Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (2.) Az elsődleges antigén-ellenanyg kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek (ELISA) MHC tipizálás.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (2.) Az elsődleges antigén-ellenanyg kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek (ELISA) MHC tipizálás."— Előadás másolata:

1 Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (2.) Az elsődleges antigén-ellenanyg kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek (ELISA) MHC tipizálás Hiperszenzitivitási reakciók (a diasorhoz tartoznak a FIG4(T-APC).MPG (998KB) és a pro5.exe (4414KB) animációkat tartalmazó fájlok)

2 Az immunoesszék érzékenysége

3 A T- és B-limfociták funkcionális aktivitásának mérése 1.A T- és B-sejtek poliklonális aktivációja a TCR vagy a BCR nem antigén-specifikus aktivációjával lektinek által indukált aktiváció α-IgM, α-CD3 vagy α-TCR ellenanyaggal, allogén T-sejt aktiváció (korai aktiváció: intracelluláris események vizsgálata) 2. Az aktivációt követő T- és B-sejt válasz jellemzése aktivációs markerek proliferatív válasz 3 H-timidin beépülés CFSE fluoreszcencia feleződés sejtciklus vizsgálata Ellenanyag és/vagy citokin termelés (ELISA, CBA) 3. Az aktivált T- és B-sejtek számának meghatározása az antigén hatás után ELISPOT Intracelluláris citokin festés Pentamer (vagy tetramer) technika Témák:

4 A humorális immunválasz szakaszai antigén felismerés aktiváció, proliferáció, differenciáció Nyugvó IgM +, IgD + érett B-sejt Antigén Aktivált B-sejt Segítő T-sejt, más stimulus Klonális expanzió B-sejt Nagy affinitású Ig-t expresszáló B-sejt Nagy affinitású IgG Memória B-sejt Affinitás érés Izotípus váltás Antitest termelés IgG-t expresszáló

5 A T-sejt válasz szakaszai Antigén felismerés Klonális expanzió Differenciáció Effektor funkciók Naív CD8 + T-sejt Naív CD4 + T-sejt Citokinek (pl. IL-2) Citokinek (pl. IL-2) Nyirokszervek Perifériás szövetek CD4 + Effektor T-sejt CD8 + Effektor T-sejt (CTL) CD4 + Memória T-sejt Aktiváció CD8 + Memória T-sejt Makrofágok, B-sejtek, más sejtek aktivációja Fertőzött target sejtek ölése, makrofág aktiváció

6 B-sejt receptor komplex általi jelátvitel Membrán Ig keresztkötése antigénnel Tirozin foszforiláció Biokémiai intermedierek Aktív enzimek Transzkripciós faktorok PLC  aktiváció Emelkedett ic Ca 2+ Ca 2+ dependens enzimek Diacilglicerol GTP/GDP csere a Ras-on, Rac-on

7 T-sejt receptor komplex általi jelátvitel Az áttekintett folyamatok többsége lépéseiben vizsgálható TCR mediált jelek indítása Biokémiai intermedierek Késői jelátvitel enzimei Transzkripciós faktorok kalcineurin MAP kinázok Diacilglicerol GTP/GDP csere a Ras-on PLC  1 aktiváció Adapter fehérjék T sejt Emelkedett ic Ca 2+

8 Poliklonális T-/B-sejt aktivációt kiváltó anyagokkal, és módszerekkel végezhető el a sejtek funkcionális vizsgálata. Az immundeficienciák nagy része különböző funkcionális vizsgálatokkal mutathatók ki. Az antigénnel való aktiválás technikailag nehezen lenne kivitelezhető, mert az antigén-specifikus T- és B-sejtek gyakorisága kicsi.

9 A limfociták poliklonális aktivációja LPS, lektinek, PMA+Ionomycin jelenlétében B-sejt (egér) T-sejt BCR vagy TCR-specifikus ellenanyagok is a megfelelő sejtek poliklonális aktivációját okozzák LPS a TLR4-en keresztül aktiválja a sejteket A lektinek (pl. Con A, PHA) szénhidrát kötő fehérjék. A sejtfelszíni glikozilált receptorok keresztkötésével aktiválják a sejteket. Az Ionomycin a külső Ca 2+ ionok beengedésével aktiválja a sejteket, szinergizálva a protein kináz C-hez kötődő PMA-val TLR4

10 Poliklonális B-sejt aktivátorok és hatásaik AktivátorT-sejt függésIg szekréció Humán B-sejt PWM (pokeweed mitogen) nincsvan SpA (szuperantigén, staphylococcus protein A) nincsvan EBV (transzformáló hatású is) van Anti-Igvancitokinek jelenlétében Egér B-sejt LPSnincsvan PWMvan PPD (purified protein derivate, mikobakteriumból) nincsvan Anti-Ignincscitokinek jelenlétében Poliklonális T-sejt aktivátorok Phytohaemagglutinin (PHA)lektinCanavalia ensiformis Concanavalin A (ConA)lektinPhaseolus vulgaris anti-CD3monoklonális ellenanyag

11 Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array ic Ca 2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis Citokin szekréció - IC citometria - ELISA, ELISPOT - Bioassay Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) Sejtciklusba lépés/apoptózis - DNS tartalom - IN antigének Sejtosztódás - 3 H-timidin, CFSE, MTT A limfociták aktivációjának főbb folyamatai, és azok vizsgálata Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén- ellenanyag kapcsolódáson alapul - FRET

12 A jelenlevő vagy termelt „antigének” (fehérjék, citokinek, ellenanyagok, ….) vizsgálata

13 ELISA ELISA plate (lemez) E nzyme L inked I mmune S orbent A ssay lyuk avagy kút Különböző lemezek – speciális felület kezelés ellenanyag, peptid kötésre

14 enzyme linkedimmune sorbent ellenanyaghoz konjugált enzim enzim felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok

15 Az ELISA vizsgálatban az antigén mennyiségével arányos mértékű az enzimaktivitás Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay

16 Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai (szempontok: hatékonyság, érzékenység, kényelem, megbízhatóság, ár) Direkt módszer Indirekt módszer Felület Antigén Primer ellenanyag Jelzés Szekunder ellenanyagok egyszerűség több jel  nagyobb érzékenység

17 Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Enzim-antienzim rendszer (leginkább mikroszkópos immunhisztokémiában lehet találkozni vele) PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz Antigén Primer ellenanyag Szekunder ellenanyagok A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyagok Enzimek

