Minőségi azonosítás Minőségi azonosításra a retenciós időt, illetve a relatív retenciós időt használjuk. Kováts-féle retenciós index – szerves vegyületek.

Az előadások a következő témára: "Minőségi azonosítás Minőségi azonosításra a retenciós időt, illetve a relatív retenciós időt használjuk. Kováts-féle retenciós index – szerves vegyületek."— Előadás másolata:

1 Minőségi azonosítás Minőségi azonosításra a retenciós időt, illetve a relatív retenciós időt használjuk. Kováts-féle retenciós index – szerves vegyületek homológ sorain belül az egyes alkotók redukált retenciós idejének a logaritmusa a C atomszám lineáris függvénye. I = 100n.

2 A Kováts féle retenciós index adott vegyületre, adott állófázison, izoterm körülmények között független az oszlop méreteitől, a nyomáseséstől és az áramlási sebességtől. Apoláris állófázison mért retenciós index egyenes arányban van a forrásponttal, tehát a vegyület forráspontja közelítőleg meghatározható. Poláris alkotók indexének hőmérsékletfüggése nem mindig lineáris. Hasonló szerkezetű vegyületeknél azonos helyettesítések a retenciós indexet azonos mértékben változtatják meg.

3

4 Kalibrációs módszer - külső standard módszer
Mennyiségi elemzés Kalibrációs módszer - külső standard módszer Különböző ismert koncentrációjú oldat kromatográfiás csúcs alatti területét mérjük, majd ezek felhasználá-sával kalibrációs egyenest készítünk, melynek iránytangense az érzékenység. Ismeretlen minta koncentrációja az általa szolgáltatott terület / az érzékenység: Kalibrációs egyenes képlete Ai: az i-edik komponens csúcsterülete, wi az i-edik komponens mennyisége

5 Deca-BDE = 10 Br atom egy biszfenil-éteren.

6 Belső standard módszer
Egy ún. belső standardot - mindig azonos mennyiségben hozzáadunk, mind a kalibráló oldatokhoz, mind a mintákhoz. A relatív érzékenység (fi) használatán alapszik. Előnye, hogy kiküszöböli a térfogatos mintabevitelből adódó hibát (a minta komponenseinek teljes és pillanatszerű elpárologtatásának hiánya). Kalibrációs egyenes képlete Ai = ai + bi wi AS As a belső-standard csúcsterülete az aktuális kromatogramban, wi az i-edik komponens mennyisége a belső standard mennyiségével osztva.

7 Származékképzési reakciók
Célja: a mérendő komponens átalakítása valamilyen speciális kémiai reakcióval, annak érdekében, hogy a keletkezett termék könnyen gázkromatografálható legyen. Illékonyság és termikus stabilitás növelése. H-hídképzés csökkentése → csúcsalak javítása Átalakítandó funkciós csoportok: - OH, - COOH, -NH2, - SH, stb. LOD értékek csökkentése – ECD detektornál : halogéntartalmú származékképzés

8 Származékképzés hatása

9 Legfőbb típusaik Szililezés Alkilezés Acilezés 1, SZILILEZÉS
Aktív hidrogén lecserélése általában trimetil-szilil csoportra. Általánosan: 3 Reakció hatásfoka a szililezőszer erősségétől és a kémiai reakcióban résztvevő funkciós csoport minőségétől függ.

10 Szililezhetőségi sorrend:
Alkoholok > Fenolok > Karbonsavak > Aminok > Amidok > Tiolok Sztérikus hatások: Primer alkoholok > szekunder alkoholok > tercier alkoholok Reakció feltételei: A reagenst feleslegben alkalmazzuk. 100 %-osnak kell lennie az átalakulásnak. Reakció körülmények optimálása ( C, 10 – 120 perc, katalizátor). Lehetőleg egyfajta származék keletkezzen (több funkciós csoport esetén), több csúcs keletkezése probléma!

11 Leggyakrabban alkalmazott szililezőszerek reaktivítási sorrendben
N-trimetilszilil-imidazol TMSI N,O-bisz-trimetilszilil-trifluoracetamid BSTFA N,O-bisz-trimetilszilil-acetamid BSA N-metil-N-trimetilszilil-trifluoracetamid MSTFA Hexametil-diszilazán HMDS TMSI aminokkal nem reagál- aminosavaknál szelektív származékolás, acetamid: CH3CONH2 BSTFA illékonyabb, minta a BSA és kevésbé tömíti el a FID detektort MSTFA a legillékonyabb illékony vegyületek elemzéséhez jó

12 Xvégső = NH3 Reakciómechanizmus: Nukleofil szubsztitució Kivitelezés: Oldószer nélkül, csak a szililezőszerrel Oldószerrel (aprotikus): piridin, toluol, acetonitril, hexán Katalizátorok: trifluoro-ecetsav (TFA), trimetil-klór-szilán (TMCS) Egyéb követelmények: Szililezőszerek nagytisztaságúak és vízmentesek legyenek és ne zavarják az elválasztást (koelució mentes). Származékolandó minta vízmentessége! Könnyen hidrolizálnak víz és alkoholok hatására. Stabilitás vizsgálat.

13 Aktív hidrogéneket alkil csoportra cseréljük.
2, ALKILEZÉS Aktív hidrogéneket alkil csoportra cseréljük. Pl. Alkohol → Éter; Karbonsav → Észter Fajtái: 1, Alkilhalogenidek (jodidok, bromidok) R-OH + CH3-I → R-O-CH3 + HI Fenolok, karbonsavak, tiolok Katalizátor: ezüst-oxid 2, Diazotálás (diazometánnal, mérgező) R-OH + CH2N2 → R-O-CH3 + N2 Fenolok, karbonsavak, szulfonsavak Diazometán felesleg elpárologtatása

14 3, ACILEZÉS Aktív hidrogéneket acil csoportra cseréljük Pl. Alkoholok → Észter, Aminok → Savamid Savanhidridek és savkloridok használata Legáltalánosabban használt reagensek: 1, trifluoroecetsav-anhidrid (TFAA) 2, pentafluoropropionsav-anhidrid (PFPA) 3, heptafluorobutánsav-anhidrid (HFBA)

15 A halogén atomok bevitelével lehetőség nyílik az ECD detektor használatára, ami érzékenység növekedést jelent. A reakciót vízmentes körülmények között hajtják végre, majd ezt követi a reagens feleslegének eltávolítása bepárlással, vagy gyenge bázis vizes oldatával való elreagáltatással. A fluorozott származékoknak nagyobb az illékonysága, mint a többi perhalogénezett származéké.

