Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Előzmények Peptidkémia Protein kémia Analitikai kémia 1901 E.Fischer : Gly-Gly 1932 Bergman és Zervas : Benziloxi- karbonil csoport 1963B. Merrifield :

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Előzmények Peptidkémia Protein kémia Analitikai kémia 1901 E.Fischer : Gly-Gly 1932 Bergman és Zervas : Benziloxi- karbonil csoport 1963B. Merrifield :"— Előadás másolata:

1 Előzmények Peptidkémia Protein kémia Analitikai kémia 1901 E.Fischer : Gly-Gly 1932 Bergman és Zervas : Benziloxi- karbonil csoport 1963B. Merrifield : Szilárd fázisú peptid szintézis 1988Á. Furka : Kombinatorkus peptid szintézis 1923 F. Pregl : Mikroanalitika 1955F. Sanger : Az inzulin priemr szerkezete 1962 M.F. Perutz és J. C. Kendrew A myoglobin térszerkezete 1954 P. Edman : Protein szekvenálás 1952 Stein and Moore : Aminosav analizis NMR Kromatográfia Elektroforézis Tömeg spektroszkópia Röntgen (X-ray) krisztallográfia

2 Emil Fischer John B. Fenn A peptid kötés: amid kötés (E.Fischer, 1902) amid poliamid

3 N-terminális C-terminális Dipeptid: 2 Oligopeptid : 2-15 Polypeptid: >15 A peptid kötés: amid kötés (E.Fischer, 1902)

4 Kötéstípusok a fehérjékben Kovalens Amid Diszulfid - CO – NH - - S – S - Nem kovalens H-híd (inter és intra) Hidrofób, Van der Waals ionos

5 Fehérjék szerkezetének meghatározása 1.Tisztítás – homogén minta előállítása 2.Aminosavsorrend (primer szerkezet) meghatározása - aminosavösszetétel - aminosavsorrend - N-terminális aminosav - C-terminális aminosav 3. Térszerkezet (3D) meghatározása - szekunder (másodlagos) - tercier (szupermásodlagos) - quaterner

6 Fehérje izolálás – gélelektroforézis (egy- és kétdimenziós) Salmonella thyphimurium SDS-PAGE, 200  g protein, 3,5 x 0,8 cm Autoradigram, 2D, E. Coli proteinek, 10  g, 14 C jelzett aminosav a táptalajban, 2,3 x 1,3 cm, exp. 825 h

7 Gélelektroforézis

8 HeLa sejtmag fehérjék Swiss-Prot Egydimenziós gélelektroforézis

9 MwMw pI Kétdimenziós gélelektroforézis (HeLa sejtmag fehérjék)

10 Fehérjék kimutatása, mennyiségi meghatározása a) Amino csoport kimutatás b) Biuret próba Reagens: CuSO 4 /NaOH c) Lowry-Hartree Reagens: biuret + 3 H 2 OxP 2 O 5 x13 WO 2 x5 MoO 3 10 H 2 O, Folin-Ciocalteu-fenol d) BCA (bicinoninic acid, Reagens: biuret + BCA e) Bradford reagens (trifenil-metion) = 562 nm = 595 nm = nm = nm

11 Primer szerkezet meghatározása 1. Diszulfid-híd felbontása

12 2. Aminosav összetétel meghatározása NH 2 -CH 2 - C O NH-CH-COOH CH 3 H 2 O / 6M HCl 105 o C NH 2 -CH 2 - C O OH NH-CH-COOH CH 3 + Gly-Ala glicin alanin 2.1. Hidrolizis 2.2. Elválasztás és származék- képzés Ioncserés kromatográfia, Rockefeller Intézet, 1950 Gyanta: vízben nem oldódó polimer SO 3 - csoportokkal Detektálás: ninhidrin reakció, = 570 nm

