Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

ELISA ELISA plate (lemez) E nzyme L inked I mmune S orbent A ssay lyuk avagy kút Különböző lemezek – speciális felület kezelés ellenanyag, peptid kötésre.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "ELISA ELISA plate (lemez) E nzyme L inked I mmune S orbent A ssay lyuk avagy kút Különböző lemezek – speciális felület kezelés ellenanyag, peptid kötésre."— Előadás másolata:

1 ELISA ELISA plate (lemez) E nzyme L inked I mmune S orbent A ssay lyuk avagy kút Különböző lemezek – speciális felület kezelés ellenanyag, peptid kötésre

2 enzyme linked immune sorbent ellenanyaghoz konjugált enzim enzim felülethez kötött antigének/ellenanyagok

3 Az ELISA vizsgálatban az antigén mennyiségével arányos mértékű az enzimaktivitás Az enzimaktivitás mértékére a színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén- ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunológiai módszer

4 Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Direkt módszer Indirekt módszer Antigén Primer ellenanyag Jelzés Szekunder ellenanyagok egyszerűség több jel  nagyobb érzékenység

5 Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Enzim-antienzim rendszer (leginkább immunhisztokémiában lehet találkozni vele) PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz Antigén Primer ellenanyag Szekunder ellenanyagok A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyagok Enzimek

6 Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni Egyszerű ABC Antigén Biotinált ellenanyag Avidin Avidin-enzim komplexek Biotin-enzim komplex avidin biotin enzimcomplexek (arányok!!! mint a precipitációnál)

7 Példák a direkt, indirekt és kompetitív ELISA módszerekre

8 egyszerű indirekt ELISA lépései Antigén specifikus ellenanyag, vagy az antigén egyszerű kimutatása az antigén kitapasztása (coating avagy fedés) (az enyhén lúgos puffer segíti a kitapadást) felesleges antigén kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges fehérjék kimosása specifikus ellenanyagok hozzáadása Enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása felesleges ellenanyagok kimosása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása

9 kombinált szendvics ELISA Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek) kimutatása szendvics technikával A nem kötődött anyagok kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges fehérjék kimosása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása felesleges ellenanyagok kimosása avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása antigén specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása antigént tartalmazó folyadék hozzáadása felesleges konjugátum kimosása

10 kompetitív ELISA Érzékenysége miatt szolúbilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a korábban a szilárd fázishoz tapasztott antigénhez. - Antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás - Szolubilis antigént tartalmazóvagy nem tartalmazó minta hozzáadása -Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés - Mosás - Kromogén anyagok hozzáadása

11 ELISA alaptípusok (összefoglalás) egyszerű capture/szendvics antigén Ag specifikus ellenanyag detektor/reporter ellenanyag kompetitív pl. antigén specifikus ellenanyagok kimutatásához antigén Ag specifikus capture ellenanyag Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag antigének kimutatásához az oldatban jelen van a kimutatandó Ag Ag specifikus ellenanyag antigének kimutatásához, ha csak egyféle specifikus ellenanyagunk van, vagy kis mennyiségű antigén kimutatásához antigén nincs jelen oldott Ag

12 Aspecifikus kitapadásból eredő hiba A fehérjék aspecifikus kitapadása csökkenthető: telítéssel/fedéssel/blokkolással detergens alkalmazásával ELISA Az antigén mellett a plasztik felületre kitapadhatnak maguk az ellenanyagok is - akár közvetlenül - akár indirekten a színreakció ugyan az

13 -BSA -Nyúl anti-BSA ellenanyag -biotinnalal konjugált anti-nyúl ellenanyag Indirekt ELISA (az anti-BSA kimutatása) (HRPO – torma peroxidáz (Horseradish Peroxidase)) Gyakorlati feladat: Így lesznek kikészítve a plate-ek -kromogén anyag (OPD+H 2 O 2 ) Hozzá lehet fogni a gyakorlathoz, és az inkubálási idők alatt folytatni a vetítést. -avidinnal konjugált HRPO