16 A GÁZKROMATOGRÁFIA ANALITIKAI ALKALMAZÁSA
Kőolajipar, petrolkémiai ipar Környezetvédelmi analízis Gyógyszeripari elemzések Oldószermaradványok elemzése Élelmiszer analitika (aromaanyagok, toxinok, szermaradványok) Kozmetikai ipar (illatanyagok).

17 NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA-TOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC
Az alkalmazott nagy nyomás ( bar) lehetővé teszi nagyon finom szemcsézetű töltetek (2-10 μm) használatát, ami jelentősen megnöveli a módszer felbontóképességét. A hagyományos oszloptechnikánál gyorsabb (kényszer áramlás), pontosabb és folyamatosan detektálható. A gázkromatográfiával szemben hőre érzékeny- és nem illó vegyületek esetében is használható. A mozgófázissal szelektív kölcsönhatások alakulnak ki.

18 HPLC FELÉPÍTÉSE

19 OLDÓSZEREK Üveg, vagy műanyag edények.
Megfelelő tisztaság (oszlop védelme és a megfelelő detektálás érdekében!). Gázmentes. Eluensben oldott gázok és főleg az O2 eltá-volítása. Zavarja a pumpa egyenletes működését és a detektorban kis csúcsokat produkál. Gázmentesítés megvalósítása: - melegítés; - vákuum alkalmazása; - ultrahangos szonikálás (rázatás); - sparge = He gáz átbuborékoltatása folyamatosan (oldott gázokat kiűzi). Szűrés – üvegszűrő + vákuum alkalmazása.

20 SZIVATTYÚK Feladatuk: egyenletes, szabályozott folyadékáramlás
Mechanikus szivattyúk – állandó áramlási sebesség biztosítása. Két egymással szemben működtetett váltakozó mozgásirányú dugattyús szivattyúk (reciprok pumpák). Pulzáláscsillapító

21

22 Pulzáláscsillapító 1, tekercs - flexibilis
2, membrán – hexánnal töltve 1 2

23 Szivattyú után nagynyomású szűrő következik (2 μm-es saválló acél).
Nyomásmérő (jelzi, ha az oszlop eltömődik, vagy a szivattyú hibás). Összekötő csövek: saválló acél, vagy speciális műanyag 0,2-0,3 mm belső átmérővel. Minél rövidebb utak → kis holttérfogat (keverőedény effektus). GRADIENSKÉPZŐ Izokratikus elúció – változatlan összetételű mozgófázis Gradiens elúció – az eluens összetételének folyamatos (lineáris, exponenciális, vagy parabolikus), vagy ugrás-szerű változtatása.

24 Mintainjektáló rendszer
Injektált mennyiség (analitikai): μl Fajtái: Injektálószelep - Rheodyne, cserélhető rögzített térfogatú hurkokkal (loop). Automata mintaadagoló Programozható mintamennyiség – motorizált fecskendő. Automatizált mérés (100 mérés/éjszaka).

25 Kézi injektálás

26 Automata mintaadagoló

27 Analitikai: 1,0 µL - 500,0 µL (5-100 µL)
Loop méret alapján Mikro: 0,06 µL - 0,500 µL Analitikai: 1,0 µL - 500,0 µL (5-100 µL) Preparatív: 100 µL - 10 mL

28 OSZLOP Anyaga: saválló acél, vagy műanyag.
10 – 30 cm hosszú, d = 2-6 mm. Analitikai oszlop védelmének érdekében előtét oszlopot használunk (védő oszlop = guard column), mely azonos töltetű, mint az analitikai oszlop (1-5 cm). Töltetek szemcsemérete 2-10 μm, nagy fajlagos felület > 100 m2/g, nagy kapacitás és kellő szilárdság. Hatékonyan elválasztó oszlopot csak egyenletes kisátmé-rőjű, gömb alakú szemcsékből lehet készíteni. Minél kisebb a szemcseméret, annál nagyobb N (nagyobb a fajlagos felület), csökkentésének határt szab a növekvő nyomás, amit a megnövekedett oszlopellenállás produkál (sugárirányú hőmérséklet gradiens). Sugárirányú hőmérséklet gradiens= kromatográfiás entrópia effektus, mely a már elválasztott zónákat visszakeveri. Nagyon kicsi szemcsék a kohéziós erők miatt összeragadnak és így nagyobbként viselkednek. Alsó határ 1-2 um.

29 NORMÁL FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
Állófázis: poláris, mechanikailag stabil. Szilikagél Aluminium-oxid Módosított szilikagél. Porózus anyagok. Szilikagélek átlagos pórus átmérője 6-20 nm (pl. 120 Å), ez red része a szemcseméretnek. Víz dezaktiválja a felületet. Fémszennyezések kerülése. Víz H hidakat képez az OH csoportokkal. Kationok polarizálják az OH csoportokat.

