Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit transzportfolyamatok vizsgálatára HEGYESI Orsolya 1, FÖLDES Anna 1,BORI Erzsébet 1, LŐRINCZ Ádám 2,

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit transzportfolyamatok vizsgálatára HEGYESI Orsolya 1, FÖLDES Anna 1,BORI Erzsébet 1, LŐRINCZ Ádám 2,"— Előadás másolata:

1 Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit transzportfolyamatok vizsgálatára HEGYESI Orsolya 1, FÖLDES Anna 1,BORI Erzsébet 1, LŐRINCZ Ádám 2, RÁSONYI-KOVÁCS Orsolya 2, BARABÁS József 2, Martin C. STEWARD 3, VARGA Gábor 1 1 Orálbiológiai Tanszék, 2 Arc- állcsont- Szájsebészeti és Fogászati Klinika; Semmelweis Egyetem, Budapest; 3 Faculty of Life Sciences, The University of Manchester, UK Háttér Sjögren szindróma sugárterápia (fej-nyaki tumorok kezelésére) acinus sejtek pusztulása csökkent nyáltermelés hiposzaliváció Primer sejtkultúrák létrehozásának kidolgozott lehetőségei huSMG – primary human salivary cell culture (primer humán nyálmirigy sejtkultúra) Tran et al. Tissue Eng :172 PTHSG – primary total human salivary gland (primer teljes humán nyálmirigy sejtkultúra) Szlavik et al. Tissue Eng : humán szubmandibuláris nyálmirigyből primer sejtkultúra létrehozása, PTHSG és huSMG tulajdonágainak összehasonlítása optimális kondíciók meghatározása polarizált epitheliális monolayer létrehozásához transzepitheliális ionáramok vizsgálata az elektrolit transzportban résztvevő transzporterek meghatározása Célkitűzés

2 Hepato-STIM medium (BD Biosciences) MEM medium (Sigma) 10%FBS, antibiotikum- antimycotikum oldat (Sigma) Disszociáló puffer: 0,04% tripszin (Gibco) és 0,15mg/ml kollagenáz (Sigma- Aldrich) DMEM-F12 mediumban (Gibco) Transwell Clear (Corning Costar) Membrán ellenállás (TEER) mérés: EVOM (World Precision Instruments) Warner két csatornás Ussing kamra (U-2500, Warner Instruments Co.) Sejttenyésztés – primer kultúra Nyálmirigy minták RNS izolálás: TRI Reagent (Sigma) Plasztik edényről and Transwell Clearmembránról RNS izolálás: Nucleospin RNA II. Kit (MACHEREY-NAGEL) RT-PCR: High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystem) HEPES-puffer oldat, 100% O 2 ; HCO 3 — puffer oldat, 5% CO 2 /95% O 2 és Cl — mentes oldat amilorid (10 µM), bumetanid (100 µM), forskolin (10 µM), ATP (50 µM), karbakol (100 µM); (Sigma) PTHSG Hepato-STIM 10x huSMG Hepato-STIM 10x days TEER (Ωcm 2 ) MEM 0 nap Hepato-STIM MEM 2 nap MEM 1. nap   gyorsan letapadó sejtek: PTHSG „mesenchimális progenitorok”   egy nap utáni felülúszó: huSMG „epitheliális progenitorok” PTHSG MEM 10x huSMG MEM 10x Kulcstranszporterek (RT-CR) Funkcionális vizsgálatok rövidzárlati áram (I sc ) mérésével Módszerek és eredmények ENaCNBC1NHE1NKCC1 Pozitív kontroll: K: Vese Minta jelölések: Me: membránról izolált Pl: plasztikról izolált Ti: nyálmirigy szövetből izolált Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, K Transzpithelialis rezisztencia mérése

3 * p<0,05 HCO PTHSG 44 I sc (µA/cm 2 ) ATPcarbachol forskolin PTHSG huSMG ∆I sc (µA/cm 2 ) * * p<0,05 vs baseline * ** I sc (µA/cm 2 ) PTHSG * * p<0,05 * ∆ I sc (µA/cm 2 ) 8388 * p<0,05 * PTHSG huSMG * PTHSG 8856 ∆I sc (µA/cm 2 ) HCO 3 - Cl huSMG * * p<0,05 * BAZOLATERALIS OLDAL APIKALIS OLDAL Na + CA II CO 2 CO 2 +H 2 O H 2 CO 3 H + +HCO 3 - HCO 3 - Cl - CFTR ? Cl - CaCC NKA K+K+ Na + ATP ADP+P K+K+ HCO 3 - K+K+ Na + Cl - NKCC1 H+H+ Na + HCO 3 - Na + Cl - NBC NHEAE Na + ACINI DUCT + Na + ENaC PKA II cAMP Ca 2+ forskolin ATP karbakol bumetanid 10 µM amilorid ∆I sc (µA/cm 2 ) PTHSG * * p<0,05 Bumetanid hatása az ATP stimulált szekrécióra Apikálisan adott amilorid hatása Klorid és bikarbonát megvonásának hatásaEredmények Vektoriális iontranszport aktiválása HCO 3 - Cl HCO 3 - Bum HCO 3 - & Cl - Ami HCO 3 - & Cl - Ami *- 993 NKA K+K+ Na + ATP ADP+P + nem stimuláltATP stimulált szekrécióra nem stimulált ATP stimulált szekrécióra

4 Primer sejtkultúra: polarizált epithel monolayer létrejötte mind PTHSG és huSMG kultúrából Hepato-STIM médium alkalmazása kulcsfaktor Transzepitheliális vektoriális elektrolit mozgás mindkét sejtkultúrában 1. 1.Apikális irányú anionszekréció (Acináris jellemző) Cl - és HCO 3 - Ca 2+ - aktiválta szabályozási útvonal 2. 2.Bazolateralis irányú Na + abszorpció (Duktális jellemző) Végeredmény: kétdimenziós nyálmirigyy kevert acinalis/duktális fenotípust mutatva: működése genetikai vagy farmakológiai módosításra egyaránt alkalmasMegbeszélés Támogatás: TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KMR ; OTKA: NI69008, CK80928 ; Bazolaterális oldal Apikális oldal Cl - ;HCO 3 ˉ Transwell Na +


Letölteni ppt "Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit transzportfolyamatok vizsgálatára HEGYESI Orsolya 1, FÖLDES Anna 1,BORI Erzsébet 1, LŐRINCZ Ádám 2,"

Hasonló előadás


Google Hirdetések