Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Ligand kináz aktiváció foszforiláció adaptorok toborzása A RECEPTOR KERESZTKÖTÉSE JELÁTVITELI MECHANIZMUSOKAT INDÍT BEJEL Gén átírás Transzkripciós faktorok.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Ligand kináz aktiváció foszforiláció adaptorok toborzása A RECEPTOR KERESZTKÖTÉSE JELÁTVITELI MECHANIZMUSOKAT INDÍT BEJEL Gén átírás Transzkripciós faktorok."— Előadás másolata:

1 ligand kináz aktiváció foszforiláció adaptorok toborzása A RECEPTOR KERESZTKÖTÉSE JELÁTVITELI MECHANIZMUSOKAT INDÍT BEJEL Gén átírás Transzkripciós faktorok aktiválása

2 a a antigen binding mIg molecule HH LL V V V V   Ig-  /Ig-  heterodimer THE IgM B-CELL RECEPTOR Signal transduction Lyn Kinases Syk Btk SHP-1 Phosphatases SLP-65/BLNK PLC HS1 Vav Adaptors + substrates

3 Ig-  /CD79a Ig-  /CD79b ITAM: Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif   Y Y Y Y ITAM ITAM Ig domén + CHO A B-SEJT RECEPTOR FELÉPÍTÉSE ITAM: YxxL x7 YxxI

4 Ag B-SEJT RECEPTOR SZIGNÁLÚTVONAL = ITAM 1. kereztkötés Lyn 2. Src-family kináz activáció 4. SLP foszforiláció + Ca felszabadulás SLP P Kalcium felszabadulás P P P P és ITAM foszforiláció 3. Syk toborzás és aktiváció Syk Syk PP

5 A LIMFOCITA AKTIVÁCIÓ KINETIKÁJA ANTIGEN SIGNAL1. Ko-receptor Adhéziós molekulák Citokinek 2. jel Nyugvó limfocita G 0 PTK aktiváció RNS szintézis szabad Ca++ Fehérje szintézis fehérje foszforiláció DNS szintézis Limfoblaszt 0 10sec 1min 5min 1hr 6 hrs 12 hrs 24 hrs Nyugvó limfocita G 0 proliferáció DNS szintézis Effektor sejt Memóris sejt Transzport Membrán változások RNS és fehérje szintézis Nyugvó limfocita G 0

6 AZ ELLENANYAG SOKFÉLESÉG GENETIKAI HÁTTERE

7 AZ ELLENANYAGOK SZERKEZETE KOMPLEMENT AKTIVÁCIÓ SEJTHEZ KÖTŐDÉS LEBOMLÁS TRANSZPORT Könnyű lánc (L) Nehéz lánc (H) VL CL VH CH

8 AZ ELLENANYAG SOKFÉLESÉG GENETIKAI HÁTTERE VL VH A sokféleség kialakulásának mechanizmusa? Más szabályok a variábilis és konstans régiók kialakulására? Szimmetrikus molekula  két azonos VH és VL  mindkét kromoszóma ugyanazt a szekvenciát kódolja? S – S

9 Mieloma multiplex Plazmasejt tumorok – tumorsejtek a csontvelőben Monoklonális eredetű emberi immunoglobulinok a szérumban (50-100mg/ml) Rodney Porter és Gerald Edelman 1959 – 1960 fehérje tisztítás AZ IMMUNOGLOBULINOK JELLEGZETES AMINOSAV SZERKEZETE 50 kDa Nehéz lánc 25 kDa Könnyű lánc Gél elektroforézis V ariábilis C onstans Redukció L H

10 A könnyű lánc egyes részei variábilisak, mások konzerváltabbak: Hipervariábilis és framework régiók

11 Sok GÉN ( – ) V2V2V2V2C V3V3V3V3C V1V1V1V1C 1 GÉN magas szomatikus mutációs ráta a V régióban VC GénGénGénGén Protein 1 GÉN = 1 FEHÉRJE A MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI DOGMÁJA AZ IMMUNOGLOBULIN SZEKVENCIA JELLEGZETESSÉGE ELMÉLETEK

12 AZ IMMUNOGLOBULINOK MOLEKULÁRIS GENETIKÁJA Az egyetlen C régiót kódoló gén a csíravonalban el van választva a V régió génektől A V génekből többféle áll rendelkezésre Feltételezhető egy mechanizmus, amely a V és C géneket fúzionálja egy teljes immunoglobulin génné Dreyer & Bennett feltételezése (1965) Egy adott izotípusú ellenanyag valószínűleg: Hogyan magyarázható az ellenanyagok kettős funkciója? A feltételezés ellentétben állt az akkor elfogadott nézettel, amennyiben a DNS (genetikai állomány) egy adott egyed minden sejtjében azonos