30 Módosított szilikagél
Szabad szilanol csoport (gyenge sav) Szubsztituált klórszilánnal módosítják. Felvitt csoportok: fenil, amino, diol, ciano. Poláris (dipol-dipol, dipol-indukált dipol) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis poláris csoportjai között (-OH, -NH2, -CN), ami retencióhoz vezet. Minél polárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz. Phenyl Propylphenylsilane ligands attached to the silica gel show weak dipole - induced dipole interactions with polar analytes. Usually this type of bonded phase is used for group separations of complex mixtures. Amino-compounds show some specific interactions with phenyl modified adsorbent. CN A cyano modified surface is very slightly polar. Columns with this phase are useful for fast separations of mixtures consistingof very different components. These mixtures might show very broad range of retention times on the usual columns. Cyano-columns could be used on both normal- and reversed-phase modes of HPLC. NH2 Amino-phase is a weak anion-exchanger. This type of column is mainly used in normal-phase mode, especially for selective retention of aromatic compounds. Diol Diols are slightly polar adsorbent for normal-phase separations. These are useful for separation of complex mixtures of compounds with different polarity,  and which usually shows a strong retention on unmodified silica.

31 Módosított szilikagél

32 Mozgófázis Apolárisabb, mint az állófázis (lsd. Eluotróp sorok). Oldószererősség. Minél apolárisabb egy oldószer annál kisebb az oldószererőssége, vagyis a visszatartás (retenciós idő) nagy. Általában szénhidrogének alkotják a mozgófá-zist, ehhez adunk 0,1-20 V/V% poláris oldószert, módosítót (pl. éter, észter, alkohol). Oszlop nyomása Δp = LFηφ ᴨr2 dp2 L = oszlop hossza F = térfogati áramlási sebesség η = viszkozitás φ = az oszlop porozitására jellemző tag r = oszlop átmérő; dp = átlagos szemcseméret

33 ALKALMAZÁSA Apoláris, vagy közepesen poláris izomer vegyületek elválasztása (szénhidrogénekben jól oldódjanak). Sztereoizomerek elválasztása – királis állófázissal Félpreparatív elválasztás – szerkezetazonosításra (hosszabb és nagyobb átmérőjű oszlopok)

34 FORDÍTOTT FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
Mozgófázis polárisabb, mint az állófázis Módosított szilikagél Szerves polimer alapú állófázisok Szén alapú állófázisok

35 Szabad szilanol csoport
Szilikagélt aklilcsoportokat tartalmazó klórszilánnal reagáltatjuk (mono-, di- és triklór-szilánnal). C18H37 Si CH3 OH O Cl + -HCl Savas hidrolízis helye Szabad szilanol csoport

36 A módosítás során a szilanolcsoportok 40-60%-a reagálat-lan marad.
Utóreakció során trimetil-klórszilánnal módosítanak. Endcapping = utóreakció (e) Használhatóság pH tartománya: 2 (alkil csoportok savas hidrolízise) < pH < 8-9 (szilikagél kioldódása). Újfajta oszlopok: pH = 10-11 Apoláris (diszperziós) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis apoláris csoportjai között (C4, C8, C18), ami retencióhoz vezet. Minél apolárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.

37 Mozgófázis Poláris, kis viszkozitású, jó UV áteresztőképességű, kevéssé illékony és toxikus oldószerek. Víz oldószer erőssége a legkisebb, alkalmazott szerves módosítok, melyek a retenciót csökkentik: metanol<acetonitril<eta-nol<tetrahidrofurán. Ionizálható minta esetén pH kontroll kell. Alkalmazott pufferek: foszfát/foszforsav, acetát/ecetsav, ammónia/ammónium-klorid. A puffer UV cut-off-ja kisebb mint a detektálási hullámhossz; Szilárd szennyező mentes (szűrni kell !!!); Adott pH-án mikroorganizmusok (alga, baktérium) képződése; Puffer kompatibilitás a szerves oldószerekkel (kicsapódik magas szerves oldószertartalomnál-szerves pufferek oldékonysága nagyobb); A minta stabilitása nagy legyen az adott pufferben; Puffer mentesítés (vízzel kezdjük majd szerves oldószerrel);

38

39 Funkciós csoportok polaritása:
C-H < C-O-C < C-N-C < CN < C=O < HO-C=O < OH Oldószer Oldószer erősség (ε) NORMÁL! Viszkozitás (cP) UV cut-off (nm) Hexán 0,33 200 Széntetraklorid 0,14 0,97 263 Kloroform 0,31 0,57 245 Diklórmetán 0,32 0,44 235 Tetrahidrofurán 0,35 0,55 215 Dietil-éter 0,29 0,23 Etilacetát 0,45 260 Dioxán 0,49 1,54 Acetonitril 0,50 0,37 190 2-propanol 0,63 2,3 210 Metanol 0,73 0,60 205 Víz >1,00 1 - 30% acetonitril = 50 % metanol lgk azonos We can say now that HPLC retention process has dual nature. First the analyte has to partition into the porous space, which has different eluent composition than the space around the particles. After the analyte had partitioned inside the pores it could get adsorbed on the surface of the stationary phase. This approach could explain some discrepancies in both existing theories of HPLC retention: adsorption and partitioning.

40 Az analízis ideje lecsökken. A felbontóképesség javul.
Gradiens elució A módszer előnyei: Az analízis ideje lecsökken. A felbontóképesség javul. Keskenyebb csúcsok. Nagyobb érzékenység. Gradiens elució Izokratikus elució

41 Gradiens programozás

42 It was suggested that the behavior of the brush phase could be explained as a result of the free chains interacting with themselves in preference to interacting with the aqueous solvent. In effect, this was the same phenomena of immiscibility that occurs between water and a liquid hydrocarbon. The dispersive forces between the hydrocarbon chains themselves are greater than the forces between the hydrocarbon chains and the aqueous solvent. As a result the chains interact with themselves and collapse on the surface of the silica. When the methanol content of the mixture is increased, the solvent becomes more dispersive in nature and the hydrocarbon chains can then interact with the solvent and no longer exist in a collapsed state.

