Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Bioszeparációs technikák ELVÁLASZTÁSTECHNIKA Mikrobiológiai szakképzés Zsigrainé dr. Vasanits Anikó Zsigrainé dr. Vasanits Anikó.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Bioszeparációs technikák ELVÁLASZTÁSTECHNIKA Mikrobiológiai szakképzés Zsigrainé dr. Vasanits Anikó Zsigrainé dr. Vasanits Anikó."— Előadás másolata:

1 Bioszeparációs technikák ELVÁLASZTÁSTECHNIKA Mikrobiológiai szakképzés Zsigrainé dr. Vasanits Anikó Zsigrainé dr. Vasanits Anikó

2 Tematika 1, Bevezetés, adszorpciós kromatográfia 1, Bevezetés, adszorpciós kromatográfia 2, Oszloptechnikák - Ion-, gél- és affinitás kromatográfia 2, Oszloptechnikák - Ion-, gél- és affinitás kromatográfia 3, Általános kromatográfiás fogalmak 3, Általános kromatográfiás fogalmak 4, Gázkromatográfia (GC) 4, Gázkromatográfia (GC) 5, Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) 5, Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) 6, Tömegspektrometria, kapcsolt technikák 6, Tömegspektrometria, kapcsolt technikák 7, Mintaelőkészítés, alkalmazások 7, Mintaelőkészítés, alkalmazások

3 MŰSZERES ANALITIKA Elektroanalitikai módszerek Elektroanalitikai módszerek Spektroszkópiai módszerek Spektroszkópiai módszerek Elválasztástechnikai módszerek Elválasztástechnikai módszerek

4 Elválasztástechnika KROMATOGRÁFIA: Speciális fizikai-kémiai, analitikai és preparatív elválasztási módszerek összessége, oldatban levő, szilárd, vagy gázhalmazállapotú, sokkomponensű elegyek összetevőinek egymástól való elkülönítésére. Általános alapelv: Egy keverék komponenseinek két egymással nem elegyedő fázis (álló- és mozgófázis) közötti anyagátmenet, valamint az egyes alkotóknak az álló- és mozgófázissal való eltérő kölcsönhatása.

5 Álló- és mozgófázis Állófázis: - szilárd, - folyékony, de mindenképpen helyhez kötött. Mozgófázis: - gáz  gázkromatográfia - folyadék  folyadékkromatográfia - szuperkritikus folyadék  szuperkritikus fluid kromatográfia A fázisok közötti anyagátmenet dinamikus jellegű. Minta „útja”: mozgó fázis  állófázis  új mozgó fázis új állófázis

6 Kromatogram kialakulása

7 Csúcs elúciós profil K i = c i,s c i,m c i,m

8 Dinamikus egyensúly jön létre. Időegység alatt az állófázisba bejutott molekulák (atomok, ionok) száma = időegység alatt a mozgó- fázisba jutott részecskék száma (egy másik pontján a rendszernek). Speciális kölcsönhatások a minta és az állófázis között: a, Fizikai - adszorpció, - abszorpció (megoszlás). b, Kémiai - másodlagos kötőerők, - sav-bázis és ionos kölcsönhatások. c, Biológiai - enzim-szubsztrát kapcsolat

9 A kromatográfiás módszerek csoportosítása MÓDSZERKÖLCSÖNHATÁSAFFINITÁS MÉRTÉKE Adszorpciós kromatográfia AdszorpcióAdszorpciós együttható Megoszlási kromatográfia Megoszlás (extrakció) Megoszlási állandó Ioncserés kromatográfia Elektrosztatikus (megoszlás) Töltés, disszociációs állandó, ionátmérő Gélkromatográ- fia DiffúzióMolekulaméret Affinitás kromatográfia Biospecifikus (adszorpció) Nincs általános mérték (Michaelis állandó)

10 ADSZORPCIÓS KROMATOGRÁFIA Elválasztás alapja: Egy bizonyos fázisban oldott keverék egyes összetevői a másik fázis határfelületén koncentráció különbségeket mutatnak. Eltérő adszorpciós koefficiensek → koncentráció különbség a fázishatáron. Elrendezés: szilárd adszorbens  folyékony-, vagy gáz mozgófázis (oszlopban, síklapon) Az összetevők eltérő adszorpciója az adszorbens részecskék felületén → a komponensek a mozgófázissal fokozatosan távoznak, eluálódnak.

