Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Televényféreg-teszt Enchytraeid Reproduction Test OECD 220 Készítette: Rózsa Péter környezetmérnök hallgató Gruiz Katalin Környezettoxikológia c. tárgyához.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Televényféreg-teszt Enchytraeid Reproduction Test OECD 220 Készítette: Rózsa Péter környezetmérnök hallgató Gruiz Katalin Környezettoxikológia c. tárgyához."— Előadás másolata:

1 Televényféreg-teszt Enchytraeid Reproduction Test OECD 220 Készítette: Rózsa Péter környezetmérnök hallgató Gruiz Katalin Környezettoxikológia c. tárgyához

2 Teszt alapja A tesztférgeket mesterséges talajjal készített talajhígítási sorokba teszik. A tesztférgeket mesterséges talajjal készített talajhígítási sorokba teszik. Tartomány meghatározó (range-finding) teszt: 2 hét, végpont a mortalitás. Tartomány meghatározó (range-finding) teszt: 2 hét, végpont a mortalitás. Hatást mérő teszt (definitive): 6 hét, az összes fiatal egyed a szülőktől származik. Hatást mérő teszt (definitive): 6 hét, az összes fiatal egyed a szülőktől származik. Az első három hét után a felnőtt férgeket eltávolítják a tesztedényből, és feljegyzik a morfológiai változásokat További 3 hét után a bábakból kikelt utódokat megszámolják. Az állatok reproduktív hozamát a kontrolltalajon lévő állatok reproduktív hozamával hasonlítják össze. Ebből meghatározzák NOEC-et és EC x -et interpolációval regreszióanalízis segítségével.

3 Információ a tesztelendő vegyi anyagról Ismerni kell a vegyi anyag vízoldhatóságát és gőznyomását. Ismerni kell a vegyi anyag vízoldhatóságát és gőznyomását. Plusz információt ad, ha ismerjük a vegyi anyag hidrolízis és fotolízis sebességét. Plusz információt ad, ha ismerjük a vegyi anyag hidrolízis és fotolízis sebességét. Nem alkalmazható olyan anyagokra, amelynek Henry-állandója nagyobb mint 1, vagy a gőznyomása nagyobb mint 0,0133 Pa, vagyis az illékonyakra. Nem alkalmazható olyan anyagokra, amelynek Henry-állandója nagyobb mint 1, vagy a gőznyomása nagyobb mint 0,0133 Pa, vagyis az illékonyakra.

4 Teszt validálása A felnőtt mortalitás a tartománykereső teszt végén és a reprodukciós teszt első három hetében nem haladhatja meg a 20%-ot. A felnőtt mortalitás a tartománykereső teszt végén és a reprodukciós teszt első három hetében nem haladhatja meg a 20%-ot. A teszt kezdetekor 10 felnőttet alkalmazunk edényenként, a teszt végén átlagosan 25 felnőttnek kell lennie edényenként. A teszt kezdetekor 10 felnőttet alkalmazunk edényenként, a teszt végén átlagosan 25 felnőttnek kell lennie edényenként. A fiatalok átlagának varianciája nem lehet több mint 50%. A fiatalok átlagának varianciája nem lehet több mint 50%.

5 Referenciaanyag Egyik a karbedazim 360 mg/l (32,18%) aktív összetevőt alkalmaz Egyik a karbedazim 360 mg/l (32,18%) aktív összetevőt alkalmaz A reprodukció EC 50 értéke 1,2±0,8 mg aktív összetevő/kg száraz talaj intervallumban van. A kontrollsor eredménye alapján ellenőrizzük a tesztorganizmusok megfelelőségét. A reprodukció EC 50 értéke 1,2±0,8 mg aktív összetevő/kg száraz talaj intervallumban van. A kontrollsor eredménye alapján ellenőrizzük a tesztorganizmusok megfelelőségét.

6 A teszt leírása Eszközök Eszközök Üvegből vagy más kémiailag inert anyagból kell készülnie. 0,20-0,25 l; 6 cm átmérő Üvegből vagy más kémiailag inert anyagból kell készülnie. 0,20-0,25 l; 6 cm átmérő Átlátszó fedelűnek (pl. üveg vagy polietilén), mert a víz párolgását csökkenti, amíg a légcserét engedünk az atmoszféra és a talaj közt Átlátszó fedelűnek (pl. üveg vagy polietilén), mert a víz párolgását csökkenti, amíg a légcserét engedünk az atmoszféra és a talaj közt A fedő átlátszó legyen, hogy áteressze a fényt. A fedő átlátszó legyen, hogy áteressze a fényt. sztereomikroszkóp sztereomikroszkóp pH-mérő és fotométer pH-mérő és fotométer Analitikai mérlegek Analitikai mérlegek hőmérők hőmérők nedvességellenőrző (nem szükséges, hogy az edénynek legyen fedele) nedvességellenőrző (nem szükséges, hogy az edénynek legyen fedele) inkubátor vagy kis szoba légkondicionálóval inkubátor vagy kis szoba légkondicionálóval csipesz csipesz fotótál fotótál

