 Komplex jellegek genetikai háttere Genetikai kapcsoltság: linkage equilibrium / disequilibrium AaBb pl.: ha A = 80%, a = 20% ill. B = 75%, b = 25%, akkor a várható együttes előfordulási gyakoriságok: ABAbaBab 60%20%15%5% ha ez valóban így van: linkage equilibrium, ha nem: linkage disequilibrium (LD) Két lókusz kapcsolt öröklődése: milyen gyakran történik rekombináció a polimorf helyek között

58 Komplex jellegek genetikai háttere Haplotípus ABAbaBab a polimorf allélok relatív kromoszómális elrendeződése Meghatározása: családok genotípus adatai alapján számítógépes algoritmusokkal „direkt molekuláris”: PCR-módszerekkel

59  –521CT –615AG –616CG 120 bp dup 0,0013 0,0922 0,0248 –616CG 0,1488 0,4021 –615AG 0,1859 D = p AB – p A ·p B Komplex jellegek genetikai háttere A DRD4 gén polimorfizmusainak LD-analízise 120 bp dup –616CG –615AG –521CT exon IIIIIIIV 48 bp VNTR +1 5’ nem kódoló  2 = D2PAPBPaPbD2PAPBPaPb

60 A jelleg kialakításában szerepet játszó gének azonosítása Komplex jellegek genetikai háttere genetikai asszociáció vizsgálat statisztikai elemzés kiválasztott gének polimorfizmusainak vizsgálata kiválasztott jellegek (fenotípus) vizsgálata

61 Eset–kontroll vizsgálat Komplex jellegek genetikai háttere pp AAAaaaAAAaaa AaAaAaAa Család-vizsgálat azt vizsgáljuk, hogy az „eset” és a kontroll populációban a kandidáns gén polimorfizmusainak allélfrek- vanciája statisztikailag eltér-e egy- mástól azt vizsgáljuk, hogy az „érintett” gyerekek „gyakrabban kapják-e” szüleiktől a kandidáns gén vala- melyik allélját (fordított logika)

62 Eset–kontroll vizsgálat Komplex jellegek genetikai háttere Geno Geno kontroll eset  Tényleges  Geno 1 Geno 2 kontroll eset Várható 56/220  /220  /220  /220  120

63 Eset–kontroll vizsgálat Komplex jellegek genetikai háttere Geno Geno kontroll eset  Tényleges  Geno 1 30,5 25,5 Geno 2 89,5 74,5 kontroll eset Várható  2 = (tényleges – várható) 2 várható == (24–30,5) 2 30,5 (96–89,5) 2 89,5 (96–89,5) 2 89,5 (96–89,5) 2 89,5 +++  2 = 4,14 szabadsági fok = 1 p = 0,042 p < 0,1: tendenciap < 0,05: szignifikáns hatás

64 Eset–kontroll vizsgálat Komplex jellegek genetikai háttere Az Excel  2 próbája

65 Komplex jellegek genetikai háttere Eset–kontroll vizsgálat: populáció stratifikáció DRD4 exon III 48 bp VNTR „hosszú allél” (7  ) allél gyakorisága: kínai populáció: < 0,5%európai populáció: 19,5% nem a DRD4 „hosszú allél” felel a …

66 Komplex jellegek genetikai háttere Allél-átadás vizsgálata (Transmission Disequilibrium Test) AaAaAaAa ha egy kandidáns gén egyik allélja valamilyen jelleget okoz, akkor azokon a gyerekeken, akik szüleiktől ezt az allélt kapják, az adott jelleg megfigyelhető, ha egy csoport adott jelleget hordozó gyermeket megvizsgálunk, akkor statisztikailag azt figyelhetjük meg, hogy ők „gyakrabban kapták” a kandidáns allélt szüleiktől (…ezért hordozzák a jelleget)

67 Komplex jellegek genetikai háttere Allél-átadás vizsgálata (Transmission Disequilibrium Test) (b–c)2(b–c)2 b+cb+c TDT  2 = allél 1allél 2 allél 1 allél 2 a homozigóta szülő nem választ d homozigóta szülő nem választ b heterozigóta szülő átadta c heterozigóta szülő nem adta Nem átadott Átadott szabadsági fok = 1 csak heterozigóta szülők vehetők figyelembe „transmission distorsion”: ha lehet, jelleget nem hordozókat is érdemes vizsgálni

68 Real-time PCR Alapelv a PCR-termék képződésével arányos intenzitású fluoreszcencia keletkezik, amit a gép folyamatosan detektál exponenciális fázisban: arányos a kiindulási DNS mennyiséggel nincs PCR-t követő elektroforetikus analízis Alkalmazások  génexpresszió vizsgálata  genomban többször előforduló gének számlálása („gene dosage”)  SNP genotipizálás  új polimorfizmusok kimutatása (Light Cycler)

69 Real-time PCR Detektálás a keletkező összes PCR-terméket (nem specifikus) SYBR Green: dsDNS interkalátor szekvencia specifikus: 5’ nukleáz (pl. TaqMan) Q 5’3’ R R Q : riporter : quencher QR 1 3 2

70 ciklusszám RnRn CTCT Real-time PCR Mennyiségi mérés: a „threshold” ciklus ciklusszám lg  R n CTCT MHC08_G4 küszöb („threshold”) threshold: exponenciális fázisban threshold ciklus: hányadik ciklusban lépi át az adott minta fluoreszcenciája ezt a szintet – kiindulási DNS-mennyiséggel arányos

71 VIC FAM QV T QF C Detektálás a reakció után: SNP genotipizálás Real-time PCR (–) kontroll CC CT TT egy reakció tartalmazza a két allélra specifikus próbát különböző színű festékkel megjelölve

72 Detektálás a reakció után: olvadáspont analízis Real-time PCR eltérő szekvenciájú DNS-szakaszok olvadáspontja különbözik lassú felmelegítésT m : két szál elválik SYBR Green jel 

73 DNS-chip Gén-chip / hibridizációs chipElektroforetikus chip hibridizáció szekvencia analízis (minőségi / mennyiségi) elektroforézis miniatürizált kapilláris elektroforézis és: csatornák (és más elemek) szervzett 3D hálózata

74 Elektroforetikus mikrochip lézer detektor chip mikroszkóp objektív tükör szűrők tükör áramforrás A rendszer felépítése

75 306090secidő RFU Elektroforetikus mikrochip: alkalmazás A miniatürizálás előnyei Egy kísérlet…  anyag-, költség-, helyigény csökkentése,  kis súlyú, kompakt eszközök,  pontosan szabályozható körülmények,  nagy hőmérséklet- és koncentráció gradiensek,  nagyon kis időállandók (kis térfogat, nagy sebesség),  hatékony hőátadás  kisebb energia- és anyagfelhasználás, kevesebb hulladék,  jól definiált áramlási viszonyok  egyszerűbb és megbízhatóbb tervezés

76 Elektroforetikus mikrochip Kereszteződés ill. elágazás Szilárd felület: üveglap 1D  2D váltás

77 Elektroforetikus mikrochip frakciógyűjtés reakció az elválasztás előttmultiplex rendszer

78 0,2 RFU 1,0 1,5perc Hae III restrikciós endonukleázzal emésztett  X 174 plazmid DNS elválasztása Emésztés a „mintatartályban” Elektroforetikus mikrochip Lab-on-a-chip / µTAS: RFLP a chipen


Letölteni ppt "Mennyire különbözik két ember genomja? Genetikai polimorfizmusok és azok azonosításának alapelvei Mennyire különbözik két ember genomja? Genetikai polimorfizmusok."

Hasonló előadás


Google Hirdetések