13 2.3. Származékképzés és elválasztás Származékképzés: o-ftálaldehid Elválasztás:HPLC, Detektálás: g = 360 nm e = 455 nm Hunkapiller et al. Science, 1984

14 1-fluor-2,4-dinitrofenil- 5-L-Ala-amid (FDAA) (D,L) + pH 9,0; 10 perc D,L-származék L,L-származék HPLC elválasztás * * * * * * 2.4. Származékképzés D/L-aminosav meghatározására

15 + + HF NaHCO fluor-2,4-dinitro benzol 2,4-dinitrofenil aminosav =254 nm Sanger reakció, 1958, inzulin 3. Aminosav sorrend meghatározása 3.1. N-terminális + aminosavak 6 M HCl 2,4-dinitrofenil fehérje CHCO -NH 2 R NO 2 O 2 N NHCHCO - R NO 2 O 2 N NHCHCO - R

16 + bázis pH 7,5-8,0 +HCl  g =360 nm  e =480 nm (Dansyl-aminosav) NH 2 -L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L- COOH dimetilamino-naftalin-5-szulfonil kloridl (Dansyl-klorid, Hartley, 1963) S O O N CH 3 CH 3 NH -L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L- COOH S O O N CH 3 CH 3 NH -Leu- COOH + K, A, D, P, N, R, F, G- COOH 6 M HCl hidrolizis

17 + sav, 90 o C óra NH 2 -L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L- COOH 3.2. C-terminális H 2 N - NH 2 + NH 3 -L – CO - NH-NH 2, + NH 3 - K- CO - NH-NH NH 3 -L- COO Edman lebontás (P. Edman, Lund, 1950) 1.lépés: Reakció fenilizotiocianáttal (addició) 2.lépés: Hidrolizis 3.lépés: A feniltiohidantoin származék azonosítása

18 N = C = S NH 2 - CH – CO R pH 8-9, 40 o C NH - C - S II NH - CH – CO R + 1.lépés: Reakció fenilizotiocianáttal 2. lépés: Hidrolizis (H + /TFA) feniltiocarbamil származék anilinotiozolinon származék fenilhidantoin (PTH) aminosav

19 3. lépés: A feniltiohidantoin származék azonosítása

20 4. Fehérjék feldarabolása Kémiai hasítás Reakció brómciánnal (BrCN), Met - NH 2 -CH-COOH (CH 2 ) 2 OH + H 2 O, H + homoszerin

21 4. 2. Enzimatikus hasítás Reakció hidroxilaminnal (NH 2 - OH) Asp - Gly Reakció 2-nitro-5-tiociano - benzoesav - Cys N = C = S O2NO2N HOOC Terminológia (Schechter, Berger) -S4 – S3 – S2 – S1 – S1’ – S2’ - S3’ – S4’ – enzim - P4 –P3 – P2 – P1 – P1’ – P2’ - P3’ – P4’ – szubsztrát - P4 –P3 – P2 – P1 – OH + H- P1’ – P2’ - P3’ – P4’ – Szerin proteázok: tripszin (Arg, Lys) P1, trombin, kimotripszin (Tyr, Trp, Phe) P1, elasztáz, kallikrein.. Cisztein proteáz: papain, actinidin... Karboxil proteáz: pepszin, katepszin D (lizoszoma), LysC (Lys) P1, GluC (Glu, Asp)... Aminoproteáz: AspN (Asp)P Metalloproteáz: temolizin, karboxipeptidáz A...