7 A mesterséges talaj előkészítése 10% tőzegmoha, légszáraz, 2±1 mm szemcseátmérőjű 10% tőzegmoha, légszáraz, 2±1 mm szemcseátmérőjű 20% kaolinitagyag 20% kaolinitagyag 0,3-1% CaCO 3 (porítva, analitikai mennyiségben, elsődlegesen a tőzegmoha minőségétől/természetétől függ), hogy a pH 6,0±0,5 legyen 0,3-1% CaCO 3 (porítva, analitikai mennyiségben, elsődlegesen a tőzegmoha minőségétől/természetétől függ), hogy a pH 6,0±0,5 legyen Kb. 70% légszáraz kvarchomok (CaCO 3 mennyiségétől függően) µm szemcseátmérőtől függően Kb. 70% légszáraz kvarchomok (CaCO 3 mennyiségétől függően) µm szemcseátmérőtől függően

8 A mesterséges talaj előkészítése Meg kell bizonyosodni, hogy a talaj nem veszélyes-e, ha a szerves széntartalmát 4,5%-ra csökkentjük, és ennek megfelelően megnövekszik a homoktartalma Meg kell bizonyosodni, hogy a talaj nem veszélyes-e, ha a szerves széntartalmát 4,5%-ra csökkentjük, és ennek megfelelően megnövekszik a homoktartalma A talaj száraz alkotóelemeit alaposan össze kell keverni legalább 1 hétig. A talaj száraz alkotóelemeit alaposan össze kell keverni legalább 1 hétig. Ezt 2 napig kell tárolni, hogy a pH-ja beálljon. Ezt 2 napig kell tárolni, hogy a pH-ja beálljon. A pH meghatározásához 1 M kálium-klorid-oldatot (KCl) vagy 0,01 M kalcium-klorid (CaCl 2 )-oldatot 1:5 arányban kell használni A pH meghatározásához 1 M kálium-klorid-oldatot (KCl) vagy 0,01 M kalcium-klorid (CaCl 2 )-oldatot 1:5 arányban kell használni Ha savasabb, CaCO 3 -tal kell pufferolni. Ha savasabb, CaCO 3 -tal kell pufferolni. Ha túl alkálikus, akkor több keveréket kell hozzáadni, de CaCO 3 kizárásával Ha túl alkálikus, akkor több keveréket kell hozzáadni, de CaCO 3 kizárásával

9 A mesterséges talaj előkészítése Meg kell határozni a talaj maximális víztartalom-kapacitását; egy vagy két nappal a teszt megkezdése előtt a száraz mesterséges talajt ionmentes vízzel megnedvesítjük, hogy a végső víztartalom kb. felét elérje, hogy a maximális víztartókapacitása 40-60% között legyen. Meg kell határozni a talaj maximális víztartalom-kapacitását; egy vagy két nappal a teszt megkezdése előtt a száraz mesterséges talajt ionmentes vízzel megnedvesítjük, hogy a végső víztartalom kb. felét elérje, hogy a maximális víztartókapacitása 40-60% között legyen. A teszt kezdetén az előnedvesített talajt a tesztkoncentrációk számának megfelelően osztjuk el (és a referenciaanyaggal, ahol alkalmas) és a kontrollokat, amiket a teszthez használnak fel. A teszt kezdetén az előnedvesített talajt a tesztkoncentrációk számának megfelelően osztjuk el (és a referenciaanyaggal, ahol alkalmas) és a kontrollokat, amiket a teszthez használnak fel. A nedvességtartalmat a maximális WHC 40-60%-ra kell beállítani a tesztanyagoldat és/vagy desztillált vagy ionmentes víz hozzáadásával A nedvességtartalmat a maximális WHC 40-60%-ra kell beállítani a tesztanyagoldat és/vagy desztillált vagy ionmentes víz hozzáadásával A nedvességtartalmat a teszt kezdetén és végén határozzák meg (105 0 C-on állandó tömegig szárítva), és azt az optimális tartományt, amit a férgek még túlélnek. A nedvességtartalmat a teszt kezdetén és végén határozzák meg (105 0 C-on állandó tömegig szárítva), és azt az optimális tartományt, amit a férgek még túlélnek. A talaj nedvességtartalmát ellenőrizni kell;a talajt a kezünkben finoman összenyomjuk, ha a víztartalom kis vízcseppekben megjelenik az ujjak közt, akkor alkalmas a tesztre. A talaj nedvességtartalmát ellenőrizni kell;a talajt a kezünkben finoman összenyomjuk, ha a víztartalom kis vízcseppekben megjelenik az ujjak közt, akkor alkalmas a tesztre.

