Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az immunkompetens sejtek funkcionális aktivitásának vizsgálata, blasztos transzformáció (LPS és ConA aktiválás), poliklonális B- és T-limfocita aktiválás,

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Az immunkompetens sejtek funkcionális aktivitásának vizsgálata, blasztos transzformáció (LPS és ConA aktiválás), poliklonális B- és T-limfocita aktiválás,"— Előadás másolata:

1 Az immunkompetens sejtek funkcionális aktivitásának vizsgálata, blasztos transzformáció (LPS és ConA aktiválás), poliklonális B- és T-limfocita aktiválás, ELISPOT módszer 9. szeminárium/gyakorlat

2 A T- és B-limfociták funkcionális aktivitásának mérése 1.A T- és B-sejtek poliklonális aktivációja a TCR vagy a BCR nem antigén-specifikus aktivációjával lektinek által indukált aktiváció α-IgM, α-CD3 vagy α-TCR ellenanyaggal, allogén T-sejt aktiváció (korai aktiváció: intracelluláris események vizsgálata) 2. Az aktivációt követő T- és B-sejt válasz jellemzése aktivációs markerek proliferatív válasz 3 H-timidin beépülés CFSE fluoreszcencia feleződés sejtciklus vizsgálata Ellenanyag és/vagy citokin termelés (ELISA, CBA) 3. Az aktivált T- és B-sejtek számának meghatározása az antigén hatás után ELISPOT Intracelluláris citokin festés Pentamer (vagy tetramer) technika Témák:

3 A humorális immunválasz szakaszai felismerésaktiváció, proliferáció, differenciáció Nyugvó IgM +, IgD + érett B-sejt Antigén Aktivált B-sejt Segítő T-sejt, más stimulus Klonális expanzió B-sejt Nagy affinitású Ig-t expresszáló B-sejt Nagy affinitású IgG Memória B-sejt Affinitás érés Izotípus váltás Antitest termelés IgG-t expresszáló

4 A T-sejt válasz szakaszai Antigén felismerés Klonális expanzió Differenciáció Effektor funkciók Naív CD8 + T-sejt Naív CD4 + T-sejt Citokinek (pl. IL-2) Citokinek (pl. IL-2) Nyirokszervek Perifériás szövetek CD4 + Effektor T-sejt CD8 + Effektor T-sejt (CTL) CD4 + Memória T-sejt Aktiváció CD8 + Memória T-sejt Makrofágok, B-sejtek, más sejtek aktivációja Fertőzött target sejtek ölése, makrofág aktiváció

5 B-sejt receptor komplex általi jelátvitel Membrán Ig keresztkötése antigénnel Tirozin foszforiláció Biokémiai intermedierek Aktív enzimek Transzkripciós faktorok PLC  aktiváció Emelkedett ic Ca 2+ Ca 2+ dependens enzimek Diacilglicerol GTP/GDP csere a Ras-on, Rac-on

6 T-sejt receptor komplex általi jelátvitel Az áttekintett folyamatok többsége lépéseiben vizsgálható TCR mediált jelek indítása Biokémiai intermedierek Késői jelátvitel enzimei Transzkripciós faktorok kalcineurin MAP kinázok Diacilglicerol GTP/GDP csere a Ras-on PLC  1 aktiváció Adapter fehérjék T sejt Emelkedett ic Ca 2+

7 Poliklonális T-/B-sejt aktivációt kiváltó anyagokkal, és módszerekkel végezhető el a sejtek funkcionális vizsgálata. Az immundeficienciák nagy része különböző funkcionális vizsgálatokkal mutathatók ki. Az antigénnel való aktiválás technikailag nehezen lenne kivitelezhető, mert az antigén-specifikus T- és B-sejtek gyakorisága kicsi.