14 Vírusfertőzések diagnosztikája Mivel szabad vírus antigének és vírus részecskék nem minden esetben detektálhatóak kellő hatékonysággal (pl. látencia, vagy az immunválsz miatt), ezért helyette inkább a fertőzött szervezetben a vírus ellen képződött ellenanyagokat próbálják meg kimutatni a diagnosztika során. vírus antigénnel fedett ELISA lemezek készen kaphatóak a fertőzött személy szérumában található vírus specifikus ellenanyagok hozzákötnek az antigénhez emberi Ig specifikus jelölt ellenanyagok jelzik a specifikus ellenanyagok jelenlétét ilyen elven működik: Epstein-Barr Virus (EBV) teszt kit → EBNA-1 (EBV nukleáris antigén) segítségével mutatják ki az ellene termelt IgG-t HIV diagnosztikai kitben → rekombináns HIV antigénnel anti-HIV antitestek kimutatása vérből, plazmából, szérumból, vagy akár beszáradt vérfoltból Toxoplazmózis (Toxoplazma gondii – egysejtű parazita) → Toxoplazma elleni IgM kimutatás léteznek gyors egylépéses lateral flow immunkromatográfiás tesztek is ELISA alapú módszerek:

15 A pozitív HIV tesztet megerősítő vizsgálati módszerek: Western-blot: HIV-1 fertőzött CEM sejtvonal antigénjeinek Western-blotja. Az antigéneket tartalmazó blot-membránt a vizsgálandó szérummal inkubálják. A fertőzött személy szérumában található anti-HIV ellenanyag specifikus sávot (sávokat) eredményez a bloton. Legalább két burokfehérjét, vagy egy burokfehérjét és a p24 antigént kimutató sáv jelenléte esetén tekintik pozitívnak. Immunfluoreszcens vizsgálat: A teszt immortalizált, a felszínén HIV-1 antigéneket expresszáló T sejt vonalat használ. A sejteket tárgylemezre fixálják, és a vizsgálandó szérummal inkubálják, majd humán Ig specifikus fluoreszcensen jelölt másodlagos ellenanyagokkal jelölik. Negatív kontrollként nem fertőzött sejtvonalat használnak. A festődés mértékét és mintázatát összevetve a kontrollal erősítik meg a fertőzöttséget.

16 Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában, immunofluoreszcencia segítségével (indirekt jelölés) Autoimmunitás A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is hasonló módszerekkel detektálják, vagy….

17 Tumordiagnosztika A tumor specifikus(TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak Tumor antigén (a beteg széruma) Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor Ag specifikus capture ellenanyaggal fedett felület (a kit része) Prosztata daganatok Prostate-Specific Antigen (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hipertrófiás és prosztatitiszes páciensekben. A PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával. Hasonlóan használható fel a human prostatic acid phosphatase (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

18 Szérum ellenanyag izotípusok meghatározása A szervezetben jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok utalnak az antigén jelenlétére (lásd pl. vírusfertőzések diagnosztikájánál) Az így kimutaott ellenanyagok izotípusa utalhat arra, hogy friss, perzisztáló fetőzésről (IgM ellenanyag dominancia), vagy korábbi fertőzést követő memória válasz eredményéről van-e szó (IgG ellenanyag dominancia). Anti izotípus specifikus ellenanyagokkal ez eldönthető Antigén IgM IgG αIgM αIgG Memória válasz Megemelkedett szérum IgE szintet tapasztalni atópiás allergiák esetén, bizonyos autoimmun betegségekben, és egyes parazita fertőzések esetében Egyes immundeficienciákan az ellenanyag alosztályok koncentrációja eltér a normálistól (hiper IgM szindróma) ellenanyag capture-ellenanyag a szérum ellenanyaga izotípus specifikus ellenanyag

19 Bioaktív anyagok kimutatása hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek doppingvizsgálatok: EPO, szteroid származékok kimutatása szendvics technikával, vagy kompetíciós tesztekkel

20 Mindenki látott már ehhez hasonló diagnosztikai eszközöket, vagy ha nem, - találkozni fog velük későbbi pályafutása során: pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumbú, vagy vizeletbű (terhességi teszt) Ezek az eszközök is az ELISA esetében már megismert elsődleges antigén-ellenanyag specifikus kapcsolódását kihasználó technikán alapulnak! Diagnosztikai gyorstesztek:

21 különböző elnevezéseivel találkozni: lateral flow immunoassay v. immunkromatográfia v. flow-through membrane technology hCG kimutatása immunkromatográfiás tesztcsíkkal nitrocellulóz membrán jelölt ellenanyagokkal átitatott üvegfilter (A jelzés szabad szemmel is látható!) elölnézet oldalnézet hCG capture ellenanyag sáv kontroll ellenanyag sáv abszorbciós rész (cellulóz, papír) abszorbciós lap, mintafelviteli rész vizeletminta

22 hCG capture ellenanyag sáv kontroll ellenanyag sáv jelölt ellenanyagok hCG kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok

23 hCG sáv ( kikötött hCG) kontroll ellenanyag sáv a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG Ugyanez kompetitív rendszerben

