Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Tóth Anna Szilvia.  Minden élő sejtben megtalálható, koenzimként és szubsztrátként funkcionál.  Ezen tulajdonságai miatt az ATP alkalmas paraméter a.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Tóth Anna Szilvia.  Minden élő sejtben megtalálható, koenzimként és szubsztrátként funkcionál.  Ezen tulajdonságai miatt az ATP alkalmas paraméter a."— Előadás másolata:

1 Tóth Anna Szilvia

2  Minden élő sejtben megtalálható, koenzimként és szubsztrátként funkcionál.  Ezen tulajdonságai miatt az ATP alkalmas paraméter a talajban jelen lévő folyamatok és mikrobiális tevékenységek illetve biomassza mennyiség becslésére. extrakcióval biolumineszcenciával  Az ATP talajból extrakcióval kinyerhető, és biolumineszcenciával meghatározható a mennyisége.

3  A biolumineszcencia enzimkatalizált reakció, amely során fényemisszió történik.  A luciferáz enzim katalizálja a D-luciferin aktiválását ATP-vel, és a későbbi oxidációját az elektromosan gerjesztett oxiluciferinné.  Az oxiluciferin eredeti állapotába történő visszatérését fény kibocsátás kíséri. nagy érzékenységű, és igen alacsony, M –es koncentrációk detektálására is alkalmas.  A meghatározási mód nagy érzékenységű, és igen alacsony, M –es koncentrációk detektálására is alkalmas.  A jobb oldali képen: biolumineszcencia jelensége a természetben

4 HPLC (Folyadékkromatográfiás) módszer  A luciferin-luciferáz rendszer mellett, az ATP meghatározása HPLC (Folyadékkromatográfiás) módszerrel is történhet.  Ezen technológia alkalmazása még ritka, a relatíve hosszú mérési idő, és a drága berendezés miatt.  Az ATP meghatározásnál jelentős előny a luciferin-luciferáz teszt rendszer nagy érzékenysége.

5  A luciferin-luciferáz teszt rendszer esetén problémát jelenthet az ATP mennyiségi meghatározása talajokból. Ennek főbb okai: inhibítor hatás  Egyes anyagoknál inhibítor hatás(pl. nitrát, magnézium-, kalcium-, klorid-, bromid- ionok és huminsavak esetében), amely további problémát jelent a luciferáz aktivitásra nézve.  Sok ion (pl. Fe(III) ion) komplexeket képez az ATP-vel, így megakadályozzák a megbízható meghatározást.  az ATP nem csak mikróbákból extrahálható, hanem növények gyökeréből és állati sejtekből egyaránt. Ez zavarja a mikrobiális folyamatok azonosítását.

6 extrakció luciferin-luciferáz teszt rendszer  A módszer ATP kénsav és foszfát oldattal való extrakcióján alapul. Majd ezután az ATP meghatározását a luciferin-luciferáz teszt rendszer segítségével végzik NRB jelenlétében.  Az ábrán a luciferin-luciferáz reakció:

7 Anyagok  Luminométer és küvetták  Jégfürdő  Műanyag kémcsövek (77*22 mm)  További anyagok (ld. TCA módszer) Kémiai anyagok és reagensek  „A” puffer:  „A” puffer: Tris ((HOCH 2 ) 3 CNH 2 –2-Amino-2-hidroximetil-propán-1,3- diol - 250mM, és – EDTA (Etilén-diamin-tetraacetát) - 4mM oldat  „B” puffer:  „B” puffer:„A” puffer 10-szeres hígításban, majd autoklávban sterilizálva.  „A” extrahálószer: H 2 SO 4 - re nézve 0,5 M, Na 2 HPO 4 –re nézve 0,25 M oldat  „B” extrahálószer: Lehet NRB (Lumac), vagy a „B” pufferben oldott 10%-os rodalon.  Luciferin-luciferáz (Lumit)  Standard ATP oldatok  Standard ATP oldatok

8 ATP extrakciója:  Az extrakciót az „A” extrahálószerrel végezzük, az előzőleg előkészített standard, vak és a mérendő talajmintákon.  A művelet során a szuszpenziókat 15 percig rázatjuk, majd 20 percig, 121 C-on sterilizáljuk. ATP mérése:  A lehűtött (vak, standard, és viszsgálandó) mintákat felrázzuk, majd a homogén szuszpenziókat 1,5 ml „A” pufferhez adjuk.  Ezután megint összerázzuk, és a mintához adagolunk 50 mikrolitert az NRB extrahálószerből.  A küvettát luminométerbe helyezzük.  100 mikrolitert injektálunk a luciferin-luciferáz enzimekből.  0-30 sec integrációs periódus után mérjük az ATP tartalmat.

9  A standard kalibrációs görbe felvétele úgy történik, hogy talajmintákhoz különböző ATP koncentrációkat adunk, amelyeket aztán úgy kezelünk mint a vizsgálandó mintákat. mikrogramm ATP/ g száraz talajtömeg  A talajok ATP tartalmát a standard kalibrációs görbéről olvassuk le, mikrogramm ATP/ g száraz talajtömeg – mértékegységben.  Az ATP kimutatás %-a = (A+B) – (A) *100 / C-D  Ahol A a minta ATP-je, B a standard ATP, C az extraktumban mért standard ATP, D a vak minta.

10  Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995

11


Letölteni ppt "Tóth Anna Szilvia.  Minden élő sejtben megtalálható, koenzimként és szubsztrátként funkcionál.  Ezen tulajdonságai miatt az ATP alkalmas paraméter a."

Hasonló előadás


Google Hirdetések