11 Adszorpciós oszlopkromatográfia

12 Adszorbeált anyag és adszorbens közötti kölcsönhatás  Koordinatív kötés  Másodlagos kötőerők (diszperziós, dipól-dipól és H-híd)  DE! Kemiszorpció- kovalens kötés kialakulása kerülendő

13

14 Adszorpciós egyensúly jellemzése az adszorpciós együtthatóval K A ~ c 2 állófázis c 1 mozgófázis

15 Adszorbensek jellemzése 1. Megfelelő szemcseméret. 2. Szilárdság. 3. Nagy felület (≥100 m 2 /g). 4. Egyenletes pórusméret. 5. Egyenletes szemcsealak, lehetőleg szabályos gömböcskék. 6. Oldhatatlan legyen a mozgófázisban. 7. Indifferens legyen a mozgófázissal és az elválasz- tandó vegyületekkel szemben.

16  Adszorbens kapacitása: egységnyi tömeg által adszorbeált anyagmennyiség.  Adszorbens aktivitása: kötőképesség erőssége.  Adszorbens szelektivitása: egységnyi adszorbenstömegen legnagyobb mértékben adszorbeált komponens mennyisége a többi összetevőhöz képest. Szervetlen adszorbensek: 1, Szilikagél – legáltalánosabban használt, Si-OH felületi csoportokkal, H-híd képzése az elválasztandó anyagokkal. Gyengén savas természetű – bázisos anyagok elválasztási nehézsége.

17 OOOO

18

19 2, Aluminium-oxid – bázisos jellegű Felületi Al-OH- és Al-O - -hoz kapcsolódó H-híd képzése. Szerves adszorbensek: 1, Aktívszén Növényi és állati eredetű anyagok elszenesítési terméke (fa-, dióhéj-, csont-, vér- és cukorszén). Apoláros adszorbens → nagy móltömegű, szerves vegyületek kötődnek nagyobb mértékben (aromás-, kén-, bróm-, és jódtartalmú molekulák) diszperziós kölcsönhatások révén.

20 A mozgófázis jellemezése A minta összetevőit eltérő mértékben oldja. 2. A minta összetevőivel és az állófázissal ne alakuljon ki irreverzibilis kölcsönhatás. 3. Viszkozitása csekély legyen. ELUOTRÓP SOROK A mozgófázis elúciós készségét jellemezzük az alkalmazott rendszer függvényében (adszorbens és adszorbeált anyag). Az elúciós készség a dielektromos állandóval (ε) arányos. Sorrend: a, aluminium-oxidon (hidrofil adszorbens): hexán<

21 Kromatográfia = színes írás Mihail Cvet 1903 – növényi pigmentek elválasztása adszorpciós oszlopkromatográfiával. CaCO 3 állófázis - petroléter /etanol mozgófázis.

22 Kísérleti elrendezés

23

24 MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA A folyadék-folyadékkromatográfiás elválasztás elvi alapja a megoszlás → oldódási egyensúly jön létre: Kd = c1 vegyület koncentrációja az állófázisban ↓ c2 vegyület koncentrációja a mozgófázisban Megoszlási állandó A folyékony állófázis rögzítése: Szilárd szemcséket folyadékban duzzasztják és oszlopba töltik. Állófázis típusai: 1, Szilikagél – poláros felület, apoláros mozgófázis, módosítok használata (pl. 1% víz). 2, Cellulózpor – használat előtt a szerves oldószerrel extra- hálni kell.

