Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László. AZ IN VITRO MUTAGENEZIS LEHETSÉGES FORMÁI A, regulátor régiók mutagenezise B, kódoló szekvenciák mutagenezise 1, deléciók.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László. AZ IN VITRO MUTAGENEZIS LEHETSÉGES FORMÁI A, regulátor régiók mutagenezise B, kódoló szekvenciák mutagenezise 1, deléciók."— Előadás másolata:

1 IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László

2 AZ IN VITRO MUTAGENEZIS LEHETSÉGES FORMÁI A, regulátor régiók mutagenezise B, kódoló szekvenciák mutagenezise 1, deléciók 2, inzerciók 3, szubsztitúciók 4, pont mutációk 5, hely specifikus mutációk (v. site-directed mutagenesis v. oligonukleotid-irányította mutagenezes) 6, random-mutagenezis

3 DELÉCIÓK I. DNS EcoRI mutált DNS ligálás Fragmentum kivágása restrikciós endonukleázzal.

4 DELÉCIÓK II. Deléciók készítése BAL 31 exonukleázzal: BAL 31 exonukleáz tulajdonságai: 1, 3’ 5’ exonukleáz aktivitás: mononukleotidok eltávolítása dupla szálú DNS-ről 2, 5’ 3’ exonukleáz aktivitás:mononukleotidok eltávolítása egy- szálú DNS-ről 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ exonukleáz aktivitás

5 EMÉSZTÉS BAL 31 EXONUKLEÁZZAL

6 Klasszikus site-directed mutagenezis elve egyszálú DNS mutációt hordozó oligonukleotid DNS polimeráz megszintetizálja a komplementer láncot az oligonukleotid, mint primer felhasználásával ligálás + bakteriális transzformáció vad plazmid mutáns plazmid

7 Klasszikus site-directed mutagenezis lépései 1, Oligonukleotid tervezése és szintézise 2, Oligonukleotid hibridizációja az egyszálú DNS plazmidhoz 3, A komplementer DNS lánc szintézise az oligonukleotid primer és DNS polimeráz felhasználásával a 4 dNTP felhasználásával 4, Az új DNS lánc „körösítése” DNS ligáz segítségével 5, Kompetens baktériumok transzfekciója 6, A mutáns plazmidot hordozó baktérium-telepek azonosítása 7, A mutáns DNS izolálása a baktériumokból (miniprep) 8, A mutáns DNS megerősítése DNS szekvenálás segítségével

8 PCR ALAPÚ MUTAGENEZIS Egyszerű esetben: 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ mutáns PCR termék primer

9 Bonyolultabb esetben: 5’ 3’ 5’ primer II. primer I. Ide szeretnénk mutációt betenni Mit lehet tenni?

10 MEGOLDÁS: MEGPRIMER MÓDSZER 5’ 3’ 5’ primer III. primer I. I. PCR reakció 5’ 3’ 5’ Hibridizáltatjuk az eredeti DNS-t az új PCR termékekkel

11 5’ 3’ 5’ primer III. megaprimer II. PCR reakció végleges mutáns PCR termék

12 „ADD-ON” MUTAGENEZIS primer II. primer I. 5’ 3’ 5’ primer II. primer I. 5’ 3’ 5’ primer IV. primer III.

13 primer II. primer I. 5’ 3’ 5’ primer IV. primer III. PCR-A PCR-B 5’ 3’ 5’ 3’ PCR termékek denaturációja, majd összekeverése

14 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ végek extenziója 5’ 3’ vagy 5’ 3’ primer I. 5’ primer II. 3. PCR reakció primer I és II-vel

15 TETSZŐLEGES GÉNSZAKASZ AMPLIFIKÁCIÓJA PCR SEGÍTSÉGÉVEL 5’ 3’ 5’ primer II. primer I. DNS Ezt a génszakaszt szeretnénk amplifikálni és utána egy adott vektorba ligálni. Milyen primereket tervezzünk? 5’ 3’ 5’ ?

16 3’ 5’ Resrtrikciós enzim hasítási helyeket kell elhelyezni a primerekben. pl. EcoRI pl. BamH1 EcoRI PCR reakció BamH1 PCR termék a tervezett restrikciós enzim hasítási helyekkel

17 5’ 3’ 5’ A tervezett primerek 5’ végének egyáltalán nem kell illeszkedni a komplementer DNS szálhoz lehet epitop-cimkét kódoló DNS szakasz EcoRI BamH1 PCR reakció PCR termék, mely tartalmaz egy epitop-cimkét és két restrikciós endonukleáz hasítási helyet.

18 „UNIQUE SITE ELIMINATION” MÓDSZER (Amesrham-Pharmacia)

19 „QUICKCHANGE” MÓDSZER (Stratagene)

20

21 „GeneEditor” MÓDSZER (Promega)

22 RANDOM MUTAGENEZIS FORMÁI 1, Kémiai mutagenezis 2, „Kazetta” mutagenezis 3, „Misinkorporációs” mutagenezis

23 KÉMIAI MUTAGENEZIS -- a random mutagenezis legjobb hatásfokú fajtája -- általában max. 200 bp mutagenezisére használják -- kémiai mutagénekkel kezelik a dupla szálú DNS-t, ilyenek: hidroxilamin, salétromossav, biszulfit, hidrazin, hangyasav, kálium-permanganát pl. hidroxilamin dezaminálja a citozint uracil keletkezik biszulfit dezaminálja a citozint uracil keletkezik hidrazin elhasítja a citozin és timin heterociklusos gyűrűit, ami végül a pirimidin nukleotidok elvesztéséhez vezet. A DNS replikáció során az „ilyen” nukleotiddal szemben bármelyik 4 nukleotid beépülhet -- sajnos a kémiai mutagenezis hatásfoka nagyon alacsony

24 „MISINKORPORÁCIÓS” MUTAGENEZIS -- in vitro DNS szintézisnél a 4 nukleotid közül az egyikből nagyon keveset teszünk a reakcióelegybe -- az „éhező” DNS polimeráz ezért a másik három nukleotidból fog beépíteni a hiányzó helyére -- a DNS polimeráznak rossz vagy hiányos hibajavító képességűnek kell lennie, pl. Klenow-fragment vagy Taq polimeráz


Letölteni ppt "IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László. AZ IN VITRO MUTAGENEZIS LEHETSÉGES FORMÁI A, regulátor régiók mutagenezise B, kódoló szekvenciák mutagenezise 1, deléciók."

Hasonló előadás


Google Hirdetések