10 A tesztállatok kiválasztása Enchytraeus albidus (fehér féreg) az Enchytraeide családba, Oligochaeták rendjébe, Annelidák törzsébe tartozik. Az echytraeidák egyik leghosszabb faja, 35 mm hosszú is lehet. Világszerte megtalálható, a tengervízben, édesvízben, földön, főképp korhadó szerves anyagokon (hínár, komposzt) és ritkán réteken. Széles ökológiai toleranciájának és néhány morfológiai változatosságának köszönhetően különböző fajtái léteznek. Kereskedelmileg mint haltápanyag kapható. Ha a kultúra megfertőződik, általában kisebbek, fajták (1) (19). Ha a szennyeződés megtörténik, minden férget Petri-csészében vízzel le kell mosni. Az Enchytraeus albidus hosszú felnőtt példányai (sztereomikroszkóp használatával) elkülöníthetők, hogy egy új kultúrát elkezdhessünk, és minden egyéb férget elválasszunk. Könnyen tenyészthető a szerves anyagok széles skáláján. Életciklusuk lerövidül, mikor fejlődésük során elérik 33 napot (18 0 C) és 74 napot (12 0 C-on). Csak azok a kultúrák tarthatók használhatók fel a teszthez, anmelyeket laboratóriumban problémamentesen lehetett tartani legalább 5 hétig (egy generáció). Enchytraeus albidus (fehér féreg) az Enchytraeide családba, Oligochaeták rendjébe, Annelidák törzsébe tartozik. Az echytraeidák egyik leghosszabb faja, 35 mm hosszú is lehet. Világszerte megtalálható, a tengervízben, édesvízben, földön, főképp korhadó szerves anyagokon (hínár, komposzt) és ritkán réteken. Széles ökológiai toleranciájának és néhány morfológiai változatosságának köszönhetően különböző fajtái léteznek. Kereskedelmileg mint haltápanyag kapható. Ha a kultúra megfertőződik, általában kisebbek, fajták (1) (19). Ha a szennyeződés megtörténik, minden férget Petri-csészében vízzel le kell mosni. Az Enchytraeus albidus hosszú felnőtt példányai (sztereomikroszkóp használatával) elkülöníthetők, hogy egy új kultúrát elkezdhessünk, és minden egyéb férget elválasszunk. Könnyen tenyészthető a szerves anyagok széles skáláján. Életciklusuk lerövidül, mikor fejlődésük során elérik 33 napot (18 0 C) és 74 napot (12 0 C-on). Csak azok a kultúrák tarthatók használhatók fel a teszthez, anmelyeket laboratóriumban problémamentesen lehetett tartani legalább 5 hétig (egy generáció). Használhatók még pl. E. buchholzi és E. crypticus. Meg kell jegyezni, hogy más faj használatakor a fajoknak tisztán azonosíthatónak kell lenniük. Használhatók még pl. E. buchholzi és E. crypticus. Meg kell jegyezni, hogy más faj használatakor a fajoknak tisztán azonosíthatónak kell lenniük.