25 Állófázis: poláris Mozgófázis: apoláris (szerves oldószer) Egymással ne elegyedjenek Egymásban kevéssé oldódjanak

26 Belső kromatogram - rövidebb elválasztás, mivel az eluciót, csak a komponensek tölteten való elkülönítéséig végez- zük. Külső kromatogram – az eluciót addig végezzük, amíg az elválasztott komponensek el nem hagyják az oszlopot.

27 IONCSERÉS KROMATOGRÁFIA Az ioncserélők olyan szerves vagy szervetlen anyagok, amelyek poláris funkciós csoportjaik réven képesek kationjaikat vagy anionjaikat az oldatban lévőkkel kicse- rélni. Az ioncserélők általá- ban szilárd halmazállapotú anyagok, de lehetnek vízben nem oldódó folyadékok is. Az ioncserélők funkciós cso- portjai lehetnek savak (katex - kationcserélő) vagy bázisok (anex – anioncserélő).

28 Ioncserélők típusai 1. Ioncserélő gyanta - sztirol és divinil- benzol kopolimere Stabilak és nyomásállók. Gömb alakú részecskék (emulziós poli- merizáció). Aromás gyűrűre viszik fel kémiai reakcióval a megfelelő ioncserélő sajátságú funkcióscsoportokat.

29 Ioncserélő gyanta - sztirol és divinil-benzol kopolimere

30 2. Dextránalapú ioncserélők DEAE-Sephadex (dextránra kötött dietil-amino- etil). CM-Sephadex (karboxi-metil csoport). Stabilak. Vízben és szerves oldószerekben oldhatatlanok Szilikagél alapú ioncserélők a. Módosított szilikagél, (3‹pH‹7). b. Szerves polimerrel fedett szilikagél (üveggyöngy). Az 1. és 3.b fázisok azok, amelyek nyomás alatt alkalmazhatók, így kis szemcseátmérőjű töltettel töltött kolonnákban használhatók, azaz nagy hatékonysággal üzemeltethetők.

31 4. 4. Aluminium-oxid alapú ioncserélők Amfoter jelleg!!! A hidrált alumínium-oxid anion és kationcserélő formája

32 Gyantához kötött funkciós csoportok KATEX típusú: Rgyanta-SO 3 H erősen savas Rgyanta-COOH közepesen savas Rgyanta-OH gyengén savas ANEX típusú: Rgyanta-NR 3 OH erősen bázisos Rgyanta-NH 3 OH közepesen bázisos Ioncserélő kapacitás: megkötött ellentétes töltésű ion mennyiség egységnyi tömegű tölteten (mmol/g vagy mekv./g).

33 Kationioncsere: Rgyanta-SO 3 H + Na +  Rgyanta-SO 3 Na + H + Az oldatban lévő Na + ionok a ioncserélő gyantára kötődnek, miközben ekvivalens mennyiségű H + ionok kerülnek az oldatba. Eluensként híg, erős savakat használnak. Anioncsere: Rgyanta-N(CH 3 ) 3 OH + Cl -  Rgyanta- N(CH 3 ) 3 Cl + OH - Vagyis a gyantára kötött OH - ionok szabadulnak fel. Eluensként bázisos oldatokat használnak.

34 Anioncserélők - jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített pozitív töltések találhatók az elválasztás körülményei között. Kationcserélők - jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített negatív töltések találhatók az elválasztás körülményei között. Erős anioncserélők azok, amelyek ioncserélő kapacitása független az eluens pH értékétől. Ilyenek a kvaterner-ammó- nium vegyületek (pl. trimetil-ammónium, Type I).

35 Gyenge anioncserélők, ezeknél a fázisoknál az ioncserélő kapacitása az eluens pH értékének függvénye. Ilyen csopor- tok a primer, a szekunder és tercier aminok.

36 Gyenge kationcserélők állófázis szerkezete és kapacitás függése a mozgó fázis pH értékétől

37 Ionok kötödésének erőssége függ:  Ionméret és fajlagos töltés.  Eluens jellemzőitől (víz, só, szerves oldószer elegye):  puffer ion-koncentrációja,  puffer pH-ja,  alkalmazott szerves módosítok (metanol, etanol, glicerin, butanol, acetonitril),  ellenion, mely a meghatározandó összetevővel verseng és ennek a folyamatnak az eredménye megszabja a visszatartást és a szelektivitást.