43 Alkil-benzolok, alkil-fenonok és alkil-parabének visszatartás változása a szénatomszám függvényében
Based on this picture we can see that alkylbenzenes expose much stronger retention than phenones. Presence of carbonyl group in phenones molecules makes it more polar and thus reduces the strength of dispersive interactions with hydrophobic surface. Retention of alkylparabenes is the smallest in all three series. Parabenes is an esters of p-hydroxybenzoic acid. Nuclei of this homologous series are very polar and do not show any significant interaction with the surface. Szénatom szám

44 A pH szerepe az elválasztásban
Semleges vegyületek – nincs pH hatás Szénhidrogének, aromás szénhidrogének (PAH), halogénezett aromások (PCB), alkoholok, éterek, ketonok, aldehidek. Savak és bázisok – pH változás hatására ionizálódnak Ionos vegyületek – pH és puffer hatása 2. és 3. esetben a megoldás: pH kontroll → szupresszió, ionos állapot visszaszorítása Ionpárképzés Ioncsere kromatográfia

45 Savas csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a pH függvényében
RCOOH RCOO-/RCOOH B szakaszban legnagyobb a csúcsszélesedés pka alatt és felett 2 egységgel jó dolgozni ez 1/99 és 99/1 arány. Effects in region A b.         Acidic analytes show extremely long retention times (analyte in its neutral form.) Effects in region B Let us assume that neutral molecules will be retained, so during the run ions will move faster, and at the first moment they will be separated from the neutral molecules. But, according to the above equilibrium, in the absence of the neutral molecules ions will tend to form them, and this new neutral molecule will also be absorbed, and so on. This process will lead to the spreading of the component along the column and causes the appearance of the broad peak. a.         Significant loss of apparent efficiency for both, acidic and basic analytes. Peaks are broad and sometimes have weird shape, but mostly tailing or fronting. b.         Very unstable retention. Minor changes in pH or composition of the mobile phase will significantly shift retention. c.         Minor changes of the eluent composition can cause significant change in selectivity. Effects in region C b.         Silica is soluble at high pH. If the column has some accessible silanols (which all columns usually do) high pH may cause steady degradation of the packing material. This brings a loss of the efficiency due to the formation of the void volume, or steady change of component retention. c.         If the mixture of analytes contain s some acidic components, these components will be in anionic form at high pH. Organic analytes in their anionic form usually are strongly solvated and may be completely excluded from the pore space of the packing material. This cause very early elution usually not adjustable by the element composition. pKa RCOO-

46 A pH és módosító hatása savas vegyület elválasztására
Lauric acid, or dodecanoic acid, is a saturated fatty acid with the structural formula CH3(CH2)10COOH . It is the main acid in coconut oil and in palm kernel oil, and is believed to have antimicrobial properties. It is also found in human milk(5.8% of total fat), cows milk(2.2%), and goat milk(4.5%). It is a white, powdery solid with a faint odor of bay oil or soap. Lauric acid, although slightly irritating to mucous membranes, has a very low toxicity and so is used in many soaps and shampoos. Sodium lauryl sulfate is the most common lauric-acid derived compound used for this purpose. Because lauric acid has a non-polar hydrocarbon tail and a polar carboxylic acid head, it can interact with polar solvents (the most important being water) as well as fats, allowing water to dissolve fats. This accounts for the abilities of shampoos to remove grease from hair. tailing

47 Bázikus csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a pH függvényében
R-NH2 R-NH3+/R-NH2 Effects in region A a.         Basic analytes show relatively low retention (analyte in its ionic form). Effects in region B a.         Significant loss of apparent efficiency for both, acidic and basic analytes. Peaks are broad and sometimes have weird shape, but mostly tailing or fronting. b.         Very unstable retention. Minor changes in pH or composition of the mobile phase will significantly shift retention. c.         Minor changes of the eluent composition can cause significant change in selectivity. Effects in region C a.         Very long retention for basic analytes, thus require working with high organic concentration of the mobile phase where pH adjustment is inefficient. pKb R-NH3+

48 A pH hatása bázikus vegyületek elválasztására
Bázikus antihisztaminok (pH=11 !!!)

49 Fordított fázisú ionpár-kromatográfia (RP-IP-HPLC)
A retenció növelése érdekében az eluensbe mmol/L ionpárképző, hidrofób iont teszünk (felületaktív anyagok), melynek töltése ellentétes a meghatározandó anyagéval. Anionos ionpárképző Kationos ionpárképző Alkil-szulfonsavak Tetrabutil-ammónium sók D- és L- kámfor szulfonát Cetil-trimetil-ammónium sók Alkil-szulfátok Dodecil-oktil-dimetil-ammónium sók

50 Kationos ionpárképző és az állófázis elhelyezkedése
C18 állófázis N+ [Molekula ION]-

51 Az RP-IP-HPLC-ben fontos paraméterek
Ionpárképző koncentrációja (c nő → k nő). Ionpárképző jellege (lánc hossz nő → k nő, egyenes lánc – elágazó lánc). Szerves módosító típusa és mennyisége. Puffer koncentrációja, pH-ja (ionos állapot biztosítása). Idegen só koncentrációja.

