Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Foszfolipid-zsírsav meghatározás (PLFA) Készítette: Domiter Péter Csaba.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Foszfolipid-zsírsav meghatározás (PLFA) Készítette: Domiter Péter Csaba."— Előadás másolata:

1 Foszfolipid-zsírsav meghatározás (PLFA) Készítette: Domiter Péter Csaba

2 Foszfolipidek A foszfolipidek az összetett lipidek csoportjába tartoznak.  Bennük glicerin, karbonsav (zsírsav) illetve foszforsav kapcsolódik össze.  A foszfátcsoporthoz a glicerin mellett különböző csoportok kapcsolódhatnak (további glicerin, etanolamin, kolin, szerin) A különböző csoportok miatt a foszfatidok egyszerre rendelkeznek poláris illetve apoláris résszel is, ezért képesek kapcsolódni poláris/apoláris felületekhez. Vizes közegben hártyát vagy membránt képeznek (pl. a biológiai membránok fő alkotórészeit is a foszfolipidek jelentik)

3 Foszfolipidek a talajban A foszfolipidek a mikróbák tápanyag-raktározó képződményeiben nem, csak a sejtek membránjában találhatóak meg. A talaj foszfolipidtartalma arányos a sejtfelülettel, azaz a biomassza tömegével. A foszfolipidek mennyiségét meghatározhatjuk foszfolipid- foszfát (L-PO 4 - ) illetve foszfolipid-zsírsav (PLFA) módszerrel.

4 Mire használható a PLFA módszer? A módszer alkalmas az egyes talajremediációs technológiák tesztelésére illetve későbbi monitorozására. A talaj által adott válaszreakciók nyomonkövetésére egy-egy beavatkozást követően. A módszer által jobban megismerhető a talaj természetes illetve a mesterségesen előidézett öntisztulási folyamata.

5 A módszer elve A talaj foszfolipidtartalmának meghatározására a Bligh és Dyer (1959) féle extrakciós eljárást használjuk, amit egy átészteresítés követ. Ezt követően az eltérő szerkezetű zsírsavakat elválasztjuk egy szilárd-fázisú extrakciós kolonnán (SPE) Majd utolsó lépésként beinjektáljuk a kapott mátrixot a GC/MS készülékbe A kapott adatokból elvégezhető a mennyiségi illetve minőségi meghatározás.

6 Felhasznált eszközök Gáz-kromatográf (GC) és tömegspektrométer (MS) Kapilláris-kolonna (50m x 0,2 mm, 0,33 mm filmvastagság), amely be van vonva egy térhálos, 5% metilfenil-szilikon réteggel Rotációs bepárló Minta-koncentrátor (nitrogén segédgázzal) Centrifuga, 12 ml centrifugacsövekkel Vízszintes-rázató, 1l-es, kerekfenekű lombikkal Mechanikus-rázató Vízfürdő Szűrőtölcsér Elválasztó tölcsér

7 Felhasznált vegyszerek és reagensek I. Foszfát-puffer  8,7 g K 2 HPO 4 -et feloldunk 800 ml desztillált vízben, majd a pH-t beállítjuk 7,4- esre 1 M HCl oldat segítségével, végül az egészet feltöltjük 1000 ml-ig desztillált vízzel Az enyhén lúgos metanolízis (szappanosítás) reagensei  Metanol: toluol elegy (1:1 v/v)  0,2 M KOH kloroformmal frissen elkészítve  1 mol ecetsav A nem szappanosítható komponensek savas metilációjának reagensei  Metanol: kloroform: HCl (37%) (10:1:1)  2% NaCl  Hexán: toluol elegy (1:1 v/v)

8 Felhasznált vegyszerek és reagensek II. TMSi származékképzés reagensei Dimetil-diszulfid (C 2 H 6 S 2 ) Nátrium-tioszulfát (Na 2 S 2 O 3 ) Jódoldat SPE kolonnán történő elválasztás  SI kolonna: kloroform, metanol  NH 2 kolonna: kloroform, hexán, diklórmetán, etil-acetát  SCX: kolonna: diklórmetán, acetonitril, aceton, ezüst-nitrát Celite 545 Na 2 SO 4 (vízmentes) KOH Különböző zsírsav-metilészter standardok

9 Lipid extrakció Elvégezzük a lipidek extrakcióját a talajból a Bligh és Dyer (1959) módszer segítségével  A talajmintákat belehelyezzük az 1l-es, kerekfenekű lombikba és hozzáadunk 200 ml 0,05 M foszfát-puffert.  A következő lépés a víztartalom kivonása, majd ezután hozzáadunk 500 ml vízmentes metanolt és 250 ml kloroformot.  A szuszpenziót élénken rázatjuk 2 órát, majd adagolunk bele 250 ml vizet és 250 ml kloroformot és további 24 órát rázatjuk, amíg szét nem válik.  A szétvált fázisokat (kloroform, híg talaj oldat) dekantáljuk egy szűrőtölcséren keresztül (ebben található a Celite 545 réteg).  A szerves fázist egy tölcséren keresztül elválasztjuk, majd szárítjuk nátrium- szulfát segítségével.  A kloroformot eltávolítjuk párologtatással, úgy hogy 10 ml-t beállítunk és a frakciót -20 °C-on tároljuk.