18 Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni Egyszerű ABC Antigén Biotinált ellenanyag Avidin Avidin-enzim komplexek Biotin-enzim komplex Avidin Biotin enzimComplexek (arányok!!! mint a precipitációnál) Jel felerősítése

19 A különféle direkt-indirekt, biotin-avidin rendszereket összekombinálva is használják. Lásd a következő példákat. Az ELISA rendszerek nem csak a vizsgált anyag jelenlétének a kimutatására, hanem ismert koncentrációjú sztenderdek segítségével a pontos mennyiség meghatározására is alkalmasak

20 Bioaktív anyagok kimutatása hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása szendvics technikával vagy kompetíciós tesztekkel Tumor antigének kimutatása Citokinek, hormonok kimutatása

21 kombinált „szendvics” ELISA Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. szérum, liquor, szennyvíz). A nem kötődő anyagok kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges fehérjék kimosása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása felesleges ellenanyagok kimosása avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása citokintartalmú minta hozzáadása felesleges konjugátum kimosása

22 Tumordiagnosztika A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak Tumor antigén (pl. a beteg szérumából) Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor Ag specifikus csapda ellenanyaggal fedett felület (a kit része) Prosztata daganatok prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hipertrófiás és prosztatitiszes páciensekben. A PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával. Hasonlóan használható fel a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

23 Hólyagrák: Az epiteliális sejtek NMP22 nukleáris mátrix proteinje egészséges emberekben csak kis mennyiségben található meg a vizeletben → megemelkedése diagnosztikus marker Pajzsmirigy daganatok: A szérum tiroglobulin (hTG) megemelkedett szintje diagnosztikus marker Alpha Fetoprotein (AFP) : 68kD-os protein, amit az embrionális máj és szikzacskó termel. Megjelenhet az anya szérumában is (transzplacentális transzfer). Születés utáni egy év alatt alacsony szérumszintre csökken le (<9ng/ml). Magasabb koncentrációja hepatómával, ovariális-, tesztikuláris- és preszakrális teratokarcinómákkal, de egyéb daganatokkal is összefüggésben lehet. Carcinoembryonic Antigen (CEA) sejtadhézióban vesz részt. Normális esetben csak az embrionális fejlődés során van jelen. Colorectális és egyéb carcinomát hordozó egyénekben megemelkedik a szérumszintje. Változásának nyomon követésével következtetni lehet a terápia hatékonyságára. Her-2/neu protein: 185 kD-os transzmembrán glikoprotein, tirozin kináz receptor. Az emlődaganatok %-ban a tumorsejtek megemelkedett mértékben expresszálják. Immunterápia során a működése blokkolható specifikus ellenanyaggal (Herceptin), ezért jelenlétét immunhisztokémiával, vagy immunfluoreszcenciás eljárással mutatják ki biopsziás mintákban.

24 egyszerű indirekt ELISA lépései Antigén specifikus ellenanyag kimutatásához az antigén kitapasztása (coating avagy fedés) felesleges antigén kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges fehérjék kimosása specifikus ellenanyagok hozzáadása Enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása felesleges ellenanyagok kimosása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával - rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid segítségével HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid

25 Fertőzések diagnosztikája Mivel szabad vírus antigének és vírus részecskék nem minden esetben detektálhatóak kellő hatékonysággal (pl. látencia miatt), ezért helyette inkább a szervezetben képződött vírus specifikus ellenanyagokat mutatják ki a fertőzés diagnosztizálásakor. vírus antigénnel fedett ELISA lemezek készen kaphatóak a fertőzött személy szérumában található vírus specifikus ellenanyagok hozzákötnek az antigénhez emberi Ig specifikus jelölt ellenanyagok jelzik a specifikus ellenanyagok jelenlétét ilyen elven működik: Epstein-Barr Virus (EBV) teszt kit → EBNA-1 (EBV nukleáris antigén) segítségével mutatják ki az ellene termelt IgG-t HIV diagnosztikai kitben → rekombináns HIV antigénnel anti-HIV antitestek kimutatása vérből, plazmából, szérumból vagy akár beszáradt vérfoltból Toxoplazmózis (Toxoplazma gondii – egysejtű parazita) → Toxoplazma elleni IgM kimutatás A toxoplazmózis terhesség során veszélyes akkor, ha az anya elsődleges fertőzésben szenved. Ekkor IgM típusú ellenanyagok termelődnek a fertőzés hatására, melyek transzplacentálisan nem szállítódnak és ezzel nem nyújtanak védelmet a magzat számára.

26 Autoimmunitás A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is hasonló módszerekkel detektálják Pl. SLE (szisztémás lupus erythematosus): Immunkomplex betegség, melyben számos autoantigén ellen kimutathatóak autoantitestek. A leggyakoribb anitest a kettős szálú DNS elleni antitest (az SLE-ben szenvedő betegek 60%-ában kimutatható). I típusú (autoimmun) diabetesz diagnosztikája a sziget sejt antigének elleni autoantitestek kimutatásával ELISA vizsgálat segítségével: glutaminsav dekarboxiláz (GAD65): a prediabetikus személyek 70-90% - ban és a diabetikus betegekben specifikus ellenanyagot találni ellene IA-2 (tirosine foszfatáz-szerű protein): az I típusú diabeteszes betegek % -ban és közvetlenül a betegség megjelenése előtti állapotban specifikus ellenanyagot találni. Ilyen ellenanyagok megtalálhatóak egyes GAD ellenanyag negatív személyekben is, ezért független diabetesz markernek tekinthető. inzulin: a legfőképp de nem kizárólagosan autoimmun diabeteszes fiatal gyermekekben (<5 éves) találni ellenanyagot, (megemlítendő, hogy ezek az ellenanyagok nem megkülönböztethetőek azoktól, melyek az inzulin terápia során a szervezetben termelődnek)

27 Szérum ellenanyag izotípusok meghatározása A szervezetben jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok utalnak az antigén jelenlétére (lásd pl. vírusfertőzések diagnosztikájánál). Az így kimutatott ellenanyagok izotípusa utalhat arra, hogy friss, perzisztáló fetőzésről (IgM ellenanyag dominancia), vagy korábbi fertőzést követő memória válasz eredményéről van-e szó (IgG ellenanyag dominancia). Anti-izotípus specifikus ellenanyagokkal ez eldönthető. Antigén IgM IgG anti-IgM anti-IgG Memória válasz Megemelkedett szérum IgE szintet tapasztalni atópia esetén, bizonyos autoimmun betegségekben, és egyes parazita fertőzések esetében Egyes immundeficienciákban az ellenanyag alosztályok koncentrációja eltér a normálistól (hiper IgM szindróma) ellenanyag capture-ellenanyag a szérum ellenanyaga izotípus specifikus ellenanyag