52 A hőmérséklet hatása az elválasztásra
At the elevated temperature viscosity of liquids decrease and diffusion coefficient increase, thus, from the Van Deemter equation the second term will increase which will lead to the decrease of the efficiency at the very low flow rates (which is not important). The last term will decrease which will lead to the increasing of the efficiency at the common flow rates and it also widen the flow rate range with optimum efficiency. H = 2 λdp + 2γDm k df2 u u π2 (1+k)2 Ds

53 DETEKTOROK A detektor feladata a kiáramló eluensben mérni az összetevő pillanatnyi koncentrációját. A közvetlenül mért detektorjel általában nem maga a koncentráció, hanem annak valamilyen függvénye. Detektor típusok Ultraibolya/ látható fény (UV/VIS), LOD: ~ g Fluoreszcenciás, LOD: g Vezetőképességi , LOD: 10-9 g Törésmutató különbség mérése (RI), LOD: 10-8 g Fényszórásmérésen alapuló (ELS), LOD: 10-8 g Tömegszelektív (LC/MS), LOD: 10-15

54 Detektorok tulajdonságai
Alacsony zajszint és stabil alapvonal (low drift). Megfelelő érzékenység. Gyors jelképzés (12 pont/csúcs). Széles linearitási tartomány. Alacsony holttérfogat (csúcsszélesedés minimalizálása). Könnyen kezelhető és megbízható. Működési körülmények optimalizálhatósága. Dinamikus tartomány (koncentráció változás-jel változást idéz elő) Lineáris tartomány (egységnyi koncentráció változás-állandó jel változást idéz elő) Szelektivitás Érzékenység

55 Spektrofotometriás detektorok Lambert- Beer törvény:
Ezek az eluátum fényelnyelését mérik. Az ultraibolya, eset-leg az ultraibolya és a látható fény tartományban működnek. Lambert- Beer törvény: A = lg (Io/I) = ε×c×l Io = a megvilágító fény intenzítása I = fényintenzítás az abszorpció után c = koncentráció ε = abszorpciós együttható l = optikai úthossz

56 Spektrofotometriás detektorok típusai
1, Higanygőzlámpa, 254 nm, monokromatikus fény, (aromás rendszerek).

57 Átfolyó cella UV/VIS detektálásnál
A kék szín az áramló eluátumot jelzi, a küvetta két ablakát zölddel jelöltük (de a valóságban természetesen színtelen , hiszen kvarcból készül). A fény-nyaláb vízszintesen megy át az ábra középtengelyében. A fényút hossza a két ablak között tipikusan 1 cm, ennek a térrésznek a térfogata néhány mikroliter (v.ö. a csúcsok kb. 100 mikroliteres szélességével). Ideális a 10 mikroliter. Apparent Peak broadening   happens if the flow cell volume is more then 1/10 of the peak volume, or if the cell geometry is not optimized.

58 Több csatornás a, diszperziós – diszperziós ráccsal mono-kromatikus fény előállítása a cella előtt. benzol

59 b, diódasoros (PDA) – széleskörben elterjedt.
A diódasoros detektorok lehetővé teszik a teljes spektrum felvételét igen gyors egymásutánban. Ezekben a küvettát polikromatikus fénnyel világítják át és a felbontás a küvetta után történik. A szétterült fénnyalábot egy (fotó)-diódasorra vetítik. A 200 nm széles analitikai UV tartomány befogadásához diódából álló sor szükséges (felbontás 1-2 nm). A diódasoros detektor segít a csúcsok azonosításában és tisztaságuk ellenőrzésében, mert koelució esetén a csúcs lefutása közben a spektrum alakja változik, míg egyetlen anyag csúcsa esetén a spektrum alakja állandó, csak a magassága változik.

60 PDA detektor Deutérium lámpa tükör erősítő fotódiódasor Átfolyó cella
Optikai rács

61 A és B vegyületek UV spektruma és két eltérő hullámhosszon
felvett kromatogramja. Aλ1 = állandó viszonyszám Aλ2 Csúcstisztaság jellemzése.

62 A klórtalidon gyógyszer tisztaság vizsgálata

63 5 % terc-butil-benzol szennyezés kimutatása antracénban

64 Csúcstisztaság vizsgálat PDA detektorral
b

65 Fluoreszcenciás detektor
Szelektív, mert a szokványos szerves vegyületek közül viszonylag kevés mutat számottevő fluoreszcenciát. Kettős „hangolás” : változtatni lehet a besugárzó fény (UV tartományban) - és a kisugárzott, fluoreszcens, fény hullámhosszát (UV/látható tartományban). Gerjesztési spektrum (excitation) Emissziós spektrum (emission) nyerhető.

66 Az átfolyó küvettát itt is egy szűk fénynyalábbal világítják meg és a beeső fényre merőleges irányból történik a detektálás. A detektált fény intenzitása a fluoreszkáló komponens koncentrációjával egyenesen arányos. Ez a detektor nagyságrendekkel kisebb koncentrációk mérésére alkalmas, mint az UV detektor (10-12g/anyag).

67 Gerjesztési hullámhossz

68 Fluoreszcenciás detektor felépítése

69 AlKALMAZÁS Természetesen fluoreszkáló vegyületek (merev szerkezetű aromás vegyületek, porfin vázas vegyületek, riboflavinok, vitaminok, gyógyszerek). Származékkészítési reakciók alkalmazása fluoreszkáló vegyületek előállítására (OPA + tiol, FMOC, Fluoreszkamin, stb.). OPA + tiol FMOC 9-fluorenil-metil-kloroformát FMOC

70 Tömegspektrometria A tömegspektrometria olyan vizsgálati módszer, amelynél ionos részecskéket választunk el fajlagos tömegük (töltésegységre eső tömegük: m/z) szerint, csökkentett nyomáson, elektromos, vagy mágneses mezők segítségével. Az elválasztott ionok intenzitását folyamatosan mérjük, s így egy ionáram intenzitás - fajlagos tömeg függvény-kapcsolathoz, az ún. tömeg-spektrumhoz jutunk. Ez a tömegspektrum a minőségi információ alapja - fingerprint.