11 Tesztállatok A tesztben használt állatok felnőtt férgek. Ikrájuk van (fehér folt) a clitellum területen, és kb. ugyanolyan méretűek (kb. 1 cm hosszúak). A tenyészkultúrákat nem szükségszerű összehangolni A tesztben használt állatok felnőtt férgek. Ikrájuk van (fehér folt) a clitellum területen, és kb. ugyanolyan méretűek (kb. 1 cm hosszúak). A tenyészkultúrákat nem szükségszerű összehangolni Ha az enchytraeidák nem tenyészthetők ugyanazon a talajtípuson és ugyanolyan körülmények közt, akkor akklimatizálni kell őket 1-3 napig is akár. Ha az enchytraeidák nem tenyészthetők ugyanazon a talajtípuson és ugyanolyan körülmények közt, akkor akklimatizálni kell őket 1-3 napig is akár. Ha több felnőttet alkalmazunk, mint ami a teszthez szükséges, kezdetben akklimatizálni kell őket a teszthez, hogy elválasszuk őket a károsodott vagy a tesztre alkalmatlan fajoktól. Az akklimatizált időszak végén csak azok a férgek maradnak meg, amiknek petéjük van, és amelyek nem térnek el a hagyományos viselkedéstől (pl. megpróbálnak elmászni a talajról). A férgeket óvatosan elveszik csipesszel, és áthelyezik egy Petri-csészébe, ami kismennyiségű édesvizet tartalmaz, amit frissen kell előkészíteni. Ha több felnőttet alkalmazunk, mint ami a teszthez szükséges, kezdetben akklimatizálni kell őket a teszthez, hogy elválasszuk őket a károsodott vagy a tesztre alkalmatlan fajoktól. Az akklimatizált időszak végén csak azok a férgek maradnak meg, amiknek petéjük van, és amelyek nem térnek el a hagyományos viselkedéstől (pl. megpróbálnak elmászni a talajról). A férgeket óvatosan elveszik csipesszel, és áthelyezik egy Petri-csészébe, ami kismennyiségű édesvizet tartalmaz, amit frissen kell előkészíteni. A férgek megfigyelhetőek sztereomikroszkóp alatt, és néhány az, amelyik nem tartalmaz petét, elkülönülnek. Figyelni kell, hogy elválasszuk és elkülönítsük az atkáktól, amik megfertőzhetik a kultúrákat. Azok az egészséges férgek, amiket nem használunk a tesztre, visszakerülnek az alapkultúrához. A férgek megfigyelhetőek sztereomikroszkóp alatt, és néhány az, amelyik nem tartalmaz petét, elkülönülnek. Figyelni kell, hogy elválasszuk és elkülönítsük az atkáktól, amik megfertőzhetik a kultúrákat. Azok az egészséges férgek, amiket nem használunk a tesztre, visszakerülnek az alapkultúrához.

12 A tesztkoncentrációk előkészítése Tesztanyag feloldása vízben (ionmentesben). Annyi ionmentes vízben oldjuk fel, amennyi elég minden egyes koncentráció ismétlésére. Ajánlatos annyi vizet használni, hogy elérjük a kívánt nedvességtartalmat, pl. a maximum WHC 40-60%- át. A tesztanyag minden oldatát alaposan átkeverjük egy előzetesen megnedvesített talajjal, mielőtt belehelyeznénk a tesztedénybe. Tesztanyag feloldása vízben (ionmentesben). Annyi ionmentes vízben oldjuk fel, amennyi elég minden egyes koncentráció ismétlésére. Ajánlatos annyi vizet használni, hogy elérjük a kívánt nedvességtartalmat, pl. a maximum WHC 40-60%- át. A tesztanyag minden oldatát alaposan átkeverjük egy előzetesen megnedvesített talajjal, mielőtt belehelyeznénk a tesztedénybe. Ha nem vízoldható a tesztanyag: Ha nem vízoldható a tesztanyag: Ha szerves oldószerben oldódnak, a tesztanyagot először feloldjuk egy közvetítő közegben (pl. aceton), és ezt összekeverik kb. 2,5 g apró kvarchomokkal, majd a vivőközeget legalább 1 óráig párolják. A kvarchomok-tesztanyag-keveréket hozzáadják az előnedvesített talajhoz, elkeverik, ionmentes vizet adnak hozzá a kívánt nedvesség eléréséhez. Végül behelyezik a tesztedénybe. Ha szerves oldószerben oldódnak, a tesztanyagot először feloldjuk egy közvetítő közegben (pl. aceton), és ezt összekeverik kb. 2,5 g apró kvarchomokkal, majd a vivőközeget legalább 1 óráig párolják. A kvarchomok-tesztanyag-keveréket hozzáadják az előnedvesített talajhoz, elkeverik, ionmentes vizet adnak hozzá a kívánt nedvesség eléréséhez. Végül behelyezik a tesztedénybe. Ha szerves oldószerben és vízben is kevéssé oldódnak, akkor 2,5 g egyenértékű apró kvarchomokot teszedényenként összekevernek a tesztanyag mennyiségével, hogy a kívánt koncentrációt elérjék. Ezt a keveréket hozzáadják az előzetesen nedvesített talajhoz, és alaposan elkeverik, miután hozzáadtak annyi ionmentes vizet, hogy a nedvességtartalmat elérjék. A végső keveréket szétosztják a tesztedények közt. A folyamatot minden egyes tesztkoncentrációra megismétlik, és elvégzik a kontrollra is egyaránt. Ha szerves oldószerben és vízben is kevéssé oldódnak, akkor 2,5 g egyenértékű apró kvarchomokot teszedényenként összekevernek a tesztanyag mennyiségével, hogy a kívánt koncentrációt elérjék. Ezt a keveréket hozzáadják az előzetesen nedvesített talajhoz, és alaposan elkeverik, miután hozzáadtak annyi ionmentes vizet, hogy a nedvességtartalmat elérjék. A végső keveréket szétosztják a tesztedények közt. A folyamatot minden egyes tesztkoncentrációra megismétlik, és elvégzik a kontrollra is egyaránt. Az olyan anyagok, amik nagyobbak 1000 mg/kg száraz talajtömeg koncentrációnál, nem alkalmasak a tesztre. Az olyan anyagok, amik nagyobbak 1000 mg/kg száraz talajtömeg koncentrációnál, nem alkalmasak a tesztre.