28 kompetitív ELISA Érzékenysége miatt szolubilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez. - A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás - Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása -Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés - Mosás - Kromogén anyagok hozzáadása Gyakran használják kis méretű antigének, vagy haptének esetében. Ha kevés az antigénen a hozzáférhető epitop, a szendvics ELIZÁban lefoglalja ezeket az első „capture” ellenanyag. A színreakció itt fordított: több oldott antigén = halványabb szín

29 ELISA alaptípusok (összefoglalás) egyszerű capture/szendvics antigén Ag specifikus ellenanyag detektor/reporter ellenanyag kompetitív pl. antigén specifikus ellenanyagok kimutatásához antigén Ag specifikus capture ellenanyag Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag antigének kimutatásához az oldatban jelen van a kimutatandó Ag Ag specifikus ellenanyag kis mennyiségű, kis méretű antigén kimutatásához (elég ha ha csak egyféle specifikus ellenanyaggal rendelkezünk) antigén nincs jelen oldott Ag

30 Aspecifikus kitapadásból eredő hiba A fehérjék aspecifikus kitapadása csökkenthető: telítéssel/blokkolással detergens alkalmazásával ELISA hibák Az antigén mellett a plasztik felületre kitapadhatnak maguk az ellenanyagok is - akár közvetlenül - akár indirekten a színreakció ugyan az hook effect! – nagy koncentráció vagy kevés mosás miatt

31 Hook effect - fals negatív vagy fals alacsony eredmény ELISA hibák Nagyon magas antigén koncentráció esetén, a jelenlévő szolubilis antigén kompetitálhat a felszínhez kikötöttel. Gyakori lehet nem megfelelően beállított egylépéses imminoasayeknél, vagy nem hatékony/nem elégséges mosási lépések esetén Megfelelően beállított szendvics ELISA A túl magas antigén koncentráció, vagy nem megfelelő mosási lépések miatt, a jelenlevő szolubilis antigénhez kötődnek a jelzett ellenanyagok, ami fals negatív vagy a valósnál alacsonyabb eredményt ad

32 Elkészült ELISA lemezek

33 pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből (terhességi teszt) Ezek az eszközök is az ELISA esetében már megismert elsődleges antigén-ellenanyag specifikus kapcsolódását kihasználó technikán alapulnak! Diagnosztikai gyorstesztek:

34 hCG kimutatása immunkromatográfiás tesztcsíkkal nitrocellulóz membrán jelölt ellenanyagokkal átitatott üvegfilter (A jelzés szabad szemmel is látható!) elölnézet oldalnézet hCG csapda ellenanyag sáv kontroll ellenanyag sáv abszorbciós rész (cellulóz, papír) abszorbciós lap, mintafelviteli rész vizeletminta

35 hCG csapda ellenanyag sáv kontroll ellenanyag sáv jelölt ellenanyagok hCG kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok Elvben a szendvics ELISÁra hasonlít

36 hCG sáv ( kikötött hCG) kontroll ellenanyag sáv a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG Ugyanez kompetitív rendszerben A kompetitív ELISA elve hasonló

37 Az ellenanyagon található jelzés szabad szemmel is megfigyelhető, így nincs szükség enzimes folyamatokra, és egyéb reagensekre: kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek) festékkel töltött latex gyöngyök Pl.: kompetitív immunkromatográfiás tesztcsíkok aflatoxin detektálására Az eljárás szemikvantitatívá tehető Immunkromatográfiás tesztcsík egyéb felhasználási lehetőségei: élelmiszervizsgálat során toxinok kimutatása

38 ELISPOT Enzyme Linked Immuno-Spot Elve hasonlít az ELISA-hoz Eredetileg az ellenanyagot szekretáló B-sejtek számának meghatározására szolgált. Ma alkalmas egyéb szolubilis effektor molekulák, pl. citokinek, kemokinek, granzim termelő sejtek számának meghatározására is. Egyaránt alkalmas poliklonális aktivátorok vagy antigén indukálta aktivációt követően az aktivált effektor sejtek számának meghatározására. Érzékenység: kb. 1 per sejt Az első lépéseit sejtkultúrában aszeptikus körülmények között végzik.

39 ELISPOT - a capture ellenanyagok kitapasztása - blokkolás - a sejtek hozzáadása - biotinnal konjugált másodlagos ellenanyag hozzáadása (például) - avidin-enzim konjugátum - oldhatatlan kromogén szubsztrát hozzáadása (AEC 3-amino-9-etilkarbazol ) (aktiválás, inkubáció) - mosás A citokin termlő sejt helyét mutató folt Az ELISPOT lemez egy lukának felülnézete a képződött foltokkal A mérés menete

40 Leolvasása mikroszkóppal (lassú, manuális munka) vagy “ELISPOT plate reader” segítségével (gyors + standardizálható spot szám és méret meghatározás)

41 A spotok száma az ellenanyag vagy citokin termelő sejtek számát mutatja Egy spot mérete arányos a sejt által termelt ellenanyag vagy citokin mennyiségével A spotok által elfoglalt összterület mindkét paramétert egyesíti, a számítógépes szoftver mindkettőt figyelembe veszi

42 Western blot Fehérjekeverékek egyes (pl. sejt lizátumok) komponenseinek ellenanyag segítségével történő specifikus kimutatására alkalmas. Azok tulajdonságai (pl. foszforilációs állapota) is vizsgálható vele. Az aktiválás utáni különböző időpontokban „befagyasztható” a sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így vizsgálhatóak pl. a sejtaktiváció foszforilációs eseményei Az aktiválás utáni különböző időpontokban „befagyasztható” a sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így vizsgálhatóak pl. a sejtaktiváció foszforilációs eseményei sok, legalább 10 6 sejt szükséges a vizsgálathoz

43 A fehérjék SDS-PAGE-enelektroforetikus mobilitásuk alapján „méret” szerint szétválaszthatók (dot-blot vagy slot-blot esetén nincs szétválasztás) A hozzávatőleges méretet ismert méretű standard fehérje keverék egyidejű futtatásával meghatározhatjuk. Specifikus ellenanyaggal mutatható ki a keresett fehérje sávja a többi sáv között, (vagy anti-foszfotirozin elleanyaggal a foszforilált fehérjék sávja) A kezelhetőség érdekében a szétválasztott fehérje sávokat membránra viszik át (PVDF, nirocellulóz)

