Különböző spéci mikroszkópok és festési eljárások

Az előadások a következő témára: "Különböző spéci mikroszkópok és festési eljárások"— Előadás másolata:

1 Különböző spéci mikroszkópok és festési eljárások
Mikroszkópia Különböző spéci mikroszkópok és festési eljárások Készítette: Rajnai Tamás

2 Mikroszkópia története
mikron = kicsi szkopein = nézni Mikroszkópia: szemmel láthatatlan tárgyak mikroszkópos vizsgálata Első mikroszkóp: ~ 1600: Hans Lippershey, Hans Janssen, Zacharias Janssen

3 Mikroszkópok fajtái: Optikai elméletet használó:
Mintán áthaladó/visszaverődő sugarakat egy optikai rendszer felnagyítja Binokuláris/szimpla Fajtái: összetett fénymikroszkópok (max kb. 1500X, elméleti felbontóképesség 0,2 mikrométer ), szetereomikroszkópok, Elektronmikroszkópok (vákuum kell)

4 Sztereomikroszkóp Elektronmikroszkóp

5 Mikroszkópok fajtái Speciális fénymikroszkópok: Ultraibolya-mikroszkóp
Ultramikroszkóp Fáziskontraszt-mikroszkóp Lumineszcencia-mikroszkóp Konfokális pásztázó mikroszkóp Polarizációs mikroszkóp Binokuláris mikroszkóp Sztereomikroszkóp

6 Mikroszkópok fajtái Elektronmikroszkópok: Pásztázó elektronmikroszkóp
Transzmissziós elektronmikroszkóp

7 Elektronmikroszkóp

8 Mikroszkópok fajtái: Pásztázószondás mikroszkópok
mikroszkopikus sugárszondát használnak a felület feltérképezésére : szondasugár + detektor: kölcsönhatás alapján: Atomerő mikroszkóp Elektrosztatikus mikroszkóp Mágneses erőmikroszkóp Alagútelektron-mikroszkóp Közeli mező optikai mikroszkópia Pásztázó elektronmikroszkóp Egyéb: akusztikus mikroszkóp: Hanghullámmal, minta hangvezetését méri

9 Fénymikroszkópia Látható fény segítségével
Optikai lencse használatával Felfogó: szem, fotolemez, digitális képalkotó eszköz Korlátok: sötét vagy erős fényvisszaverésű vizsgálandó felület kell Diffrakció miatt: max felontóképesség 0,2 mikrométer Fókuszsíkól kieső pontok csökkentik a kép tisztaságát

10

11 Egy eljárás menetének bemutatása mikroorganizmusokra:
1. Tárgylemez tisztítása: zsírtalanítás 96%-os alkohollal, majd hőkezelés (max °C-on) 2. Preparátum rögzítése (sejtek megtapadása a tárgylemezen) Sok rögzítési eljárás ismeretes; egyik legegyszerűbb: hővel való rögzítés Megjegyzés: finom ultracellulális részletek vizsgálatakor nem alkalmazható, mert a sejt ezen részében durva változásokat okoz a hő 3. Festés: egyszerű vagy összetett festési eljárással Pozitív vagy negatív festés Egyszerű: Polikróm festés, mikroanalitikai festések és indikáló festések Összetet: Differenciáló festések

12 Festési eljárások Láthatóbbá tehetőek velük a minták
Fluoreszcens festékek: Immunfestés Zöld fluoreszcens fehérje pH alapján (mikroorganizmusok festéséhez): Bázikus színezőanyagok (metilénkék, fukszin, malahitzöld, kristályibolya, neutrálvörös) Savas színezőanyagok (eozin) Semleges színezőanyagok (rhodamin B)

13 Gram-pozitív baktérium:
Gram-negatív baktérium:

14 Konkrét alkalmazás: mikroorganizmusok kimutatása: Bacillus cereus és Pseudomonas fluorescens
A megfelelően előkészített tárgylemezre 1 csepp vizet cseppentünk Ebben szuszpendálunk 1-1 kacsnyit az előre kitenyésztett baktériumtenyészetekből (Bacillus cereus és Pseudomonas fluorescens) Alapos elkeverés, és a tárgylemezen minél vékonyabb rétegben történő szélesztés után a készítményt láng felett rögzítjük. Kihűlés után a festést az alábbi séma szerint végezzük: Festés genciánibolya-oldattal 1 percen át Vizes öblítés Pácolás Lugol-oldattal 1 percen át Színtelenítés 96 %-os alkohollal 0,5 percen át Kontrasztfestés szafraninnal 1 percen át Vizes öblítés, szárítás

15 A készítményt immerziós objektívvel vizsgáljuk.
Benne a Bacillus cereus baktériumok kék színű (Gram-pozitív), a Pseudomonas fluorescens sejtek pedig piros színű (Gram-negatív) pálcikaként mutatkoznak. A preparátum értékelésekor tekintettel kell lenni arra a tényre,hogy a festés eredménye függ a tenyészet korától is. Gram-pozitív baktériumok idősebb tenyészete néha Gram-negatív jelleget mutathat. Bacillus cereus Pseudomonas fluorescens

16 Források: Írott források:
Bruno P. Kremer – A mikroszkóp használata, Geobook Hungary Kiadó, 2008. Öveges József- A mikroszkóp és használata picasso.elte.hu/microscopy/pozsgai2005.ppt

17 Források: Képek: archive.microbelibrary.org textbookofbacteriology.net
makszutov.hu auroscience.hu alphaoptika.hu mikroszkop.network.hu elektro-optika.hu mokkka.hu sirbuday.hu