13 Tesztcsoportok és kontrollok Minden tesztkoncentrációhoz adott mennyiségű teszttalajt - 20 g száraz súlyra vonatkoztatva - helyeznek a tesztedénybe. A kontrolltalajokat - a tesztanyagok nélkül - is elkészítik. Ételt adnak minden edénybe. 10 férget véletlenszerűen elhelyeznek minden tesztedénybe. A férgeket óvatosan áthelyezik minden tesztedénybe, és elhelyezik a használni kívánt talaj felszínére, pl. csipeszekkel. Az ismétlések száma függ a tesztkoncentrációkhoz és a kontrollokhoz használt teszt típusától. A tesztedényeket véletlenszerűen helyezik el a tesztinkubátorba, és ezeket a helyeket hetente újra megkeverik. Minden tesztkoncentrációhoz adott mennyiségű teszttalajt - 20 g száraz súlyra vonatkoztatva - helyeznek a tesztedénybe. A kontrolltalajokat - a tesztanyagok nélkül - is elkészítik. Ételt adnak minden edénybe. 10 férget véletlenszerűen elhelyeznek minden tesztedénybe. A férgeket óvatosan áthelyezik minden tesztedénybe, és elhelyezik a használni kívánt talaj felszínére, pl. csipeszekkel. Az ismétlések száma függ a tesztkoncentrációkhoz és a kontrollokhoz használt teszt típusától. A tesztedényeket véletlenszerűen helyezik el a tesztinkubátorba, és ezeket a helyeket hetente újra megkeverik. Ha egy vivőközeget használnak a tesztanyagra, egy kontrollsorozatot – amiben kvarchomok van feloldva az oldószerben – kell futtatni a tesztsorozaton felül. Az oldószerkoncentrációnak meg kell egyeznie, amit a tesztedényekben használtunk, ami a tesztanyagot tartalmazta. Ha egy vivőközeget használnak a tesztanyagra, egy kontrollsorozatot – amiben kvarchomok van feloldva az oldószerben – kell futtatni a tesztsorozaton felül. Az oldószerkoncentrációnak meg kell egyeznie, amit a tesztedényekben használtunk, ami a tesztanyagot tartalmazta.

14 Tesztkörülmények Teszthőmérséklet 20±2 0 C. Teszthőmérséklet 20±2 0 C. Hogy a kukacok ne hagyják el a talajt, a tesztet irányított világos-sötét ciklusok alatt kell végezni (16 óra világos-8 óra sötét) lux megvilágítással Hogy a kukacok ne hagyják el a talajt, a tesztet irányított világos-sötét ciklusok alatt kell végezni (16 óra világos-8 óra sötét) lux megvilágítással Talajnedvesség nyomonkövetése: edények lemérése a teszt kezdetén, majd hetente. Tömegveszteséget ionmentes víz hozzáadásával kell pótolni. Nedvesség csökkenthető, ha a tesztinkubátorban magas páratartalmú levegőt (>80%) tartunk fenn. Talajnedvesség nyomonkövetése: edények lemérése a teszt kezdetén, majd hetente. Tömegveszteséget ionmentes víz hozzáadásával kell pótolni. Nedvesség csökkenthető, ha a tesztinkubátorban magas páratartalmú levegőt (>80%) tartunk fenn. Nedvességtartalmat és a pH-t is mérni kell mindkét tesztben a kontrollra és a kezelt talaj minden koncentrációjára egyaránt. Nedvességtartalmat és a pH-t is mérni kell mindkét tesztben a kontrollra és a kezelt talaj minden koncentrációjára egyaránt.

15 Etetés 50 mg összecsavarodott zabot kell alkalmazni, amit a talajba kevernek bele. Hetente a 21. napig etetni kell a férgeket. Az etetés nem fejeződik be a 28. napon addig, amíg a felnőtteket nem vették el erről a helyről, és a fiatal férgeknek szükségük van relatíve kis mennyiségű hozzáadott ételre ezen a ponton túl. Az etetés a teszt alatt 25 mg összecsavart zabot / edény tartalmaz, a férgeket gondosan helyezzük a talaj felszínére, így elkerüljük, hogy megsérülnek. Azért, hogy csökkentsük a gombák növekedését, a zabpelyheket a talajba kell ásni kismennyiségű talajjal borítva. Ha az ételt nem fogyasztják el teljesen, akkor mennyiségét csökkenteni kell. 50 mg összecsavarodott zabot kell alkalmazni, amit a talajba kevernek bele. Hetente a 21. napig etetni kell a férgeket. Az etetés nem fejeződik be a 28. napon addig, amíg a felnőtteket nem vették el erről a helyről, és a fiatal férgeknek szükségük van relatíve kis mennyiségű hozzáadott ételre ezen a ponton túl. Az etetés a teszt alatt 25 mg összecsavart zabot / edény tartalmaz, a férgeket gondosan helyezzük a talaj felszínére, így elkerüljük, hogy megsérülnek. Azért, hogy csökkentsük a gombák növekedését, a zabpelyheket a talajba kell ásni kismennyiségű talajjal borítva. Ha az ételt nem fogyasztják el teljesen, akkor mennyiségét csökkenteni kell.