44 Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik: enzimmel konjugált ellenanyag indirekt módszer (primer és szekunder ellenanyagok) Standard Protein minta SDS-PAGE Membrán Western blot Fehérje detektálás specifikus ellenanyag- epitóp kölcsönhatás alapján Western Blot

45 pl. aktivált T sejtek foszfotirozin és Zap-70 blotja aktiválatlanConAPHA A membrán az anti P-Y ellenanyagok elúciója után anti ZAP-70 ellenanyagokkal is megjelölhető, így azonosítható a ZAP-70 foszforilációs állapota a sejtekben Y P-Y P-Y P-Y blot

46 A pozitív HIV tesztet megerősítő WB vizsgálati módszerek: Western-blot: HIV-1 fertőzött CEM sejtvonal (T-sejt vonal) antigénjeinek Western-blotja. Az antigéneket tartalmazó blot-membránt a vizsgálandó szérummal inkubálják. A fertőzött személy szérumában található anti-HIV ellenanyag specifikus sávot (sávokat) eredményez a bloton. Legalább két burokfehérjét, vagy egy burokfehérjét és a p24 antigént kimutató sáv jelenléte esetén tekintik pozitívnak.

47 Fab Fc Epitóp a protein felszínén Primer ellenanyag Szekunder ellenanyag Torma- peroxidáz Immobilizált proteinek Membrán H2O2H2O2 H2OH2O luminol enhancer h Detektálás Megnövelt kemilumineszcencia /Enhanced chemiluminescence (ECL)/ H 2 O 2 jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidálja a diacilhidrazidokat (pl luminol) Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával detektálható A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák (pl 6-hidroxi-benzothiazol) jelenlétében körülbelül szeresére növelhető (enhancer) luminol

48 „Nagy szélességű” v. „nagy áteresztőképességű” (high throughput) citokin vizsgálatok (1. ) (proteomika)

49 Cytokine array A Western-blot blotolási lépését követő részére hasonlít ( - ) IFN  ( + ) IL-2IL-4… … MIP3β… különféle kikötött specifikus ellenanyagok Vizsgálandó citokin tartalmú oldat Jelzett ellenanyagok keveréke Sokféle citokin gyors meghatározására alkalmas Hátrány – a blot memrán nagy felülete miatt viszonylag nagy térfogatú/hígított mintára van szükség

50 CD40L és CD40L+SLAM kombinációval aktivált moDC citokin termelése Réthi és mtsi. 2006

51 Immunhisztokémia / Immunfluoreszcencia Szöveti vagy sejthez kötött komponenseket mutathatunk ki specifikus AG- EA reakció alapján. (a fixált szövetmetszet szilárd fázisnak felel meg.) Fixálás: A minta átjárható legyen és az Ag determinánsok ne károsodjanak paraformaldehid, glutáraldehid – kémiai keresztkötések alkoholok – vízelvonó szer (szövettípustól és az antigéntől függően) Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban Immunfluoreszcencia fluoreszcensen jelzett ellenanyag – fluoreszcens mikroszkóp FITC – fluoreszcein izotiocianát PE – fikoeritrin, stb. Immunoenzim módszer enzimmel konjugált ellenanyag P – peroxidáz PA – alkalikus foszfatáz (a szubsztátból oldhatatlan, színes csapadékot képeznek) Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC) Aktin mikrofilamentek kimutatása

52 Szövetminta FIXÁLÁS Festés előtti metszet FAGYASZTÁS METSZÉS IMMUNHISZTOKÉMIA „FESTÉS” - rácseppentett reagensekkel

53 Immunhisztokémia ABC Technika (lásd a korábbi diát is) Secunder antitest Avidin Szövetmetszet Sejtek (sejttenyészetek) Tárgylemez Primer antitest Biotin Enzim X

54 normál hisztokémia (nem immun) Acute bronchopneumonia (hematoxilin- eozin festés)

55 Immunhisztokémia (CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)

56 Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC) Aktin mikrofilamentek kimutatása

57 Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt. A mitokondriumok kimutatásához egér IgG-t (anti–OxPhos Komplex V) és Alexa Fluor 555 festékkel konjugált kecske anti-egér IgG-t használtak. Az F-actin jelölése Alexa Fluor 488 festékkel konjugált phalloidinnel (gombatoxin) történt, a sejtmagot TO-PRO-3 jodiddal festették meg.

58 A pozitív HIV tesztet megerősítő vizsgálati módszerek: Western-blot (lásd a korábbi dián) HIV-1 fertőzött CEM sejtvonal (T-sejt vonal) antigénjeinek Western-blotja. Az antigéneket tartalmazó blot-membránt a vizsgálandó szérummal inkubálják. A fertőzött személy szérumában található anti-HIV ellenanyag specifikus sávot (sávokat) eredményez a bloton. Legalább két burokfehérjét, vagy egy burokfehérjét és a p24 antigént kimutató sáv jelenléte esetén tekintik pozitívnak. Immunfluoreszcens vizsgálat: A teszt immortalizált, HIV-1 antigéneket expresszáló T sejt vonalat használ. A sejteket tárgylemezre fixálják, és a vizsgálandó szérummal inkubálják, majd humán Ig specifikus fluoreszcensen jelölt másodlagos ellenanyagokkal jelölik. Negatív kontrollként nem fertőzött sejtvonalat használnak. A festődés mértékét és mintázatát összevetve a kontrollal erősítik meg a fertőzöttséget.