71 Tömegspektrométer részei
Mintabeviteli rendszer (közvetlen: gáz, folyadék, vagy szilárd minta bevitele, közvetett: GC, HPLC. Ionforrás az ionoptikával (ionok előállítása). Analizátor (ionok elválasztása fajlagos tömegük szerint). Detektor (ion, vagy fotonsokszorozó). Vákuumrendszer (első fokozat egy olajrotációs szivattyú (0,1 kPa), a második egy turbomole-kuláris pumpa, mellyel kPa nyomást lehet elérni). Számítógép szabályzó és adatkezelő (adatgyűjtő, feldolgozó, értékelő, archíváló) funkcióval. Az ionforrás feladata, hogy a vizsgálandó molekulából valamilyen gerjesztõ energia (kinetikus, fény, elektromos, kémiai, stb.) segítségével ionokat hozzon létre és ezeket az ionokat lehetõleg azonos kinetikus energiával, egy nyalábban mozgatva, gyorsítva juttassa az analizátorba. A koherens ionnyaláb létrehozását az ún. ionoptika biztosítja, s általában néhány kilovoltos feszültségkülönbség mozgatja a nyaláb ionjait. Az alkalmazott gerjesztési energiától függõen többféle ionforrás létezik. A leggyakoribb az elektronütközéses (EI: electron inpact) ionforrás, amely 50-75 eV energiájú termikus elektronokkal hoz létre ütközési ionizációt gáz fázisban. (Az adatbankokban összegyűjtött tömegspektrumok 95 %-a ilyen ionforrással készült.) Ez a gázfázisú ionizáció behatárolja a vizsgálható vegyületek körét is, hiszen ha bomlás nélkül nem párologtatható el az adott vegyület, akkor nem is vizsgálható e módszerrel. Más esetekben ugyan elpárologtatható a molekula bomlás nélkül, de nem stabil a molekulaionja, azaz keletkezésekor azonnal elbomlik, vagy nagyon kicsi az intenzitása. Kíméletesebb ionizációs megoldást jelent a kémiai-, a gyors atom bombázásos (FAB), a foto-, a lézer deszorpciós, az elektromos, stb. ionizáció. A kémiai ionizációs ionforrás összetett ionforrás. Egy EI ionforrásban reagns gáz (metán, ammónia, stb.) molekulákból ionokat állít elő, amelyeket gyorsítással juttat a hozzá közvetlenül kapcsolódó térrészbe, ahová a vizsgálandó minta gázfázisú molekuláit vezetik be. Az analizátor választja el az ionforrásból nagy sebességgel érkezõ ionokat fajlagos tömegük szerint. Az elválasztás többféle elv alapján oldható meg. Így megkülönböztethetünk: 1. repülési idő (TOF: time of flight), 2. elektromos, pl. kvadrupól, radiofrekvenciás, ioncsapda, omegatron, stb., 3. mágneses analizátorú, 4. elektrosztatikus, illetve 5. kettõs fókuszálású (nagy felbotóképességű), illetve 6. tandem analizátorokat (MS/MS, MSn) alkalmazó tömegspektrométereket. Lényeges eleme a tömegspektrométerek működésének a vákuumot biztosító, többnyire legalább kétfokozatú vákuumrendszer. Az első fokozatot többnyire olajrotációs szivattyú biztosítja, amely atmoszférikusról 3 nagyságrendnyi nyomáscsökkenést hoz létre. Ez biztosítja az olajdiffúziós, vagy turbomolekuláris szivattyúzás elővákuumát. A végvákuum  kPa, amelyet a korszerű rendszerekkel néhány óra alatt el lehet érni és folyamatosan biztosítani lehet. Erre szükség is van, mivel az ionforrásban keletkezõ ionoktól várjuk, hogy a tömegspektrum jellegét megszabják. Ez csak akkor biztosítható, ha a primer, monomolekuláris folyamatokban keletkezõ ionok a gyorsítást követően egymással reakcióba nem léphetnek. Ehhez van szükség a nagy vákuumra, amelynek adott hőmérsékleten olyannak kell lennie, hogy a részecskék szabad úthossza nagyobb legyen, mint az az út, amit a keletkezésüktõl a detektálásukig (elhalásukig) kénytelenek megtenni.

72 Ionforrások Feladata: a vizsgálandó molekulából valamilyen gerjesztő energia (kinetikus, fény, elektromos, kémiai, stb.) segítségével ionokat hozzon létre és ezeket az ionokat lehetőleg azonos kinetikus energiával, egy nyalábban mozgatva, gyorsítva juttassa az analizátorba. 1, Elektronütközési (elektronimpakt) ionizáció (EI) Leggyakoribb (95%) 50-75 eV energiájú termikus elektronok (wolfrámizzószál) Ütközési ionizáció gázfázisban Az ionforrás feladata, hogy a vizsgálandó molekulából valamilyen gerjesztõ energia (kinetikus, fény, elektromos, kémiai, stb.) segítségével ionokat hozzon létre és ezeket az ionokat lehetõleg azonos kinetikus energiával, egy nyalábban mozgatva, gyorsítva juttassa az analizátorba. A koherens ionnyaláb létrehozását az ún. ionoptika biztosítja, s általában néhány kilovoltos feszültségkülönbség mozgatja a nyaláb ionjait. Az alkalmazott gerjesztési energiától függõen többféle ionforrás létezik. A leggyakoribb az elektronütközéses (EI: electron inpact) ionforrás, amely 50-75 eV energiájú termikus elektronokkal hoz létre ütközési ionizációt gáz fázisban. (Az adatbankokban összegyűjtött tömegspektrumok 95 %-a ilyen ionforrással készült.) Ez a gázfázisú ionizáció behatárolja a vizsgálható vegyületek körét

73 EI ionforrás V tér V = V 1: mintabevezető nyílás; 2: ionvisszaverő lemez (repeller); 3: izzószál; 4: elektronbevezető nyílás; 5 és 6: iongyorsító rés; 7: belépő nyílás; 8: ionképződés helye; 9: anód

74 Etilbenzol spektruma Relatív intenzitás bázis csúcs molekulaion

75 Folyadékok ionizálási módszerei HPLC-interfész technikák
Termoszpré (Thermospray) – vákuumba porlasztás, hőstabil vegyületek. Elektroporlasztásós ionizáció (Electrospray) - atmoszférikus nyomáson folyadék porlasztás, hőérzékeny és ionizálható vegyületek. Atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) – atmoszférikus nyomáson folyadék porlasztás, hőstabil és nem ionos vegyületek, kémiai ionizáció. LÁGY IONIZÁCIÓ, KISMÉRTÉKŰ FRAGMENTÁCIÓ