38 Anionok meghatározásakor többértékű gyenge savakat (pl. benzoesav, o-ftálsav, citromsav, borkősav) teszünk a mozgó fázisba, ezek ionos formái szolgáltatják az ellenionokat. Az o-ftálsav ionizációjának és eluenserősségének függése a mozgó fázis pH értékétől eluenserősség, eluenserősség

39 Kationok elválasztásakor többértékű gyenge bázisokat (pl. etilén-diamin, 2-metil-piridin) teszünk a mozgó fázisba, ezek ionos formái szolgáltatják az ellenionokat. A visszatartást megszabó folyamatok komplexképzőt és szerves bázist tartalmazó mozgó fázis alkalmazásakor

40 DETEKTÁLÁSI MÓDSZEREK  Az ionkromatográfiában fő detektálási módszer a mozgó fázis vezetésének figyelése, mérése. Az egykolonnás ionkro- matográfiában ez egy átfolyó mérőteres vezetőképességi cellát jelent. Meghatározások 95%-ában. 5 ppb – 5 ug/L kimutatási határ.  Ion folyadékkromatográfiában csak néhány ionnak van az UV, vagy a látható fénytartományban fényelnyelése. Ezek például a jodid, nitrit, nitrát, jodát, kromát, permanganát.  A kationok meghatározásánál használhatunk kolonna utáni (post column reaction) vagy kolonna előtti (precolumn reaction) származékképzést, s így színes komplexeket kapunk.

41 Ionelnyomás (szupresszió) hatása Idő (min) Szupresszió előtt Szupresszió után Vezetőképesség (mS)

42 Két kolonnás ionkromatográfia

43 Ion elnyomás (supressed ion chromatography) ioncserekromatográfiánál – két kolonnás módszer cél: a mozgófázis vezetőképességének csökkentése a detektálás előtt Klorid ion mérése Az ionelnyomóban (erős kation cserélő oszlop H formában) lejátszódó folyamatok, ha az eluens puffere NaHCO 3, vagy Na 2 CO 3 : Gyanta-SO 3 - H + + Na + → Gyanta-SO 3 - Na + + H + H + + HCO 3 - → H 2 CO 3 H + + Cl - → HCl A mozgófázis vezetőképessége csökken (Na + → H 2 CO 3 ). Az elválasztott ion vezetőképessége megnő (NaCl → HCl).

44 ELVÁLASZTÁSOK 1. Kationok elválasztása kationcserélő gyantaoszlopon 1=litium, 2=nátrium, 3=ammónium, 4=kálium, 5=magnézium, 6=kalcium

45 2. 2. Vízanalitikában a főbb ionok, különösen az anionok klorid, szulfát, stb. mérésére. !!!! 3. Vízlágyítás: Ca 2+ és Mg 2+ ionok Na + -ra cserélése. 4. Hidrofil szerves anyagok elválasztása

46 Vízanalitika, ásványvízek

47 5. Automatikus aminosav analizátor Erősen savas kationcserélő gyantán történik az amino- savak elválasztása.  Az aminosavak kötődését nagyon sok tényező befolyásolja, alapvető szerepe a pH-nak és az ellenion koncentrációnak van. Alacsony pH-n az aminosavak kationként viselkednek. A pH növelésével egyre kevésbé, az izoelektromos pont elérésekor és magasabb pH-n egyáltalán nem kötődnek a gyantához.