24 Az ellenanyagon található jelzés szabad szemmel is megfigyelhető, így nincs szükség enzimes folyamatokra, és egyéb reagensekre pl.: kolloidális arany („surface plasmon rezonancia színek”) festékkel töltött latex gyöngyök kompetitív immunkromatográfiás tesztcsíkok aflatoxin detektálására Az eljárás szemikvantitatívá tehető International Journal of Food Microbiology 99 (2005) 185– 194

25 ELISPOT Enzyme Linked Immuno-Spot Elve hasonlít az ELISA-hoz Eredetileg az ellenanyagot szekretáló B-sejtek számának meghatározására szolgált. Ma alkalmas egyéb szolúbilis effektor molekulák, pl. citokinek, kemokinek, granzim termelő sejtek számának meghatározására is. Egyaránt alkalmas poliklonális aktivátorok vagy antigén indukálta aktivációt követően az aktivált effektor sejtek számának meghatározására. Érzékenység: kb. 1 per sejt Sejtkultúra felhasználásával aszeptikus körülmények között végezzük.

26 ELISPOT - a capture ellenanyagok kitapasztása - blokkolás - a sejtek hozzáadása - biotinnal konjugált másodlagos ellenanyag hozzáadása (például) - avidin-enzim konjugátum - oldhatatlan kromogén szubsztrát hozzáadása (AEC 3-amino-9-etilkarbazol ) (aktiválás, inkubáció) - mosás A citokin termlő sejt helyét mutató folt Az ELISPOT lemez egy lukának felülnézete a képződött foltokkal A mérés menete

27 Leolvasása mikroszkóppal (lassú, manuális munka) vagy “ELISPOT plate reader” segítségével (gyors + standardizálható spot szám és méret meghatározás)

28 A spotok száma az ellenanyag vagy citokin termelő sejtek számát mutatja A spotok mérete arányos az ellenanyag vagy citokin termelő képességgel A spotok által elfoglalt terület mindkét paramétert egyesíti, a számítógépes szoftver mindkettőt figyelembe veszi

29 Western blot Fehérjekeverékek egyes (pl. sejt lizátumok) komponenseinek ellenanyag segítségével történő specifikus kimutatására alkalmas. Azok tulajdonságai (pl. foszforilációs állapota) is vizsgálható vele. Az aktiválás utáni különböző időpontokban „befagyasztható” a sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így vizsgálhatóak pl. a sejtaktiváció foszforilációs eseményei Az aktiválás utáni különböző időpontokban „befagyasztható” a sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így vizsgálhatóak pl. a sejtaktiváció foszforilációs eseményei sok, legalább 10 6 sejt szükséges a vizsgálathoz

30 A fehérjék SDS-PAGE-enelektroforetikus mobilitásuk alapján „méret” szerint szétválaszthatók (dot-blot vagy slot-blot esetén nincs szétválasztás) A hozzávatőleges méretet ismert méretű standard fehérje keverék egyidejű futtatásával meghatározhatjuk. Specifikus ellenanyaggal mutatható ki a keresett fehérje sávja a többi sáv között, (vagy anti-foszfotirozin elleanyaggal a foszforilált fehérjék sávja) A kezelhetőség érdekében a szétválasztott fehérje sávokat nitrocellulóz membránra viszik át + - Anode - Cathode +

31 pl. aktivált T sejtek foszfotirozin és Zap-70 blotja aktiválatlanConAPHA A membrán az anti P-Y ellenanyagok elúciója után anti ZAP-70 ellenanyagokkal is megjelölhető, így azonosítható a ZAP-70 foszforilációs állapota a sejtekben Y P-Y P-Y P-Y blot

32 Fab Fc Epitope a protein felszínén Primary antibody Secondary antibody torma peroxidaz Kitapasztott Fehérje (AG) Membrán H2O2H2O2 H2OH2O luminol erősítő h Detektor Enhanced chemiluminescence (ECL) Felerősített kemilumineszcencia módszer H 2 O 2 jelenlétében a luminol a peroxidaz enzim által katalizált oxidációs folyamat során gerjesztődik, majd emittál egy fotont, és visszakerül az alapállapotba Ez a foton detektálható filmen vagy kameraval. a fényemisszió felerősíthető fenolgyűrűs vegyületek jelenlétében (6-hydroxybenzothiazole) (enhancer) luminol

