Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás. A nukleinsav kimutatás etidiumbromid 3,8-diamino-5-etil-6-fenil-fenantrédiumbromid g =254-366 nm e =590 nm Br -

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás. A nukleinsav kimutatás etidiumbromid 3,8-diamino-5-etil-6-fenil-fenantrédiumbromid g =254-366 nm e =590 nm Br -"— Előadás másolata:

1 Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás

2 A nukleinsav kimutatás etidiumbromid 3,8-diamino-5-etil-6-fenil-fenantrédiumbromid g = nm e =590 nm Br - X= O: YOYO-1 X= S: TOTO-1

3 Rövidítések AGCTAGCT bázis cukorrész ACAC PP OH foszfodiészter kötés 3’ 5’ ACAC PP 3’ 5’ G P OH 3’ 5’ pApCpG [ACG]

4 Rövidítések AGCTAGCT bázis cukorrész ACAC PP OH foszfodiészter kötés 3’ 5’ ACAC PP 3’ 5’ G P OH 3’ 5’ pApCpG [ACG]

5 Szekvencia meghatározása 1. Fragmentálás restrikciós enzimekkel (W. Arber, H. Smith, D. Nathans) 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAGC 5’ EcoRI törzs E.coli 5’ GGCC 3’ 3’ CCGG 5’ Hae III Cél: feldarabolás Bam HIG/GATCCBacillus amyloliquefaciensH Bst IG/GATCCBacillus stearothermophilus1503-4R Eco RIG/AATTCEscherichia coli RY 13 Fok IGGATGN 9 / CCTACN 13 / Flavobacterium okeanokoites Hind IIGTPy/PuACHaemophilus influenzae R d Hind IA/AGCTTHaemophilus influenzae R d Hpa IIC/CGGHaemophilus parainfluenzae Msp IC/CGGMoraxella spezies Not IGC/GGCCGCNocardia otitidiscaviarum Sac IGAGC/TCStreptomyces achromogenes Sau 3A/GATCStaphyllococcus aureus 3A Sma ICCC/GGGSerratia marcecescens Sb Xma IC/CCGGGXanthomonas malvacearum Néhány II-es tipusú restrikciós enzim (>2000)

6

7 2a. Kémiai módosítás/hasítás (A. Maxam, W.Gilbert, 1977) Homogén „Single-stranded” DNS minta előállítása 1. lépés 5’ ATTGACTTAGCC 3’ 2. lépés Jelölés 5’-végen 32 P (*) (polinukleotid kináz) *ATTGACTTAGCC 12 mer 3. lépés Kémiai hasítás G reakció A reakció + G reakció T reakció + C reakció C reakció *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTA *ATT *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTA *ATTGACTT *ATTG *ATT *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTAGC *ATTGACTTAG *ATTGACT *ATTGAC *ATTGA *AT *A *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTAGC *ATTGACTTAG *ATTGA 4. lépés: elektroforézis 5. lépés: autoradiográfia 6. lépés: szekvencia leolvasás

8

9 Kémiai hasítás: Purinok G reakció + 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ + 5’ 3’ 7 OH - piperidin   OH - Dimetilszulfát

10 A > G: A reakció + 5’ 3’ Dimetilszulfát 0 o C, 0,1 M HCl 2 óra 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3 pH 7 90 o C OH -

11 Kémiai hasítás: Pirimidinek hidrazin + piperidin 2-dezoxiribozil-hidrazon 4-Me-3-pirazolon 3-amino-pirazol Urea timin citozin Hasítás a 3’ végen 3’ ’

12 A. C + T: T reakció 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ hidrazin piridin OH -

13 B. C reakció ’ 3’ 5’ OH - piridin hidrazin 1 M NaCl 5’ 3’

14 Példa: G hasítás után *ATTGAACTTAGCC *ATTGAACTTA AACTTAGCC AACTTA *ATT CC Elektroforézis Fragmens hossz + + Színezékkel festett (minden csik) Autoradiográfiás módszerrel jelzett gél („izotóp” csik)

15 Maxam-Gilbert módszer - kiértékelés

16 2b. Didezoxi beépítés-enzimes módszer (F. Sanger et al., 1977)

17 2b.1 Didezoxi nukleotid jelölése 32 Fluorofór (fluoreszcens jelölés, L. E. Hood, 1986) 32 P Radioaktív izotóp ( 32 P)

18 2b.2 A DNS-polimeráz müködésének blokkolása 3’ GAATTCGCTAATGC 5’ CTTAA szekvenálandó DNS primer DNS polimeráz I dATP, dTTP, dCTP, dGTP + didezoxi analóg (ddATP) 3’ GAATTCGCTAATGC 5’ CTTAAGCGATTA 3’ GAATTCGCTAATGC 5’ CTTAAGCGA + 4 edény 4 analóg

19 2b.3 Gélelektroforézis Leolvasás - komplement szál

20 5’ 3’ 5’ DNS polimeráz ddTTP ddCTP ddGTP ddATP ( 32 P) TCGATCGA DENATURÁLÁS ELEKTROFORÉZIS AUTORADIOGRÁFIA


Letölteni ppt "Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás. A nukleinsav kimutatás etidiumbromid 3,8-diamino-5-etil-6-fenil-fenantrédiumbromid g =254-366 nm e =590 nm Br -"

Hasonló előadás


Google Hirdetések