59 Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában, immunofluoreszcencia segítségével (indirekt festés) Autoimmunitás immunfluoreszcens diagnosztikája A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is ki lehet mutatni

60 A termelődött citokinek intracelluláris kimutatása immunfluorimetriával jelzéssel ellátott citokin-specifikus ellenanyag - a sejtmembránt detergenssel átjárhatóvá kell tenni - de előtte a sejteket fixálni kell, hogy ne essenek szét a detergenstől (pl. aldehides fixáció) citokinek - előzőleg a sejtek valamilyen, a sejttípusra jellemző antigént felismerő ellenanyaggal is megjelölhetők („sejttípus marker” pl. CD4)

61 Eredmény: Megtudható az is belőle, hogy milyen sejttípusok termelték a citokineket! Érzékenysége elérheti a Western blot-ét (hűtött CCD kamerás mikroszkóppal– akár egyetlen sejt is elegendő lehet a vizsgálathoz)

62 Citokinekre érzékeny (citokin szenzitív), vagy csak citokinek jelenlétében túlélni/osztódni képes (citokin dependens) sejtvonalak segítségével a jelenlevő citokinek nagy érzékenységgel kimutathatók. Bioassay pl. Wehi 164 sejtek pl. CTLL2 sejtek van IL-2nincs IL-2 van TNFnincs TNF

63 Bizonytalanná teheti a kapott eredményt, hogy a sejtek nem biztos, hogy csak az adott citokinre reagálnak. Pl. a CTLL2 sejtvonalra az IL4 hasonló hatást fejt ki, mint az IL2. A sejtek túlélését kolorimetriás eljárással (pl. MTT assay) vagy az osztódásuk kimutatásával (lásd később) mérhetjük meg. citokinkoncentráció IL-2 TNF CTLL2 Wehi 164 MTT assay:

64

65 „Nagy szélességű” v. „nagy áteresztőképességű” (brute-force v. high throughput) citokin vizsgálatok (2.) (áramlási citométerrel) (proteomika) Az eljárás kis térfogatokkal (5-20  l) is működik, de műszerigényes.

66 Cytometric/multiplex bead array (CBA) A cyitokine array-hez hasonló alapelvű áramlási citometriás módszer. A citokineket itt nem a pozíciójuk, hanem különböző színintenzitású gyöngyök azonosítják CBA cytokine array IL-2 IL-4 IL-8 … … IL-12IL-23IL-17……

67 A CBA elve és összehasonlítása a hagyományos ELISAval Szendvics ELISACBA Cytometric/multiplex bead array (CBA) IL-2 capture ellenanyagok IL-2 IL-4 IFN  IL-2 „reporter” ellenanyag

68 IL-8 IL-1β IL-6 IL-12IL-10 TNFα Citokin mennyiség Citokin standard hígítási sorozat 500pg/ml250pg/ml125pg/ml62pg/ml31pg/ml16pg/ml8pg/ml 0 A citokinek mennyiségére az eltérő színnel jelölt „reporter” ellenanyag fényintenzitásából következtethetünk

69 Az intracelluláris (citoplazmatikus) Ca 2+ szint meghatározása A citoplazmatikus Ca 2+ koncentráció növekedése pl. fluoreszcens indikátor festékekkel vizsgálható. /Fluo-3 vagy az Indo-1/ példa – intracelluláris Ca 2+ jel egy sejtben kimutatva: antigén prezentáló B sejt T sejtet aktivál (klikk a képre) B sejt T sejt (klikk a képre)

70 módszer: RT-PCR, QRT-PCR A génaktiváció vizsgálata A sejtaktiváció az aktiválódó génekről átíródó mRNS segítségével is kimutatható pl. citokin gének aktivációja sejtek  RNS izolálás RNS  (reverz transzkriptáz)  cDNS cDNS  (PCR)  hossz és mennyiség meghatározás RT-PCR: agaróz gél (pl. denzitometria) QRT-PCR: fluoreszcens módszer (TaqMan probe (FRET) v. interkaláló fluorokróm  SYBR green)

71 Sejtciklus DNS mennyiség meghatározása (fluoreszcens DNS interkalátorok, 3 H-timidin) - transzkripció kimutatása (RT-PCR) - fehérjék kimutatása (Immunoassay) sejtszám változás meghatározása (CFSE) a sejtciklusba lépő sejtek mérete megnövekszik = blasztos transzformáció

72 G2G2G2G2 M G0G0G0G0 G1G1G1G1 s G0G0G0G0 G1G1G1G1 s G2G2G2G2M DNS analízis (pl.aneuploidia diagnosztikájához) DNS mennyiség sejtszám 2N 4N A sejtciklus vizsgálható a DNS mennyiség alapján, pl. a DNS-be sztöhiometrikus módon interkalálódó fluoreszcens festékekkel (propidium jodid, PI) Egy sejtpopuláció sejtjeinek eloszlása DNS mennyiség alapján (áramlási citometriás ábra)

73 A B-/T-sejt proliferáció mérésére alkalmas módszerek 3 H-jelölt timidin-beépülés a totál DNS-beépülést méri. Nem méri, hogy hány sejt hányszor osztódott (β-bomlás mérése). A timidin-analóg bromodeoxyuridin (BrdU) alkalmazható kísérleti állatokban és sejtkultúrákban is. Az osztódó sejtek BrdU-specifikus ellenanyag felhasználásával kimutathatók (mikroszkópia, FACS). Újabban a karboxifluoreszcein diacetát szukcinimidil észter, CFSE használata terjedt el.

74 A sejtosztódás meghatározása A „Cell tracer” festékek bediffundálnak a sejtbe, és sokáig megőrződnek. Az apoláros CFSE kovalensen kötődik az intracelluláris fehérjékhez. Amikor az intracelluláris festék a két utódsejtbe szétosztódik, a fluoreszcencia intenzitás felére csökken. sejtosztódások :

75 T-sejtek funkcionális vizsgálata Antigén specifikus T-sejtek azonosítása immunizálás Hasznos lehet pl. immunizálás eredményességének vizsgálatakor antigén specifikus T-sejt Ha a T-sejt receptorok specificitása meghatározható, akkor a felszaporodott antigén specifikus T-sejtek kimutathatóak. T-sejt klónok ugyanolyan T-sejt receptorral

76 De az MHC kötődése a T-sejt receptorhoz kis affinitású egy MHC molekula és T-sejt receptor kölcsönhatása nem elég erős Megjelölt MHC-peptid komplex felhasználható a rá specifikus T-sejt receptor kimutatására MHC T-sejt receptorok T-sejt

77 Pentamer (vagy tetramer) technika a létrejövő pentamer self assembling coiled-coil-domain MHC peptid fluoreszcens jelzés a pentamer egyik alegysége Multimerizált MHC-peptid komplex aviditása már kellően erős lehet.

78 peptid-specifikus T-sejt MHC pentamer Az MHC pentamer kötődése a T-sejthez Az MHC-peptid oligomer reakciója a specifikus T-sejt receptorokkal nagy aviditású. T-sejt receptorok Ide kattints az animációhoz MHC multimerek segítségével meghatározható az antigén-specifikus T-sejtek száma, értékelhető pl. a vakcinák, vagy egy adott terápiás eljárás hatékonysága.