48 Az aminosavakat erősen savas oldatban visszük fel az oszlopra, hogy a megkötődés azonnal bekövetkezzék. Az elúcióhoz pH 3-10 közötti pufferek széles skálája használa- tos. Az elúció leggyakrabban lépcsős gradiens elúció, azaz 3- 4, fokozatosan növekvő pH-jú és ellenion koncentrációjú pufferrel történik az elválasztás. Az oszlopról távozó eluátumban az aminosavak mennyiségét általában ninhidrines színreakcióval határoz- zák meg. A fotometrálás átfolyó küvettás detektorban tör- ténik. Az aminosavak többsége (a primer aminok) a ninhidrinnel liláskék színreakciót ad ami 570 nm-en fotometrálható. A szekunder aminok (prolin, hidroxi- prolin) a ninhidrinnel sárga színű terméket képeznek, ami 440 nm-en mérhető.

49 Aminosavak reakciója ninhidrinnel

50

51  Szinonim elnevezések: gélszűrés, molekula- szűrés, méretkizárásos kromatográfia (SEC), géláthatolási kromatográfia (GPC).  Egyike a legfontosabb biokémiai eljárásoknak.  Elsősorban biológiai mak-romolekulák tisztítására alkalmazzák. 30 éve alkal-mazott technika.  Fordított szűrő! GÉLKROMATOGRÁFIA

52 Gélképző anyagok 1. Természetes gélképző anyagok Agaróz: D-galaktóz és 3,6-anhidro-L-galaktóz egységekből felépített lineáris poliszacharid. → Sepharose → Sepharose 2. Félszintetikus gélképző anyagok Dextrán: glükózegységekből 1,6-α-glükozid kötésekkel felépített lineáris poliszacharid, kevés oldallánccal. → Sephadex A nyers dextrán részleges hidrolizsével nyert dextránfrakciók lúgos oldatához epiklórhidrint adnak. A keresztkötések számával csökken a gélek pórusmérete és annak a molekulaméretnek a határértéke, amely a gél szerkezetébe még éppen behatolhat.

53 3. Szintetikus gélképző anyagok Akrilamid-akrilát kopolimerek: akrilamid és a N,N’- metilén-bisz-akrilamid kopolimerizációjával állítják elő. A pórusméretet elsősorban az akrilamid koncentrációja, másodsorban a keresztkötéseket létrehozó N,N’- metilén-bisz-akrilamid aránya határozza meg. Kereskedelmi forgalomban a Bio-Gel P típusok vannak. Előnyük, hogy a szemcsék ridegebbek, mechanikai hatásoknak ellenállóbbak, valamint a bakteriális hatások iránt közömbösek. Előnyük, hogy a szemcsék ridegebbek, mechanikai hatásoknak ellenállóbbak, valamint a bakteriális hatások iránt közömbösek.

54

55

56 A GÉLKROMATOGRÁFIA ALKALMAZÁSI TERÜLETEI 1. Makromolekulák sómenetesítése 2. Puffercsere Minta előkészítése pufferváltással ioncseréhez, vagy affinitás kromatográfiához. 3. Reakciók lezárása makromolekulák és alacsony molekulatömegű reagensek között. 4. Frakcionálás Hasonló molekulaméretű anyagok elválasztása → gél (megfelelő frakcionálási tartomány) helyes megválasz- tása elsődleges. 5. Polimerek móltömeg eloszlása 6. Molekulatömeg meghatározás – ismert tömegű fehérje standard oldatokkal kalibráció.

57 Makromolekulák sómenetesítése A 570 nm Vezetőképesség (μS)

58 V 0 = szemcsék közötti térfogatV i = pórustérfogat teljes kizárási M teljes áteresztési M mérési tömeg V (ml) lgM

59 Frakcionálási példa Keverék: glutamát dehidrogenáz (Mt = 290,000) glutamát dehidrogenáz (Mt = 290,000) laktát dehidrogenáz (Mt = 140,000) laktát dehidrogenáz (Mt = 140,000) szérum albumin (Mt = 67,000) szérum albumin (Mt = 67,000) ovalbumin (Mt = 43,000) ovalbumin (Mt = 43,000) cytochrome c (Mt = 12,400) cytochrome c (Mt = 12,400) Bio-Gel P-150 oszlopon Bio-Gel P-150 oszlopon mérési tömeg 15 kD – 150 kD

60 Polimerek elválasztása

61 AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA Az affinitás kromatográfia olyan típusú adszorpciós kromatográfiás eljárás, amelyben a tisztítandó anyag specifikusan és reverzibilisen adszorbeálódik a ligandhoz, amely egy oldhatatlan anyagon (mátrix) van rögzítve. 20 éve alkalmazott technika. Koncentráló hatású. Nagyfokú szelektivitás jellemzi.