16 Range-finding teszt 0,1; 1; 10; 100; 1000 mg/kg (száraztalaj-súlyra vonatkoztatva). Egy ismétlés mindegyikhez szükséges lehet. 0,1; 1; 10; 100; 1000 mg/kg (száraztalaj-súlyra vonatkoztatva). Egy ismétlés mindegyikhez szükséges lehet. 2 hetes teszt. 2 hetes teszt. Férgek mortalitását megállapítjuk Férgek mortalitását megállapítjuk Egy féreg akkor tekinthető halottnak, ha mechanikai stimulusra nem reagál. Egy féreg akkor tekinthető halottnak, ha mechanikai stimulusra nem reagál. A felnőttek viselkedésében lévő változásokat (pl. nem tudja beásni magát a talajba; mozdulatlanul fekszik a tesztedény üvegfalának dőlve) és morfológia (pl. nyílt sebek jelenléte) fel kell jegyezni. A felnőttek viselkedésében lévő változásokat (pl. nem tudja beásni magát a talajba; mozdulatlanul fekszik a tesztedény üvegfalának dőlve) és morfológia (pl. nyílt sebek jelenléte) fel kell jegyezni. LC 50 úgy határozható meg, hogy vesszük a mortalitási adatok geometriai átlagát. A koncentricióintervallumok felállításában a definitív tesztre a reprodukcióra gyakorolt hatások kisebbek az LC 50 - nél egy 10-es faktorral. LC 50 úgy határozható meg, hogy vesszük a mortalitási adatok geometriai átlagát. A koncentricióintervallumok felállításában a definitív tesztre a reprodukcióra gyakorolt hatások kisebbek az LC 50 - nél egy 10-es faktorral. 4 ismétlést végzünk minden tesztanyag-koncentrációra és egy adekvát koncentrációszámítást, ami legalább 4 statisztikailag különböző átlagot eredményez ezekre a koncentrációkra ajánlott. 4 ismétlést végzünk minden tesztanyag-koncentrációra és egy adekvát koncentrációszámítást, ami legalább 4 statisztikailag különböző átlagot eredményez ezekre a koncentrációkra ajánlott. Kontrollgra használják is ugyanezeket érdemes alkalmazni. Kontrollgra használják is ugyanezeket érdemes alkalmazni.

17 Kivitel a definitív reprodukciós tesztre Erre 3 lehetőségünk van: Erre 3 lehetőségünk van: NOEC meghatározására legalább 5 koncentrációsorozatot kell tesztelni. 4 ismétlést minden koncentrációra plusz 8 kontrol ajánlott. A koncentrációkat 1,8-at meg nem haladó faktorral kell beszorozni. NOEC meghatározására legalább 5 koncentrációsorozatot kell tesztelni. 4 ismétlést minden koncentrációra plusz 8 kontrol ajánlott. A koncentrációkat 1,8-at meg nem haladó faktorral kell beszorozni. Az ECx (pl. EC10, EC50) meghatározásához legalább 5 koncentrációt kell tesztelni, és a koncentrációkat egymás mellé elhelyezni ECx-ek szerinti növekvő sorrendjébe, hogy interpolálhassuk, és ne az extrapoláljuk. Minden egyes tesztkoncentrációra legalább 4 ismétlés és 4 kontrollismétlés ajánlott. A faktor szór, pl. kevesebb vagy egyenlő 1,8-cal az elvárt intervallumban, és 1,8 fölé is mehet magasabb és alacsonyabb koncentrációknál. Az ECx (pl. EC10, EC50) meghatározásához legalább 5 koncentrációt kell tesztelni, és a koncentrációkat egymás mellé elhelyezni ECx-ek szerinti növekvő sorrendjébe, hogy interpolálhassuk, és ne az extrapoláljuk. Minden egyes tesztkoncentrációra legalább 4 ismétlés és 4 kontrollismétlés ajánlott. A faktor szór, pl. kevesebb vagy egyenlő 1,8-cal az elvárt intervallumban, és 1,8 fölé is mehet magasabb és alacsonyabb koncentrációknál. Egy egyesített megközelítés megengedi mind a NOEC, mind az ECx meghatározását. 8 koncentrációt kell alkalmazni a geometriai sorozatokban. 4 ismétlőt minden kezeltre plusz 8-at kontrollra ajánlott. A koncentrációkat olyan faktorokkal kell szorozni, amik nem érik el az 1,8-at. Egy egyesített megközelítés megengedi mind a NOEC, mind az ECx meghatározását. 8 koncentrációt kell alkalmazni a geometriai sorozatokban. 4 ismétlőt minden kezeltre plusz 8-at kontrollra ajánlott. A koncentrációkat olyan faktorokkal kell szorozni, amik nem érik el az 1,8-at.