79 MHC Dextramerek

80 CMV-specifikus T-sejtek normál HLA-A2 donorban EBV BZLF-1 (RAKFKQLL/ HLA-B*0801)-specifikus T-sejtek (a normál populáció 90-95%-a hordozó) Influenza epitóp (GILGFVFTL/ HLA-A0201)-specifikus T-sejtek egészséges donorban MHC multimer jelöléses példák A perzisztáló (pl. herpeszvírusok) vagy visszatérő fertőzések miatt a specifikus T-sejtek száma viszonylag magas lehet

81 allélszekvencia Tumor (asszociált) epitop peptid eredete A*0201GVLVGVALICarcinogenic Embryonic Antigen (CEA) A*0201LLGRNSFEVp A*0201LLLLTVLTVMUC A*0201RLLQETELVHER-2/neu A*0201RMFPNAPYLWilm's Tumour (WT1) A*0201SLLMWITQVNY-ESO A*0201STAPPVHNVMUC A*0201VISNDVCAQVProstate Specific Antigen-1 (PSA-1) A*0201VLQELNVTVLeukocyte Proteinase-3 (Wegener's autoantigen) A*0201VLYRYGSFSVgp100 (pmel17) A*0201YLEPGPVTAgp100 (pmel17) A*0201YLSGANLNLCarcinogenic Embryonic Antigen (CEA) A*0201KVLEYVIKVMAGEA A*0201KVAELVHFLMAGEA A*0201KTWGQYWQVgp100 (pmel17) A*0201HLSTAFARVG250 (renal cell carcinoma) A*0201ILAKFLHWLTelomerase A*0201ILHNGAYSLHER-2/neu A*0201IMDQVPFSVgp100 (pmel17) A*0201KIFGSLAFLHER-2/neu A*0201LMLGEFLKLSurvivin A*0201ALQPGTALLProstate Stem Cell Antigen (PSCA) A*0201CMTWNQMNLWilm's Tumour (WT1) A*0201ELAGIGILTVMelanA / MART A*0201FLTPKKLQCVProstate Specific Antigen-1 (PSA-1) A*0201GLYDGMEHLMAGEA A*0301KQSSKALQRbcr-abl 210 kD fusion protein A*0301ATGFKQSSKbcr-abl 210 kD fusion protein A*0301ALLAVGATKgp100 (pmel17) A*2402VYGFVRACLTelomerase reverse transcriptase (hTRT) A*2402TYLPTNASLHER-2/neu A*2402TYACFVSNLCarcinogenic Embryonic Antigen (CEA) A*2402TFPDLESEFMAGEA A*2402EYLQLVFGIMAGEA A*2402CMTWNQMNLWilm's Tumour (WT1) A*2402AFLPWHRLFTyrosinase B*0801GFKQSSKALbcr-abl 210 kD fusion protein allélszekvencia EBV epitop A*0201CLGGLLTMVEBV LMP A*0201GLCTLVAMLEBV BMLF A*1101IVTDFSVIKEBV EBNA A*2402TYGPVFMCLEBV LMP B*0702RPPIFIRRLEBV EBNA-3A B*0801FLRGRAYGLEBV EBNA-3A B*0801RAKFKQLLEBV BZLF B*3501HPVGEADYFEYEBV EBNA allélszekvencia Influenza A epitop A*0101CTELKLSDYInfluenza A (PR8) NP A*0201GILGFVFTLInfluenza A MP A*0301ILRGSVAHKInfluenza A (PR8) NP allélszekvencia HIV epitop A*0201ILKEPVHGVHIV-1 RT A*0201KLTPLCVTLHIV-1 env gp A*0201SLYNTVATLHIV-1 gag p A*0201TLNAWVKVVHIV-1 gag p A*0301QVPLRPMTYKHIV-1 nef A*0301RLRPGGKKKHIV-1 gag p A*2402RYLKDQQLLHIV-1 gag gp B*0702IPRRIRQGLHIV-1 env gp B*0702TPGPGVRYPLHIV-1 nef B*0801FLKEKGGLHIV-1 nef B*0801GEIYKRWIIHIV-1 gag p B*2705KRWIILGLNKHIV-1 gag p H-2KdAMQMLKETIHIV-1 gag p Antigén specifikus T sejtek kimutatására alkalmas MHC-peptid pentamer példák A vizsgált személy szövettípusának megfelelő MHC multimer szükséges hozzá

82 A TRANSZPLANTÁCIÓS IMMUNOLÓGIA GYAKORLATI VONATKOZÁSAI MHC TIPIZÁLÁS ember – HLA tipizálás laboratóriumi egér – H2 tipizálás (miért nincs szükség rá?)

83 HLA tipizálás - szövet/szerv transzplantációkhoz általában a HLA-B és a HLA-DR a legfontosabb a HLA-C kevéssé immunogén, gyakran alig befolyásolja a transzplantáció eredményét - diagnosztikai értéke van HLA és a különféle betegségek között összefüggés lehet (HIV-rezisztenciás esetek egy része is adott spec HLA-B allélhez köthető) MHC I: HLA-A, HLA-B, HLA-C MHC II:HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR Fogalmak: autológ - saját eredetű (MHC azonos) allogén - idegen eredetű (MHC különbségek) xenogén - idegen faból származó (MHC és akár „vércsoport” antigén különbségek is)

84 Hiperakut rejekció Okok: alloantigénekkel szembeni előzetes immunizácó, preformált anti-HLA ellenanyagok, ABO- vércsoport inkompatibilitás, xenotranszplantáció antitestek kötődnek a szerv endotél sejtjeihez komplementrendszer aktiválódása trombózis vascularis necrosis terápia rezisztens Transzplantációs reakciók (allorektivitás) HLA-A, B, C, DR, DQ, DP, és minor hisztokompatibilitási antigének jelentősége idegen MHC-antigének T sejtek általi felismerése Direkt: saját T sejtek - donor APC-k (CD8+ T sejt válasz) Indirekt: saját APC bemutatja a donor MHC-molekula katabolizmusából származó fragmenteket (CD4+ T sejtek) citokin felszabadulás GYULLADÁS