10 Foszfolipidek elválasztása A lipid extraktumok elválasztása folyadék-kromatográfia segítségével történik  Az elválasztáshoz kötött-fázisú kolonnát használunk (SPE Sl)  Első lépésben kondícionáljuk a kolonnát kloroformmal  Ezután elválasztjuk a semleges gliko- és foszfolipideket, ehhez egy oszloptérfogatnyi klorofomot, acetont és négy oszloptérfogatnyi metanolt használunk eluensként.  A végül megmaradó fázis tekinthető a foszfolipid fázisnak, amelyet ezután alávetnek az enyhén lúgos metanolízisnek (szappanosításnak).

11 Szappanosítás Menete:  A kloroform eltávolítása után maradt frakciót újraszuszpendáljuk metanol/toluol eleggyel  Az így kapott szuszpenzióhoz 5 ml 0,2 M KOH oldatot adagolunk és 15 percen keresztül 37 °C-on inkubáljuk (a pH-t 6-osra állítjuk 1 M ecetsav oldat segítségével)  Ezután hozzáadunk kloroformot és 10 ml desztillált vizet, majd a szuszpenziót 5 percen keresztül rázajtuk és utána centrifugáltatjuk.  A zsírsav-metil-észterek és a nem szapanosítható foszfolipideket a szerves fázisban, a diacil-foszfolipidekből származtatott glicerin-foszfát észtert pedig a vízfázisban kapjuk vissza.  Az extrakciót még kétszer elvégezzük  A kapott három mintát Na 2 SO 4 segítségével szárítjuk és bepárlón nagyjából 1 ml- re töményítjük.

12 Az eltérő zsírsav-metilészterek (FAME-k) szilárd-fázisú extrakciója I. A hidroxi-szubsztituált és a nem elszappanosítható zsírsav- metilészterek elkülönítése  Az elválasztást SPE NH 2 kolonnán végezzük el.  Első lépésben a kolonnát kondícionálni kell diklórmetánnal és hexánnal.  Ezt követően a mintánkat oldjuk kis mennyiségű hexán:diklórmetán (3:1 v/v) elegyben és elkezdjük adagolni a kolonnára.  Elválasztjuk a nem hidroxi-szubsztituált és hidroxi-szubsztituált frakciókban levő FAME-ket, a nem szappanosítható fázisban levő nem metanolizált foszfolipidektől és szabad zsírsavaktól.

13 Az eltérő zsírsav-metilészterek (FAME-k) szilárd-fázisú extrakciója II. Ezüst-ion kromatográfia (A zsírsav-metilészterek elkülönítése a kettős kötések száma szerint)  A szilárd-fázisú kolonnára felvitt ezüst-nitrát réteg feladata a szubsztituálatlan FAME-k elválasztása a telített (SATFA), egyszeresen telítetlen (MUFA) és többszörösen telítetlen (PUFA) frakcióktól (Christie, 1989.)  Az eljárás szerint 20 mg ezüst-nitrátot acetonitril:víz (10:1 v/v) eleggyel felviszünk a kolonna falára.  Az így előkészített kolonnát elárasztjuk acetonitrillel (2 térfogatrész), acetonnal (2 térfogatrész) és diklórmetánnal (4 térfogatrész).  A FAME-ket oldjuk kis mennyiségű diklórmetán: hexán (7:3 v/v) elegyben és így juttatjuk a kolonnára.  A SATFA frakciót ugyanebben az eluensben juttatjuk a kolonnára, a MUFA frakcióhoz diklórmetán:aceton (9:1 v/v), a PUFA frakcióhoz pedig aceton:acetonitril (9:1 v/v) eluenst használunk.  Szabad áramlás mellett az oldószer keverékek gravitációsan elválnak, a frakciók pedig összegyűjthetőek lesznek.

14 Az eltérő zsírsav-metilészterek (FAME-k) szilárd-fázisú extrakciója III. A nem szappanosítható frakció kezelése (savas metilálás)  Miután teljesen elpárologtattuk a vízfázist, a frakciót feloldjuk 2 ml metanol:kloroform:HCl (37%) (10:1:1) elegyben és 60 °C-on, lezárt üvegben tartjuk.  A következő lépésben hozzáadunk 2 ml, 2%-os NaCl oldatot és 4 ml hexán:toluol elegyet (1:1 v/v), majd az egész frakciót centrifugáljuk. Ezt a lépést még három alkalommal elvégezzük.  A szerves rész fogja tartalmazni a FAME-ket.  A továbbiakban ugyanúgy járunk el, mint a hidroxi-szubsztituált és a nem elszappanosítható zsírsav-metilészterek elkülönítése során.