13 A Dreyer - Bennett hipotézis igazolása V V V V V V V V V V V V V A B-sejtekben a V és C géneket valamilyen mechanizmus egy teljes immunoglobulin génné fúzionálja C V C A csíravonalban egyetlen C gén van (L-lánc), amely a sok V géntől távol helyezkedik Módszer a sok V gén létezésének és a V – C gén átrendeződés igazolására

14 Módszer Megközelítés: Specifikus cDNS próbák a különböző V régiók és a C régiók elkülönítéséhez DNS restrikciós enzimek a DNS fragmentáláshoz A csíravonalnak (pl. méhlepény) és az érett B-sejteknek (pl. plazmocitóma/mielóma) a DNS-ei eltérőek C V V V V V V V V V Csíravonal DNS C V V V V V Átrendezett DNS

15 Méhlepény B-sejt 1.5. Kb B-sejt V C 6.0 Kb V C 4.0 Kb DNS-kivonás Restrikciós enzim hasítás Gél elektroforézis Hibridizáció VCKb6,0 1,5 V-próba 4,0 C V C-próba Susumi Tonegawa kísérlete 1975

16 The actual Tonegawa experiment 1. DNS BamHI emésztés 2. Elektroforézis 3. Gélszeletek készítése (MW Szerint) 4. DNS extrakció 5. Hibridizáció 125I-jelölt Kappa lánc RNS-sel 6. RNAse kezelés. (DNS-RNS hibrid RNAse rezisztens 7. Precipitáció (DNS-RNS hibrid igen a nem kötődött próba nem) 8. Radioaktivitás mérése

17 Sok variábilis gén van, de csak egy konstans gén VCVVV CSÍRAVONAL A V és C gének csak a B-sejtekben kerülnek egymás mellé C V VV B-SEJT KÖVETKEZTETÉSFehérje GénGénGénGén GÉN SZEGMENSEK SZOMATIKUS ÁTRENDEZŐDÉSE EGY GÉNNÉ

18 Az Ig gének szekvenálása tovább bonyolította a képet A csíravonal VL gének szerkezete hasonló volt a V  és and V könnyű láncok esetében A csíravonal és az átrendezett DNS nem volt azonos Honnan származik a 13 extra aminosav? CLCL VLVL ~ 95as~ 100as L CLCL VLVL ~ 95as~ 100as JLJL Az aminosavak egy része a kis számú J (Joining) régiókból származik L CLCL VLVL ~ 208as L

19 Az Ig H lánc további sokféleséggel jellemezhető VLVL JLJL CLCL L CHCH VHVH JHJH DHDH L A nehéz lánc a JH és CH gének közötti szakaszon további (0 – 8) aminosavat tartalmaz Ezek a D (DIVERSITY) régióból származnak A könnyű lánc kialakulásához 1 rekombinációs folyamatra van szükség : V L to J L A nehéz lánc kialakulásához 2 rekombinációs folyamatra van szükség J H to D H, V H to J H D H

20 AZ IMMUNOGLOBULIN GÉN SZEGMENSEK SZÁMA Variábilis (V) Diverzitás (D)0027 Kapcsoló (J)546 Gén szegmensKönnyű láncNehéz lánc kappalambda 2 kromoszóma kappa könnyű lánc gén szegmensek 22 kromoszóma lambda könnyű lánc gén szegmensek 14 kromoszóma nehéz lánc gén szegmensek AZ IMMUNOGLOBULIN POLIPEPTID LÁNCOKAT TÖBB GÉN SZEGMENS KÓDOLJA AZ IMMUNOGLOBULIN GÉN SZEGMENSEK ELRENDEZŐDÉSE

21 B-limfocita fejlődés során JkJκJκJκJκJκJκVκVκVκVκVκVκ B-sejt1 JκJκVκVκ B-sejt2 40 Vκ 5 Jκ5 Jκ5 Jκ5 Jκ VκVκVκVκVκVκVκVκ JκJκ JκJκ JκJκ JκJκ Csíravonal A KAPPA (κ) LÁNC GÉN SZEGMENSEK SZOMATIKUS ÁTRENDEZŐDÉSE DNS

22 pA CCκCCκ E JJ VκJκVκJκ VκVκVκVκ P Primer RNS átirat CCκCCκ E JJVκVκ CCκCCκ JVκVκFehérje mRNA CCκCCκ JVκVκ AAAA Transzláció A K-LÁNC KIFEJEZŐDÉSE