62 ALKALMAZÁSA 1.Anyagok tisztítására (enzim, antitest) komplex biológiai elegyekből. 2.Ugyanazon anyag natív formájának elválasz-tására a denaturált anyagtól. 3.Receptorok, enzimek, DNS fragmensek izolálása. 4.Az ipari biotechnológiai alkalmazásokban monoklonális antitestek gyártása.

63 Mátrix tulajdonságai: Oldhatatlan az alkalmazandó pufferekben és oldószerekben. Mechanikailag és kémiailag stabil, jó átfolyási tulajdonságokkal. Könnyen kapcsolható a ligandhoz. Ligand tulajdonságai: Specifikus és reverzibilis kötődési affinitással kell rendelkeznie a tisztítandó anyaghoz. Megfelelő kémiai csoportokkal kell rendelkeznie a mátrixhoz való kötödés érdekében.

64 Mátrix fajták 1. Agaróz D-galaktóz és 3,6-anhidro-L-galaktóz egységekből felépített lineáris poliszacharid. → Sepharose (lsd. gélkromatográfia)

65 2. Poliakrilamid (lsd. gélkromatográfia) A poliakrilamid-gyöngyök szintetikus akrilamid poli- merek, melyeket bisz-akrilamidos keresztkötésekkel megfelelően szilárd mátrixanyaggá alakítanak. Hátránya: - erősen tapad az üvegfelületekhez. 3. Szabályozott pórusú üveg Legáltalánosabban alkalmazott szervetlen mátrix. Előnye: nagy mechanikai stabilitása. Használat: enzimek immobilizálása, melyeket biokata- lizátorként alkalmaznak a biotechnológiai folyama- tokban.

66

67 Az affinitáskromatográfiás elválasztás lépései: 1, A tisztítandó anyag megkötése. Kialakuló kölcsönhatások: - elektrosztatikus; - hidrofób; - hidrogénhídkötések. Minta oldása megfelelő felvivő pufferben. 2, A nem kötődött anyagok kimosása (10 oszloptérfogat pufferrel). 3, Elució – kölcsönhatások megszüntetése 1, Szelektív elució: biospecifikus elució, melyben az eluálószer a, vetélkedik a liganddal a szelektíven kötött anyagért (leoldás) b, vetélkedik a megkötött anyaggal a ligandért (leszorítás)

68 a, Elution of NADP dependent enzymes from Blue Sepharose by adding NADPH b, Elution of HIS tagged proteins from HiTrap Chelating by adding imidazole

69 2, 2, Nem szelektív elució, sokszor denaturálódást jelent: a, pH változtatása megvál- toztatja a töltéssel rendelkező csoportok ionizáltsági fokát a kötő helyeken → deszorpció b, ionerősség változtatása növekvő ionerősségű puffer használatával → ( pl. NaCl, 1 mólos végkoncentrációban).

70 Alkalmazás Fenil boronát affinitás kromatográfia - 1,2 és 1,3 cisz-diol csoportot tartalmazó cukrok kötődnek hozzá – borsav-komplexek Lúgos közegben stabil – savval, szorbittal megbontható

71 Fetuin elválasztása

72 Ni-NTA gyanta His tagged proteinek tisztítására


Letölteni ppt "Bioszeparációs technikák ELVÁLASZTÁSTECHNIKA Mikrobiológiai szakképzés Zsigrainé dr. Vasanits Anikó Zsigrainé dr. Vasanits Anikó."

Hasonló előadás


Google Hirdetések