22 Primer szerkezet, aminosavsorrend - összegzés

23 Térszerkezet

24 Szerkezeti hierarchia

25 Az amid kötés Delokalizáció, 2 e, 3 atom - Gyenge N bázis - Erős H-híd - Részleges kettős kötés - Síkalkat - Cisz/transz izoméria Nomenklatúra

26 A Ramachandran térkép - bevezetés

27 A Ramachandran térkép

28 Másodlagos szerkezet típusai

29 Helikális szerkezet 3 10 – hélix, alfa-hélix, pi-hélix

30 Béta redőzőtt réteg szerkezet

31 Kanyar szerkezet

32 A Ramachandran térkép - összefoglalás

33

34 Konformerek energiatartalma Források : kötéshossz (Ed) – változatlan vegyértékszög (Eo) – változatlan torziós szög (E  ) - változik Nem kötött atomok távolsága (Ew) Kötő elektronpárok kölcsönhatása (Eh) Elektrosztatikus kölcsönhatás (Er)  E =  Ed +  Eo +  E  +  Ew +  Eh +  Ee Példa: Fehérje 100 aminosavból a)ha: 10 konformáció/as lehetséges akkor: konformer b) ha: 2 konformáció/as lehetséges akkor: konformer

35 Szupermásodlagos szerkezetek Csoportosítás Alfa (  )csak alfa hélix Béta (  )csak béta réteg Alfa + béta (  ) hélix és réteg egymástól távol Alfa/béta (  )hélix és réteg egymással kölcsönhatásban Görög kulcs Béta kigyó

36 Negyedleges szerkezet - a kollagén

37 1. Fehérje-expresszió Fehérje expresszió Lizis Sejtlizátum - nukleinsavak - fehérjék - lipidek - szénhidrátok Elválasztás - elekroforézis - kromatográfia - UC Primer szerkezet - aminosavsorrend Lokalizáció Funkció(k) - Ca 2+ kötés - Zn finger - ATP kötés Asszociáció betegséggel Szerkezetvizsgálat - kémiai, enzimatikus lebontás - MS - bioinformatika Eredet (taxonomia) Annotáció Térszerkezet Primer szerkezet - alegységek - poszt-transzlációs modosulások Rokonság más fehérjével Izolált fehérje A protemika alapjai

38 A médium összetételének hatása az E-coli fehérjeösszetételére Arg - Arg Farrell PHO (1978 )

39 Fehérje bioszintézise

40 Nem fehérje alkotó természetes aminosavak NH 2 CHCOOH CH 2 CH 2 HOOC NH 2 CH 2 CH 2 CH 2 N + CH 2 CH CH 2 CH 3 CH 3 CH 3 OH CHC CH 3 CH 3 CH 2 OH OH CONHCH 2 CH 2 COOH A)A) Glu - CO 2 Glu dekarboxiláz  -aminovajsav (GABA) Karnitin Zsiranyagcsere Mitokondrium transzport Sejtpermeabilitás Lys/Met + C-vitamin (máj) Állat EmberNövény + - B) b-Alanin a b Pantoténsav

41 C) NH 2 CHCOOH CH 2 SH NH 2 CH (CH 2 ) 3 NHCNH 2 NH NH 2 CHCOOH (CH 2 ) 3 NH 2 NH 2 CNH 2 O NH 2 CHCOOH (CH 2 ) 3 NHCNH 2 O 1. – CO 2 2. oxidáció Állat Ember Növény + - cisztein taurin NH 2 CH 2 CH 2 SO 3 H epesav alkotórész neurotranszmitter vérlemezkemigrén? (máj, B6) D) + argináz +H 2 O arginin ornitin karbamid (urea) +NH 3, + CO 2 citrulin (citrullus lat görögdinye) urea ciklus (máj) hagyma, fokhagyma detoxifikáció

42 NHCH 2 COOH CH 3 NCH 2 CH 3 NH 2 C NH E) szarkozin (izom) H 2 N-CN kreatin. H 2 O (N-metil-guanidino-ecetsav) op: 303 o C izom H 2 PO 4 -NH - (kreatin-foszfát)


Letölteni ppt "Előzmények Peptidkémia Protein kémia Analitikai kémia 1901 E.Fischer : Gly-Gly 1932 Bergman és Zervas : Benziloxi- karbonil csoport 1963B. Merrifield :"

Hasonló előadás


Google Hirdetések