85 forrás: Klinikai immunológia (II. klinikum) (OHVI 1990 szerk.: Szegedi, Gergely, Sipka, Szemere) Stenszky Valéria: Autoimmun betegségek genetikai vonatkozásai Betegségek (autoimmun) HLA gyakoriság betegkontroll SLE DR35520 B85020 Hidralazin(?) indukált lupus erythematosus DR47332 Basedow-kór DR35625 B84320 Krónikus aktív hepatitisDR35521 Sclerosis multiplex DR26030 B73724 Myasthenia gravisB84420 Autoimmun IgA glomerulonephritis DR45319 I. típ. diabetes DR37224 DR34922 B84021 Addison-kór (idiotópiás, autoimmun) DR37020 B84623 Sjörgen-szindróma DR37020 B85022 Coeliaka DR37922 DR76015 B86822 Goodpasture-szindrómaDR28829 IgA hiányDR38120 Dermatitis herpetiformis DR38220 B87522 De Qervain-thyreoiditisB Reiter-szindrómaB27799 Felty-szindrómaDR49520 BetegségekHLA gyakoriság betegkontroll NarcolepsiaDR Bechterew-kórB27899 Adrenogenitális szindróma Sóvesztő forma Késői forma Virilizáló forma Bw47361 B14574 B54810 Psoriasis vulgaris Cw65615 B13248 B17278 DR74823 Idiopátiás haemochromatosisA37628 Bechet-kórB Arany indukált thrombocytopeniaDR35013 Arany indukált leukopéniaDR34713 HLA allotípusok és betegségek közötti kapcsolatok

86 A régi klasszikus módszer: Szerotipizálás A tipizálandó vérsejtek és a tipizáló szérum közötti szerológiai reakción alapul. Az MHC I és/vagy MHC II molekula változatokat felismerő ellenanyagokat tartalmazó szérumok segítségével véghez vitt komplement mediált lízis/sejtkárosítás. Ha a tipizáló szérum nem reagál a sejtekkel, nincs lízis (az elpusztult/károsodott sejteket festék hozzáadásával teszik láthatóvá) A tipizáló szérumokat régen immunizálódott személyektől gyűjtötték (pl. többször szült nők, vérátömlesztést kapott személyek - többféle MHC allél ellen immunizálódtak), ezt később monoklonális ellenanyagokkal váltották ki. HLA tipizálási módszerek: A szérumok/ellenanyagok specifitásának jellemzése és az új HLA allélek azonosítása nemzetközi workshopok keretében történik. A rendelkezésre álló, jól karakterizált szérumok mennyisége mindig limitált – ezért mikrotiter tálcákon végzik a vizsgálatokat (mikrocitotoxicitási vizsgálat, Terasaki plate)

87 Az MHC II (HLA-DP, DQ, DR) allotípusokat B sejteken vizsgálják perifériás vér, Ficoll gradiens  PBMC PBMC, olcsó nylonvatta szlop  dúsított B sejtek Szerotipizálás Az MHC antigének kompatibilitását kevert limfocita reakcióval (MLR) is vizsgálhatják. -Kétirányú MLR – mindkét donor T limfocitái válaszolnak -Egyirányú MLR – az egyik személy limfocitáinak osztódását gátolják (γ besugárzás, sejtosztódás gátló Mitomycin C kezelés ) AZ ALLOREAKTÍV AKTIVÁLÓDÓ LIMFOCITÁK ARÁNYA EGY ADOTT EGYEDBEN NAGYON MAGAS LEHET (1-10%) (alloreaktivitás és MHC restrikció látszólagos paradoxonának szemléletes feloldása: az allogén MHC a saját T sejt számára úgy „látszik”, mintha saját MHC lenne idegen peptiddel)

88 A szerotipizálásnak vannak korlátai: – gyakori keresztreakciók (HLA-B27 – HLA-B7, nem csak a poliklonális szérumok miatt ) – HLA-C ellen (alacsony immunogenitású), kevés specifikus szérum – egyes variációkat, kis eltéréseket nem képes detektálni Szerológiai módszerekkel a változatok töredékét lehet csak kimutatni! Genetikai vizsgálatok - PCR-SSP (Sequence Specific Primer) ha ismert a szekvencia Különféle egyedi HLA szekvenciákra specifikus primerekkel elvégzett sokmintás PCR vizsgálat. Az allél specifikus primerpárok segítségével, a PCR reakcióban megsokszorozott génszakaszok kimutathatók az agaróz gélben HLA-A …

89 -PCR-SSOP (Szekvencia Specifikus Oligonokleotid Próba) Jelzéssel ellátott, allél specifikus oligonukleotidok hibridizációja a vizsgált személy DNS-éhez. A vizsgálandó személy HLA génszakaszait PCR–rel sokszorosítják (nem allél specifikus primerekkel). A terméket nitrocellulóz membránon vagy mikrotiter tálcákon immobilizálják és különféle allél specifikus jelölt oligonukleotidokkal hibridizálják. A jelölés lehet radioaktív, enzim vagy fluoreszcens. – példát lásd a következő diákon (ELPHA ) -SBT (Sequence Based Typing) DNS szekvenálással állapítják meg az allotípust (egészen kis eltérések, és új változatok is kimutathatóak vele) Genetikai vizsgálatok

90 - Vérből szeparált PBMC-ből genom DNS izolálás - Az MHC II gének 2. exonjának és az MHC I gének 2. és 3. exonjának amplifikálása PCR-reakcióval. A primerek nem allél specifikusak, de biotinnal jelöltek. ELPHA (Enzyme Linked Probe Hybridization Assay) (1. lépés) DPDQDRBCA Egy gyakorlati példa PCR-SSOP-re:

91 A PCR amplifikátumot mikroteszt („ELISA”) lemez lukjaiba osztják szét. A lukak alja sztreptavidinnel fedett, és az egyes lukak liofilizált formában tartalmazzák a különféle allélszakaszokkal komplementer szekvencia specifikus oligonukleotidokat (SSOP). Sztreptavidin A biotinált amplifikátum kikötődik a sztreptavidinre, és egyidejűleg visszaoldja az oligonukleotidokat. biotinált PCR amplifikátum A komplementer szekvenciák hibridizálnak, és a mosás után csak az adott allélekre specifikus oligonukleotidok maradnak a lemezen. Az oligonukleotidokon levő jelzést pl. enzim konjugált ellenanyag ismeri fel. Az enzim megfelelő szubsztráttal színreakciót katalizál. ELPHA (Enzyme Linked Probe Hybridization Assay) (2. lépés) (Jelen esetben az oligonukleotidon levő jelzés nem lehet biotin, mert az „foglalt”. Lehet pl. digoxigenin, vagy FITC. A FITC ebben az esetben nem fluoreszcens jel, hanem ún. „tag”)

92 pl. HLA-A tipizáló lemez (3.lépés) HLA-A0276 HLA-A2434

93 szekvencia alapon 2006 októberéig leírt HLA-A allélek (480db) (egy régebbi nomenklatúra szerint) (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/allele.html) és a szerológiai alapon jellemzett HLA-A allélek (28db): A leírt allélek száma évről évre nő: 2014: 2579 HLA-A allél 1833 HLA-A fehérje 87 null allél