76 ELECTROSPRAY (ESI) Elektrospray ionizáció során a kromatografáló oszlopról eluálódó ionos molekulákat (szerves savak, szerves bázisok, vagy sóik) egy porlasztó gáz egy feszültség alatt lévő kapillárison porlaszt keresztül. A folyadékcseppekbe zárt töltéshordozók sűrűsége az intenzív párolgás (nincs hőbomlás!) követ-keztében egyre nagyobb lesz, s szinte szétrob-bannak a cseppek, s a szabaddá vált ionok gyorsítás után az analizátorban elválaszthatók fajlagos tömegük szerint.

77 ELECTROSPRAY In electrospray ionisation (ESI) a fine spray of charged droplets is created by the application of a high voltage (typically 1-3 kV) to a capillary containing a flowing liquid. The process is often assisted by use of a co-axial nebuliser gas, such as nitrogen, but it is important to note that formation of the micro-droplets is ultimately an electrostatic rather than mechanical phenomenon (see below). As with APCI, electrospray ionisation occurs at atmospheric pressure, but solution processes - rather than gas phase ion/molecule reactions - result in ion formation 1-3 kV

78 Pozitív ionizáció Negatív ionizáció Amin Karboxil Amid Hidroxil/fenol
In a simplified model of ESI, charged droplets - expelled from the tip of the capillary - evaporate until the Rayleigh limit is reached (i.e. the point at which Coulomb repulsion equals surface tension). Beyond this limit the droplets are unstable and explode to form micro-droplets. This process is repeated until individual solvated ions are formed. Evaporation of the solvent results in the generation of isolated gas-phase ions. Larger molecules, with a number of chargeable sites, tend to show a distribution of charge states. In the following illustration, the droplets contain singly, doubly and triply charged positive ions: ESI is suitable for the analysis of organic compounds with medium - high polarity. Since positive ionisation is dependent on protonation, molecules containing basic functional groups work well in this mode. Negative ionisation, in contrast, functions by deprotonation, thus the presence of acidic functional groups is a prerequisite for reasonable limits of detection. Although ESI has traditionally been used in the analysis of polar biomolecules, such as peptides, carbohydrates etc., many relatively small organics are amenable to this technique - providing they contain sufficient functionality. Pozitív ionizáció Negatív ionizáció Amin Karboxil Amid Hidroxil/fenol Észter Imid Aldehid/keto

79 Pozitív ionizáció:[M+H]+, [M+Na]+, [M+CH3CN+H]+
Negatív ionizáció:[M-H]- [M+HCOO]- Lassú áramlási sebesség < 1 ml/min Eluens pH: - Savas, a bázikus komponenseknél, pozitív módban. - Bázisos, a savas komponenseknél, negatív módban. Puffer: Illékony és kis koncentrációjú (ion szupresszió elkerülése) The concentration of the buffer, or acid or base used to adjust/control the pH should be as low as possible. If not, competition between analyte and electrolyte ions for conversion to gas-phase ions decreases the analyte response.This can be explained as follows: if a species is in large excess, it will cover the droplet surface and prevent other ions to access the surface, and thus to evaporate. A species in large excess will also catch all charges available and prevent the ionisation of other molecules present at much lower concentration.

80 Lószív mioglobin ESI tömegspektruma (M: 16955 Da)
Gauss görbe Although protein digestion is still an important technique for mass spectrometry, it is now relatively easy to obtain direct mass measurements of proteins by ESI-MS. The multiple charges (see above) are statistically distributed upon the basic sites of the protein. Fig.3 shows a typical ESI mass spectrum of horse heart myoglobin (16.9 kDa). The peaks observed are due to the multiple charging affect, in this case the charges are roughly Gaussian distributed around the +15 charge state ranging from +22 to +10. The actual distribution of charges is dependent on a  number of factors, but most commonly the electrospray conditions can greatly affect charge distribution as well as the gross structure of the protein (i.e. the actual availability of the basic sites). Studies of charge distribution are commonly used to make inferences about the tertiary structure of the protein.

81 APCI Az APCI eredetileg nem ionos vegyületek vizsgá-latára alkalmas ionizációs interfész. A folyadékkromatográfiás eluens molekulái ionizálódnak (pl. a vízből keletkeznek H3O+), s ezek az ionok képesek protonálni (kémiai ioni-záció) az eredetileg nemionos molekulákat. A keletkező pszeudo-molekulaionokat (M+H)+, (M+Na)+, (M+oldószer ionja)+ és néhány fragmen-sét gyorsítás után az analizátor választja szét. Poláros szerves vegyületek analízise (gyógyszerek!) The electric field is sufficiently strong to ionise solvent vapour by either removal (positive ion mode) or donation (negative ion mode) of an electron. Ion/molecule reactions then result in the formation of a reactive species.