18 EC x -ek meghatározása

19 Definitív teszt 10 felnőtt férget/tesztedény kell használni. Ételt adnak a tesztedényekbe a teszt kezdetén, majd hetente egyszer a 21. napig. A 21. napon a talajmintákat óvatosan kezelik, és az élő felnőtt férgeket megfigyelik és megszámolják, és a viselkedésbeli változásaikat (pl. a földbe nem tudnak lemenni; mozdulatlanul fekszenek a tesztedény üvegének) és a morfológiát (pl. nyílt sebek) feljegyzik. Ezután minden felnőtt férget elvesznek a tesztedényből és a teszttalajról. Ha teszttalaj tartalmaz néhány bábot, amiket termeltek, azokat inkubálják még 3 hétig ugyanazon tesztkörülmények között kivéve, hogy az etetés csak a 35. napon történik meg 25 mg összecsavart zab/edény). 10 felnőtt férget/tesztedény kell használni. Ételt adnak a tesztedényekbe a teszt kezdetén, majd hetente egyszer a 21. napig. A 21. napon a talajmintákat óvatosan kezelik, és az élő felnőtt férgeket megfigyelik és megszámolják, és a viselkedésbeli változásaikat (pl. a földbe nem tudnak lemenni; mozdulatlanul fekszenek a tesztedény üvegének) és a morfológiát (pl. nyílt sebek) feljegyzik. Ezután minden felnőtt férget elvesznek a tesztedényből és a teszttalajról. Ha teszttalaj tartalmaz néhány bábot, amiket termeltek, azokat inkubálják még 3 hétig ugyanazon tesztkörülmények között kivéve, hogy az etetés csak a 35. napon történik meg 25 mg összecsavart zab/edény). 6 hét után az új kikelt férgeket megszámolják. A metodika Bengal piros festésen alapul, habár más nedves (de nem melegített) extrakciós és flotációs technikák is hatásosnak bizonyultak. Bengáli piros festés inkább ajánlott, mert a nedves extrakció egy talajszubsztrátból a zavarodottság miatt gátolt, amiket a szuszpendált agyagszemcsék idéznek elő. 6 hét után az új kikelt férgeket megszámolják. A metodika Bengal piros festésen alapul, habár más nedves (de nem melegített) extrakciós és flotációs technikák is hatásosnak bizonyultak. Bengáli piros festés inkább ajánlott, mert a nedves extrakció egy talajszubsztrátból a zavarodottság miatt gátolt, amiket a szuszpendált agyagszemcsék idéznek elő. Limitáló teszt Limitáló teszt 37.Ha nincs megfigyelhető hatás a magasabb koncentrációknál a széleskörű- kereső tesztekben (pl mg/kg), a reprodukciós teszt végrehajtható mint egy limitáló teszt, 1000 mg/kg-ot használ fel sorrendben, hogy bizonyítsa, a NOEC a reprodukcióra nagyobb mint ez az érték. 37.Ha nincs megfigyelhető hatás a magasabb koncentrációknál a széleskörű- kereső tesztekben (pl mg/kg), a reprodukciós teszt végrehajtható mint egy limitáló teszt, 1000 mg/kg-ot használ fel sorrendben, hogy bizonyítsa, a NOEC a reprodukcióra nagyobb mint ez az érték.