23 JH A B sejt fejlődés során VHJH 65 VH 6 JH VH JH 27 D DDD JH D DVH JH DDVH A VH GÉN SZEGMENSEK SZOMATIKUS ÁTRENDEZŐDÉSE D

24 VH D JH VLJL V-Domének C-Domének VH-D-JH VL-JL AZ ANTIGÉN RECEPTOROK SOKFÉLESÉGE

25 D – J rekombináció V – DJ rekombináció VDJ –  δ transzkripció  δ transzláció Pót könnyű lánc V – J rekombináció VJ –  (vagy VJ - ) transzkripció  vagy transzláció B-sejt mIgD mIgM AZ IMMUNOGLOBULIN GÉN SZEGMENSEK ÁTRENDEZŐDÉSÉNEK SORRENDJE

26 A kombinációs sokféleség becslése A funkcionális V, D és J gének száma: 65 VH x 27 DH x 6JH = 10, 530 kombináció 40 V  x 5 J  = 200 kombináció 30 V  x 4 J = 120 kombináció = 320 különböző könnyű lánc Amennyiben a H és L láncok véletlenszerűen párosodnak mint H 2 L 2 19,440 x 265 = 3,369,600 lehetőség Csak a KOMBINÁCIÓS sokféleség A valóságban bizonyos H + L kombinációk nem fordulnak elő, mert instabilak Bizonyos V és J gének gyakrabban fejeződnek ki, mint mások A KAPCSOLÁSI sokféleség tovább növeli a szekvenciák számát A POTENCIÁLIS B-SEJT KÉSZLET KIALAKULÁSA

27 1.A gén szegmensek kombinációja nagy számú, eltérő variábilis régióval rendelkező nehéz (H) és könnyű (L) láncot eredményez, amelyek egy adott egyedben a különböző B-sejt klónokban fejeződnek ki 2.Az egyik kromoszómán létrejött sikeres gén átrendeződés gátolja a gén átrendeződést a másik kromoszómán ALLÉL KIZÁRÁS 3. Egy B-sejt csak egy típusú nehéz (H) és egy típusú könnyű (L) láncot termel ELKÖTELEZŐDIK EGY TÍPUSÚ ANTIGÉN KÖTŐHELY LÉTREHOZÁSÁRA 4. A teljes B sejt készlet különbözőképpen átrendezett immunoglobulin gének termékeit kifejező egyedi B-sejtekből áll A SZOMATIKUS GÉN ÁTRENDEZŐDÉS EREDMÉNYE

28 Szomatikus génátrendeződés –A variábilis domének kialakulása a VJ (L-lánc) és a VDJ (H-lánc) gének rekombinációjával Hogyan képes a B sejt csak egyfajta könnyű és egyfajta nehéz láncot kifejezni? –Annak ellenére, hogy minden B sejtben egy apai és egy anyai Ig lókusz is jelen van –A gének nagy része ko-dominánsan kifejeződik –Hogyan történik a B sejtekben az egyik allél aktiválása és a másik gátlása? ALLÉL KIZÁRÁS A sikeres génátrendeződés gátolja a rekombinációt a másik kromoszómán Csak egyféle H- és L-lánc szintetizálódik A sejtfelszínre 2 H- és 2 L-láncból álló dimerek kerülnek ki AZ ANTIGÉN JELENLÉTÉTŐL FÜGGETLEN FOLYAMATOK A B-SEJT ÉRÉS SORÁN A CSONTVELŐBEN MENNEK VÉGBE A B-SEJT ANTIGÉN FELISMERŐ RECEPTOR ÉS AZ ELLENANYAGOK SOKFÉLESÉGÉT MEGHATÁROZÓ GENETIKAI MECHANIZMUSOK

29 How does somatic gene rearrangement (recombination) work? 1.How is an infinite diversity of specificity generated from finite amounts of DNA? Combinatorial diversity 2.How do V region find J regions and why don’t they join to C regions? rule -Special - Recobnitation Signal Sequences (RSS) - Recognized by Recombination Activation Gene coded proteins (RAGs) PALINDROMIC SEQUENCES HEPTAMERCACAGTGCACAGTGGTGACAC NONAMERACAAAAACCGGTTTTTGT TGTTTTTGGCCAAAAACA