82 APCI The significant difference is that APCI occurs at atmospheric pressure and has its primary applications in the areas of ionisation of low mass pharmaceutical compounds (APCI is not suitable for the analysis of thermally labile compounds). The general source set-up (see fig. 1) shares a strong resemblance to electrospray ionisation (ESI) and as such is most commonly used in conjunction with HPLC or other flow separation techniques. Where APCI differs to ESI, is in the way ionisation occurs. In ESI, ionisation is bought about through the potential difference between the spray needle and the cone along with rapid but gentle desolvation. In APCI, the analyte solution is introduced into a pneumatic nebulizer and desolvated in a heated quartz tube before interacting with the corona discharge creating ions. St. Elmo’s Fire = korona kisülés St. Elmo's Fire and normal sparks both can appear when high electrical voltage affects a gas. St. Elmo's fire is seen during thunderstorms when the ground below the storm is electrically charged, and there is high voltage in the air between the cloud and the ground. The voltage tears apart the air molecules and the gas begins to glow. It takes about 30,000 volts per centimeter of space to start a St. Elmo's fire (although sharp points can trigger it at somewhat lower voltage levels.) The nitrogen and oxygen in the earth's atmosphere causes St. Elmo's Fire to fluoresce with blue or violet light; this is similar to the mechanism that causes neon lights to glow[5]. N2 400 0C 3 kV

83 The corona discharge replaces the electron filament in CI - the atmospheric pressure would quickly "burn out" any filaments - and produces primary N2°+ and N4°+ by electron ionisation. These primary ions collide with the vaporized solvent molecules to form secondary reactant gas ions - e.g. H3O+ and (H2O)nH+ (see fig. 2). These reactant gas ions then undergo repeated collisions with the analyte resulting in the formation of analyte ions. The high frequency of collisions results in a high ionisation efficiency and thermalisation of the analyte ions. This results in spectra of predominantly molecular species and adduct ions with very little fragmentation.

84 Atropin APCI tömegspektruma

85 MS-ANALIZÁTOROK Az analizátor választja el az ionforrásból nagy sebességgel érkező ionokat fajlagos tömegük szerint. Fajtái: 1. repülési idő (TOF: time of flight), 2. elektromos, pl. kvadrupól és ioncsapda, 3. mágneses analizátorú, 4. elektrosztatikus, 5. kettős fókuszálású (nagy felbotóképességű), 6. tandem (MS/MS, MSn) .

86 TOF Ha minden töltéshordozó azonos kinetikus energiára tesz szert, akkor egyszeres iontöltés esetén: Z = iontöltése V = gyorsítófeszültség v = ion sebessége t = idő L = úthossz m = tömeg Ionok sebessége a tömegük négyzetgyökével fordítva arányos

87 Kalibrálás: pontosan ismert m/z értékű ionokra
Ha L = 1m és V = 2000V, akkor t N2+ = 8,37 μs és t O2+ = 8,94 μs

88 V/V0 = állandó ω a meghatározó!
A kvadrupólus tömeganalizátor négy párhuzamosan elhelyezkedő elektromosan vezető fémrúdból áll. Az ionforrásból érkező ionsugár a rudakkal párhuzamosan az általuk képezett üregen halad át. Az átlósan egymással szemben elhelyezkedő két-két rudat elektromos vezeték köti össze. Az így kialakult két rúd-pár szimultán kapcsolódik egy egyenáramú áramforrás ellentétes pólusaihoz és egy rádiófrekvenciás oszcillátorhoz. Az általuk létrehozott elektromos (kvadrupólus) tér a rudak között haladó ionsugárra merőleges. Az ionok az egyen- és váltóáram együttes hatására haladási irányukra merőleges transzverzális mozgást végeznek. A rudak közötti térben haladó pozitív ionokat az éppen pozitív töltésű rudak taszítják, míg a negatív töltésűek vonzzák. Mivel az oszcillátor hatására a fém rúd-párok relatív töltése folyamatosan változik az ionok szabálytalan oszcillációs mozgást végezve haladnak a rudak között. E mozgás az alkalmazott egyenáram Vdc feszültségétől, az oszcillátor  frekvenciájától és amplitúdója Vac nagyságától, valamint az ionok m/z értékétől függ. A detektorba csak azok az ionok jutnak be, amelyek e mozgás során végig haladnak a négy rúd által határolt térben, a többi ion az elektródként viselkedő rudak valamelyikéhez csapódva elveszíti mozgási energiáját. A működés lényege, hogy a kvadrupól teret úgy változtatják, hogy a V/Vo állandó maradjon. Ezzel lényegében a tér frekvenciája változik. Csak az az ion képes az ionforrásból a detektorba eljutni, amelynek a sajátfrekvenciája azonos a kvadrupól tér pillanatnyi frekvenciájával.

89 Ioncsapda – Ion Trap (IT)

90 Az elektronemitterből érkező elektronok egy kapuelektródon át 50-80 eV-os energiával jutnak be az ioncsapda elektródok közé, ahová a mintát is bevezetjük. Ionizáció (EI, CI). Az ioncsapda elektródok olyan háromdimenziós teret hoznak létre, amelyben az ionok aperiodikus oszcillációra kényszerülnek, s a csapdában vannak mindaddig, amíg egy axiális amplitúdó moduláció (RF változtatása) az adott fajlagos tömegű és adott rezgésre képes iont az ionsokszorozó detektorba nem juttatja. Érzékenyebb, mint a kvadrupól. Kis helyigény. MS/MS könnyen megvalósítható.

91 Detektor A detektor fő feladata az, hogy az egyes ionok számával arányos intenzitású jelet szolgáltasson. A legelterjedtebben ion-, vagy fotosokszorozó detektorokat használunk. Az ionsokszorozók (ionmultiplierek) eseté-ben a felfogó elektródra (dinód) becsapódó ionok elektronemissziót váltanak ki, ezek az elektronok a szemben elhelyezkedő elek-tródra csapódva szekunder elektronemisz-sziót hoznak létre ( jelerősítés).

92

93 Tömegspektrometria alkalmazása
gázelemzés: lámpa töltőgázok elemzése, fermen-tációs gázelegyek. izotóparány mérés: kőzetek, ásványok, biológiai rendszerek elemeinek izotóparány meghatá-rozása (pl. geológiai kormeghatározás, fossziliák kora). szervetlen környezetszennyezők elemzése: ICP-MS. szerves szerkezetvizsgálat (pontos tömegmérés, elemösszetétel, szerkezet meghatározása céljá-ból). szerves rendszerek minőségi és mennyiségi összetételének meghatározása (GC-MS, LC-MS).