15 A minták előkészítése GC/MS injektálásra A SATFA frakció már készen áll az injektálásra, de a többi fració esetén szükség van valamilyen előkezelésre.  Szilán származékok képződése: Az érzékenység növelése érdekében a zsírsavak OH csoportjait TMSi derivatizációval jelöljük (Parker, 1982). A FAME-k kezeljük 0,5 ml piridin:BSTFA:hexametil-diszilazán:trimetil- klórszilán [TMSi] (0,2:1:2:1 v/v) eleggyel (fontos, hogy az egyes reagenseket a megfelelő sorrendben adagoljuk a keverékhez). Ezután a a keveréket 60 °C-on melegítjük 15 percen keresztül. Majd az oldószert kihajtjuk nitrogén- árammal.  A MUFA frakcióban lévő telítetlen kötések helyének meghatározása érdekében a frakciót dimetil-diszulfiddal kezeljük (Nichols, 1986.) A megmaradt egyszeresen telítetlen FAME-ket feloldjuk 0,05 ml hexánban, ezután DMDS-t (0,1 ml) és 1-2 csepp jódot adunk a rendszerhez és 72 órán keresztül 60 °C-on állni hagyjuk. A felesleg jódot eltávolítjuk 5%-os nátrium- tioszulfáttal, az elegyet pedig hexánnal extraháljuk (3 alkalommal megismételjük). Az így kapott hexán fázist egyesítjük és kiszárítjuk.

16 GC/MS meghatározás A különböző FAME frakciókat oldjuk 0,1 ml hexánban, ami belső standardot is tartalmaz. A végső oldat 1 mikroliterét injektáljuk a GC/MS-re a meghatározás érdekében. A megfelelő meghatározáshoz a GC/MS készüléken mind a SCAN, mind a SIM módot használjuk a mintánk elemzésére.

17 GC/MS működése A mintákat a kapilláris kolonnára (50 m x 0,2 mm, 033 mm filmvastagságú) injektáljuk.  Az injektálást az automatikus mintaadagoló végzi splitless módban (a beadagolási idő 0,75 min)  Hordozó-gázként héliumot használunk, az áramlási sebessége 0,25 ml/min  A kemence hőmérséklete az első programban: Kezdetben 70 °C (2 percen keresztül tartja ezt az értéket) Elkezdjük emelni a hőmérsékletet egészen 160 °C-ig (40 °C/min) Majd tovább emeljük egészen 280 °C-ig (3 °C/min)  A kemence hőmérséklete a második programban: 100 °C-ról 210 °C-ra emeljük a hőmérsékletet (50 °C/min) Majd egészen 300 °C-ig (3 °C/min) Ezeket a működésbeli változtatásokat azért csináljuk, hogy mérjük a MUFA frakció DMDS jelzett kötéseit.  Az elektronsokszorozó feszültsége V között változik.  A GC/MS-t időközönként újrahangolni kell perfluor-tributilaminnal (ionizációs energiája 70 eV)

18 Számítás Egy reprezentatív minta tartalmazza mindazokat a FAME-ket, amiket bemutattunk, mint relatív standard.  Ezt injektáljuk és mind SCAN, mind SIM módban elvégezzük a mérést.  A FAME-k mennyiségét meghatározhatjuk a SCAN mód segítségével illetve a következő képlettel: C=(R f x k x m) / (R i x A x MW) x 1000, ahol: C: a keresett vegyület mennyiség R f és R i : keresett és a standard vegyület főjele k: a keresett vegyület és a standard jelének különbsége alapján számolt faktor m: a beinjektált standard mennyisége (ng) A: a beinjektált talajextraktum mennyisége (mg) MW: molekulatömege a keresett komponens(ek)nek

19 Összegzés Idő spórolható meg, ha a talajminta csak kisebb mennyiségét vizsgáljuk (1 g) illetve, ha a FAME-k elválasztásának egyes lépéseit nem hajtjuk végre. Tömegspektrométer csak azonosításhoz szükséges, más vizsgálatokhoz elegendő a FID detektor is. A minimum detektálási limit: 5 ng/g A legnagyobb korrelációs koefficienst ebben az esetben kapjuk a különböző klasszikus biomassza meghatározási módok között (0,97) Hátránya:  Eszközigényes  Zsírátfedés

20 Forrásjegyzék Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995 Uzinger Nikolett: Szennyezett talajok mikrobiológiai jellemzése és monitorozása a biomarkerek analízisével (www.taki.iif.hu/talajbio/plfa.ppt)

21 Köszönöm a figyelmet!


Letölteni ppt "Foszfolipid-zsírsav meghatározás (PLFA) Készítette: Domiter Péter Csaba."

Hasonló előadás


Google Hirdetések