30 Somatic recombination to generate antibody diversity

31 Súlyos kombinált immundrficiencia Severe combined immunodeficiency syndrome (SCID). Korai manifesztáció Erős hasmenés Vörös foltok a testen Opportunista fertőzések (Candida albicans, Pneumocystis carnii pneumonia) Nyirokcsompk nem tapinthatók Omen syndrome RAG deficiency

32 V, D, J flanking sequences V Sequencing upstream and downstream of V, D and J elements revealed conserved sequences of 7, 23, 9 and 12 nucleotides in an arrangement that depended upon the locus VV JJ J D VHVH JHJH 7 9

33 Recombination signal sequences (RSS) RULE – A gene segment flanked by a 23mer RSS can only be linked to a segment flanked by a 12mer RSS VHVH D JHJH HEPTAMER - Always contiguous with coding sequence NONAMER - Separated from the heptamer by a 12 or 23 nucleotide spacer VHVH D JHJH 

34 23-mer = two turns 12-mer = one turn A szabály molekuláris háttere Intervening DNA of any length 23 V DJ7 9

35 23-mer 12-mer Loop of intervening DNA is excised Heptamers and nonamers align back-to-back The shape generated by the RSS’s acts as a target for recombinases V1 V2 V3V4 V8 V7 V6 V5 V9 DJ V1 DJ V2 V3 V4 V8 V7 V6 V5 V9 An appropriate shape can not be formed if two 23-mer flanked elements attempted to join (i.e. the rule) Molecular explanation of the rule

36 23-mer 12-mer V1 DJ V2 V3 V4 V8 V7 V6 V5 V CONSEQUENCES OF RECOMBINATION Generation of P-nucleotides

37 23-mer 12-mer Loop of intervening DNA is excised V1 DJ V2 V3 V4 V8 V7 V6 V5 V Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Generation of N-nucleotides

38 A TdT enzim a CD3 régióba illeszt extra-nuklleotid szekvenciákat

39 Az IgD and IgM típusú B-sejt receptor egyidejű expresszióját alternatív splicing és polyadeniláció teszi lehetővé

40 How does somatic gene rearrangement (recombination) work? 1.How is an infinite diversity of specificity generated from finite amounts of DNA? Combinatorial diversity 2.How do V region find J regions and why don’t they join to C regions? rule 3.How does the DNA break and rejoin? Imprecisely, with the random removal and addition of nucleotides to generate sequence diversity Junctional diversity (P- and N- nucleotides, see above)

41 AZ IMMUNOGLOBULIN SZINTÉZIS FOLYAMATA ER Golgi mRNS Riboszóma Leader szekvencia Membrán Ig Szekretált Ig A H és L láncok külön riboszómákon szintetizálódnak

42 A B-sejtek fejlődésé a csontvelőben

43 A B-sejt fejlődés során két ponton történik a génátrendeződés Minőségének ellenőrzése

44 The pre B-cell receptor monitors the quality of heavy chain rearrangement Mutation in λ5– arrest at Pro-B cell stage SEVERE IMMUNODEFICIENCY Productive µ-chain rearrangement ---assembles pre-BCR Switches off RAG genes, enzymes No further µ-chain rearrangement ALLELIC EXCLUSION Only one specificity

45 A génátrendetődés sorrendje, kinetikája a B-sejt fejlődés során

46 Perifériás A B sejt fejlődés szakaszai Őssejt - HSCKorai pro-B sejtKésői pro-B sejt Kis pre-B sejtÉretlen B sejtérett B sejt Az egyes érési fázisokat sejtfelszíni markerek megjelenése (vagy eltűnése) jellemzi Csíravonal D H to J H V H to D H J H VHDHJHVHDHJH Nagy pre-B sejt Pre-receptor Y Receptor H+L

47 Az autoreaktív receptorral rendelkező B-sejtek a csontvelőben maradnak A B-sejtek begatív szelekciója

48 A self-reaktív klónokban újra aktiválódik a RAG enzim és a könnyű lánc átrendeződése folytatódik (receptor editing) addig amíg megszűnik a self reaktivitás

49 Az oldható saját antigénnel reagáló B sejtek (monovalens kötés a sejtfelszíni IgM-hez) funkcionálisan inaktív állapotot (anergiát ) indukál. Ezek az éretleb anergiás sejtek a periférián hamar elpusztulnak IgM monovalens kötés


Letölteni ppt "Ligand kináz aktiváció foszforiláció adaptorok toborzása A RECEPTOR KERESZTKÖTÉSE JELÁTVITELI MECHANIZMUSOKAT INDÍT BEJEL Gén átírás Transzkripciós faktorok."

Hasonló előadás


Google Hirdetések