33 Immunhisztokémia / Immunfluoreszcencia Szöveti vagy sejthez kötött komponenseket mutathatunk ki specifikus AG- EA reakció alapján. (a fixált szövetmetszet szilárd fázisnak felel meg.) Fixálás: A minta átjárható legyen és az Ag determinánsok ne károsodjanak (paraformaldehid, glutáraldehid) – (szövetmintától függő) Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban Immunfluoreszcencia fluoreszcensen jelzett ellenanyag – fluoreszcens mikroszkóp FITC – fluoreszcein izotiocianát PE – fikoeritrin Immunoenzim módszer enzimmel konjugált ellenanyag P – peroxidáz PA – alkalikus foszfatáz (a szubsztátból oldhatatlan, színes csapadékot képeznek) Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC) Aktin mikrofilamentek kimutatása

34 Szövetminta FIXÁLÁS Festés előtti metszet FAGYASZTÁS METSZÉS IMMUNHISZTOKÉMIA

35 Immunhisztokémia ABC Technika Secunder antitest Avidin Szövetmetszet Sejtek (sejttenyészetek) Tárgylemez Primer antitest Biotin Enzim X

36 (nem immun)Hisztokémia Acute bronchopneumonia (hematoxilin- eozin festés)

37 Immunhisztokémia (CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)

38 Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC) Aktin mikrofilamentek kimutatása

39 Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt. A mitokondriumok kimutatásához egér IgG-t (anti–OxPhos Komplex V) és Alexa Fluor 555 festékkel konjugált kecske anti-egér IgG-t használtak. Az F-actin jelölése Alexa Fluor 488 festékkel konjugált phalloidinnel (gombatoxin) történt, a sejtmagot TO-PRO-3 jodiddal festették meg.

40 Peroxiszómák kimutatása fixált és permeabilizált endothel sejtben (pulmonáris artéria). A peroxiszómák detektálásához peroxiszómális membrán protein 70 elleni monoklonális egér ellenanyagot és Alexa Fluor 488 festékkel jelölt kecske anti-egér IgG-t használtak. A mitokondriumokat MitoTracker Red festékkel jelölték meg a fixálás előtt; a sejtmag kimutatása DAPI festékkel történt.

41 Citokinekre érzékeny (citokin szenzitív), vagy csak citokinek jelenlétében túlélni/osztódni képes (citokin dependens) sejtvonalak segítségével a jelenlevő citokinek nagy érzékenységgel kimutathatók. Bioassay pl. Wehi 164 sejtek pl. CTLL2 sejtek van IL-2nincs IL-2 van TNFnincs TNF

42 Bizonytalanná teheti a kapott eredményt, hogy a sejtek nem biztos, hogy csak az adott citokinre reagálnak. Pl. a CTLL2 sejtvonalra az IL4 hasonló hatást fejt ki, mint az IL2. A sejtek túlélését kolorimetriás eljárással (MTT assay) vagy az osztódásuk kimutatásával (lásd később) mérhetjük meg. citokinkoncentráció IL-2 TNF CTLL2 Wehi 164 MTT assay:

43 „Nagy szélességű” v. „nagy áteresztőképességű” (brute-force v. high throughput) citokin vizsgálatok

44 Cytokine array A Western-blot blotolási lépését követő részére hasonlít ( - ) IFN  ( + ) IL-2IL-4… … MIP3β… különféle kikötött specifikus ellenanyagok Vizsgálandó citokin tartalmú oldat „Lumineszcens elleanyag” keverék Sokféle citokin gyors meghatározására alkalmas Hátrány – a blot memrán nagy felülete miatt viszonylag nagy térfogatú/hígított mintára van szükség

45 CD40L és CD40L+SLAM kombinációval aktivált moDC citokintermelése Réthi és mtsi. 2006

46 Cytometric bead array (CBA) A cyitokine array-hez hasonló alapelvű, áramlási citometriás módszer A citokineket itt nem a pozíciójuk, hanem különböző színintenzitású gyöngyök azonosítják CBA cytokine array IL-2 IL-4 IL-8 … … IL-12IL-23IL-17……

47 Szendvics ELISACBA Cytometric bead array (CBA)

48 Cytometric Bead Array A citokinek mennyiségére egy eltérő színnel jelölt ellenanyag fényintenzitásából következtethetünk IL-2 IL-4 … … Standard citokinek a koncentráció meghatározásához citokin capture gyöngy citokin reporter ellenanyag kis térfogatokkal is működik, de műszerigényes

49 IL-8 IL-1β IL-6 IL-12IL-10 TNFα Citokin mennyiség Citokin standard


Letölteni ppt "ELISA ELISA plate (lemez) E nzyme L inked I mmune S orbent A ssay lyuk avagy kút Különböző lemezek – speciális felület kezelés ellenanyag, peptid kötésre."

Hasonló előadás


Google Hirdetések