20 A teszt összefoglalása Idő Range-finding teszt Deifinitív teszt 7 nap vagy kevesebb Mesterséges talaj elkészítése (száraz alkotók összekeverése) 5. nap A mesterséges talaj pH-jának ellenőrzése Megmérni a talaj max WHC-jét 5. naptól Csoportférgek akklimatizációra 3. naptól Férgek akklimatizálása legalább 24 órán át 1. nap Előnedvesített mesterséges talaj és szétosztani frissekre 0. nap Előkészíteni az alapoldatokat Alkalmazni a tesztanyagot Megmérni a tesztszubsztrát tömegét tesztedényekbe Elkeverni az ételt Behelyezni a férgeket Megmérni a talaj pH-ját és a nedvességtartalmat 7. nap Ellenőrizni a talaj nedvességtartalmát

21 A teszt összefoglalása Idő Range-finding teszt Deifinitív teszt 14. nap Meghatározni a felnőtt mortalitást Ellenőrizni a talaj nedvességtartalmát Megbecsülni a fiatalok számát Etetés Megmérni a talaj pH-ját és a nedvességtartalmat 21. nap Megfigyelni a felnőtt viselkedést Elvenni a felnőtteket Meghatározni a felnőtt mortalitást Ellenőrizni a talaj nedvességtartalmát Etetés 28. nap Ellenőrizni a talaj nedvességtartalmát Nem etetni 35. nap Ellenőrizni a talaj nedvességtartalmát Etetés 42. nap Megszámolni a fiatal férgeket Megmérni a talaj pH-ját és a nedvességtartalmat

22 Jegyzőkönyv Tesztanyag Tesztanyag Fizikai és, ahol lehet, fizikai-kémiai tulajdonságok (pl. vízoldhatóság, gőznyomás); Fizikai és, ahol lehet, fizikai-kémiai tulajdonságok (pl. vízoldhatóság, gőznyomás); A tesztanyag kémiai azonosítása IUPAC nomenklatúrának megfelelően, CAS-szám, struktúrális formula és tisztaság A tesztanyag kémiai azonosítása IUPAC nomenklatúrának megfelelően, CAS-szám, struktúrális formula és tisztaság A minta lejárati dátuma/felhasználhatósági ideje A minta lejárati dátuma/felhasználhatósági ideje Tesztfajok Tesztfajok A felhasznált tesztállatok: fajok, tudományos név, organizmusok és tenyésztési kondíciók adatai A felhasznált tesztállatok: fajok, tudományos név, organizmusok és tenyésztési kondíciók adatai Tesztkondíciók Tesztkondíciók a mesterséges talaj előkészítése és alapanyagok a mesterséges talaj előkészítése és alapanyagok a tesztanyag felhasználásának módszere a tesztanyag felhasználásának módszere a tesztkörülmények leírása beleértve hőmérsékletet, nedvességtartalmat, pH-t, stb. a tesztkörülmények leírása beleértve hőmérsékletet, nedvességtartalmat, pH-t, stb. a kísérleti felépítés és folyamat teljes leírása a kísérleti felépítés és folyamat teljes leírása Teszteredmények: Teszteredmények: a felnőtt férgek halálozása 2 hét után és a fiatalok száma a range-finding teszt végén; a felnőtt férgek halálozása 2 hét után és a fiatalok száma a range-finding teszt végén; a felnőtt férgek halálozása 3 hét után, és fiatalok teljes életciklusa a definitív teszt végén. a felnőtt férgek halálozása 3 hét után, és fiatalok teljes életciklusa a definitív teszt végén. Néhány megfigyelt fizikai vagy patológiai szimptómák és viselkedésváltozások a tesztorganizmusokban; Néhány megfigyelt fizikai vagy patológiai szimptómák és viselkedésváltozások a tesztorganizmusokban; LC50, a NOEC és vagy ECx (pl. EC50, EC10) a reprodukcióra, ha néhány közülük alkalmazható konfidencia-intervallummal, és a ráillesztett modell rajza felhasználva a számításukra minden információ és megfigyelések segíthetnek az eredmények kiértékelésében. LC50, a NOEC és vagy ECx (pl. EC50, EC10) a reprodukcióra, ha néhány közülük alkalmazható konfidencia-intervallummal, és a ráillesztett modell rajza felhasználva a számításukra minden információ és megfigyelések segíthetnek az eredmények kiértékelésében.

23 Felhasznált irodalom OECD iLibrary - Test No. 220: Enchytraeid Reproduction Test OECD iLibrary - Test No. 220: Enchytraeid Reproduction Test ilibrary.org/docserver/download/fulltext/ e.pdf?expires= &id=0000&accname=freeContent&checksum=FE904F3D9 9C7CB01C454E491D8719C9F ilibrary.org/docserver/download/fulltext/ e.pdf?expires= &id=0000&accname=freeContent&checksum=FE904F3D9 9C7CB01C454E491D8719C9F Képek forrása Képek forrása BS_2204.aspx BS_2204.aspx


Letölteni ppt "Televényféreg-teszt Enchytraeid Reproduction Test OECD 220 Készítette: Rózsa Péter környezetmérnök hallgató Gruiz Katalin Környezettoxikológia c. tárgyához."

Hasonló előadás


Google Hirdetések