94 2014-es HLA nomenklatúra A szekvenálás térhódításával rengeteg új allélt/változatot mutatnak ki, ezért a nomenklatura rendszeres frissítésre szorul januárjáig különböző HLA allélt (A,B,C, DP, DQ, DR,…) írtak le

95 TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK Ártalmatlan anyagok bejutása egyes emberekben túlérzékenységi reakciókat válthat ki Nemkívánatos gyulladáshoz, sejtek és szövetek károsodásához vezet Az immunrendszer az idegen anyagra nem megfelelően reagál Többnyire ártalmatlan anyagok hatására alakul ki, másodszori (esetleg többszöri) találkozás eredményeként

96 TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK ÁTTEKINTÉSE I. típusú „azonnali” II. típusúIII. típusúIV. típusú „késői” Ellenanyag mediáltT sejt mediált - az elején szenzitizációval indulnak - gyakran autoimmun megbetegedésekkel kapcsolatban - a típusok effektor mechanizmusai átfedhetnek – tünetek egy része hasonló lehet - sok olyan eset lehetséges amikor nem tisztán az egyik vagy a másik típus jelenik meg (pl. I – IV)

97 AZ ELLENANYAG MEDIÁLT TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK TÍPUSAI Ellenanyag izotípus Antigén Effektor mechanizmus Példa Szolubilis antigén Hízósejt aktiváció Allergiás rhinitis, asthma bronchiale, anaphylaxia Szolubilis antigén Komplement, fagociták Sejtfelszíni receptor Sejtfelszíni vagy mátrix- kötött antigén Az ellenanyag megváltoztatja a jelátvitelt Komplement, Fc  R + sejtek (fagociták, NK-sejtek) Egyes gyógyszer- allergiák (pl. penicillin) Krónikus urtikária (ellenanyag az Fc  RIα ellen) Szérumbetegség, Arthus-reakció II. típusIII. típus I. típus

98 I. TÍPUSÚ TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓ „azonnali” hiperszenzitivitási reakció „klasszikus” ALLERGIA

99 A szenzitizáció folyamata Első találkozás a pollennel Az antigén bejutása, felvétele Antigén- specifikus T-sejtek aktivációja IgE termelés és azok kötődése a hízósejtek felszínéhez (Az antigénprezentáció a naív T sejtek számára és a naív B sejtek aktivációja természetesen a nyirokcsomóban történik)

100 AZ ALLERGÉN HATÁSÁRA A HÍZÓSEJTBEN KIVÁLTOTT REAKCIÓK KORAI MEDIÁTOROK (raktározott) Biogén aminok – hisztamin Enzimek – triptáz, kináz, karboxipeptidáz KÉSŐI MEDIÁTOROK

101 citokin kemokin lipid- mediátor enzim toxikus mediátor Termék típusa Termék Biológiai hatások kötőszöveti ‘remodelling’ toxikus a parazitákra növeli az erek permeabilitását simaizom összehúzódáshoz vezet gyulladáskeltő, különböző sejttípusok citokintermelését serkenti, aktiválja az endotéliumot TNFα (egy része granulumokban raktározva) simaizom összehúzódáshoz vezet növeli az erek permeabilitását serkenti a nyáktermelést serkentik és erősítik a Th2-választ granulocita termelés és aktiválás monocita, makrofág és granulocita toborzás leukociták toborzása, lipidmediátorok felszabadulásának serkentése, neutrofilok, eozinofilok és trombociták aktiválása A TNF  tároltan is megtalálható, és késői mediátor is korai (tárolt) mediátorok

102 A hízósejt degranuláció hatása függ a szöveti környezettől Hányás, hasmenés, hasi görcsök Köhögés, mellkasi szorítóérzés, sípoló légzés Ödéma, gyulladás és megnövekedett antigénszállítás a nyirokcsomókba Hízósejt aktiváció és degranuláció Emésztőrendszer Légutak Vérerek Megnövekedett emésztőnedv szekréció és perisztaltika Csökkent átmérő és megnövekedett nyáktermelés Megnövekedett vérátáramlás és permeabilitás

103 AZ IgE ÁLTAL KÖZVETÍTETT HIPERSZENZITIVITÁS TÍPUSAI SZINDRÓMAGYAKORI ALLERGÉNEK A BELÉPÉS HELYEVÁLASZ szisztémás anafilaxis gyógyszerek állati mérgek földi mogyoró intravénás (közvetlen vagy szájon át történő felszívódás ödéma ér áteresztő képesség növekedése tracheális okkluzió keringés összomlása halál akut urtikáriarovar csípés allergia teszt szubkutána véráram lokális fokozódása éráteresztő képesség növekedése Allergiás rinitisz szénanátha pollen házi atka ürülék belégzésorr nyálkahártya ödéma orr nyálkahártya irritáció asztmaállatszőr pollen házi atka ürülék belégzéslégutak szűkülete fokozott nyálka képződés légutak gyulladása étel allergiacsonthéjasok földimogyoró halak, kagyló tej, tojás szájon áthányás hasmenés pruritusz (viszketés) urtikária (csalánkiütés) anafilaxis (ritka)

104 Hízósejtek működésének vagy antigén specifikus IgE jelenlétének vizsgálata kísérleti állatmodellben: Passzív kután anafilaxis A bőrbe szenzitizált élőlény szérumát, vagy antigén specifikus IgE ellenanyagokat juttatnak lokálisan ( „lokális passzív immunizálás ”). Egy két nap elteltével intravénásan juttatnak az állatba antigént, és jelzőfestéket (Evans-blue – albuminhoz kötődik a keringésben) A kisméretű antigén a korábbi oltás helyén kiváltja az IgE hordozó hízósejtek aktivációját. A hisztamin hatására megnő a helyi kapillárisok permeabilitása, a kék festék kijut a szövetbe – kék elszíneződés az oltás helyén

105 Parlagfű (Ambrosia artemisiifolia)

106 Fekete üröm (Artemisia vulgaris) levélfonák zöld levélfonák fehéresen molyhos

107 Fekete üröm (Artemisia vulgaris) –? Fehér üröm (Artemisia absinthium) – Abszint


Letölteni ppt "Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (2.) Az elsődleges antigén-ellenanyg kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek (ELISA) MHC tipizálás."

Hasonló előadás


Google Hirdetések