8 A limfociták poliklonális aktivációja LPS, lektinek, PMA+Ionomycin jelenlétében B-sejt (egér) T-sejt BCR vagy TCR-specifikus ellenanyagok is a megfelelő sejtek poliklonális aktivációját okozzák LPS a TLR4-en keresztül aktiválja a sejteket A lektinek (pl. Con A, PHA) szénhidrát kötő fehérjék. A sejtfelszíni glikozilált receptorok keresztkötésével aktiválják a sejteket. Az Ionomycin a külső Ca 2+ ionok beengedésével aktiválja a sejteket, szinergizálva a protein kináz C-hez kötődő PMA-val TLR4

9 Poliklonális B-sejt aktivátorok és hatásaik AktivátorT-sejt függésIg szekréció Humán B-sejt PWM (pokeweed mitogen) nincsvan SpA (szuperantigén, staphylococcus protein A) nincsvan EBV (transzformáló hatású is) van Anti-Igvancitokinek jelenlétében Egér B-sejt LPSnincsvan PWMvan PPD (purified protein derivate, mikobakteriumból) nincsvan Anti-Ignincscitokinek jelenlétében Poliklonális T-sejt aktivátorok Phytohaemagglutinin (PHA)lektinCanavalia ensiformis Concanavalin A (ConA)lektinPhaseolus vulgaris anti-CD3monoklonális ellenanyag

10 Pokeweed (PWM) (Phytolacca americana) - Álkörmös Termését borszínezésre használták, aztán rájöttek, hogy mérgező (triterpénszaponin, és mitogén lektin) Mo.-n dísznövényként tartják Chenopodiales (libatopvirágúak) Phytolaccaceae (álkörmösfélék)

11 Phytohaemagglutinin (PHA)  Canavalia ensiformis – Jackbean, Sword bean - Kardbab

12 Concanavalin A (ConA)  Phaseolus vulgaris – (vetemény) bab

13 Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array ic Ca 2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis Citokin szekréció - IC citometria - ELISA, ELISPOT Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) Sejtciklusba lépés/apoptózis - DNS tartalom - IN antigének Sejtosztódás - 3 H-timidin, CFSE, MTT A limfociták aktivációja Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén- ellenanyag kapcsolódáson alapul

14 Western blot Specifikus fehérjék jelenléte, vagy akár azok foszforilációs állapota vizsgálható vele Az aktiválás utáni különböző időpontokban „befagyasztható” a sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így vizsgálhatóak a sejtaktiváció foszforilációs eseményei sok, legalább 10 6 sejt szükséges a vizsgálathoz

15 Bruton-féle tirozin kináz (BTK) hiányának kimutatása Western blottal X- kromoszómához kapcsolt (Bruton-féle) agammaglobulinemia Az immunglobulinok és az érett B sejtek szinte teljes hiánya jellemzi.

16 Futatani T et al. Blood 1998;91: Bruton-féle tirozin kináz (BTK) hiányának kimutatása áramlási citometriával

17 Az intracelluláris (citoplazmatikus) Ca 2+ szint meghatározása A citoplazmatikus Ca 2+ koncentráció növekedése fluoreszcens indikátor festékekkel vizsgálható. /Fluo-3 vagy az Indo-1/ példa – intracelluláris Ca 2+ jel egy sejtben kimutatva: antigén prezentáló B sejt T sejtet aktivál (klikk a képre)

18 módszer: RT-PCR, QRT-PCR A génaktiváció vizsgálata A sejtaktiváció az aktiválódó génekről átíródó mRNS segítségével is kimutatható pl. citokin gének aktivációja sejtek  RNS izolálás RNS  (reverz transzkriptáz)  cDNS cDNS  (PCR)  hossz és mennyiség meghatározás RT-PCR: agaróz gél (pl. denzitometria) QRT-PCR: fluoreszcens módszer (TaqMan probe (FRET) v. interkaláló fluorokróm  SYBR green)

19 A termelődött citokinek intracelluláris kimutatása immunfluorimetriával jelzéssel ellátott citokin-specifikus ellenanyag - a sejtmembránt detergenssel átjárhatóvá kell tenni - de előtte a sejteket fixálni kell, hogy ne essenek szét a detergenstől (pl. aldehides fixáció) citokinek - előzőleg a sejtek valamilyen, a sejttípusra jellemző antigént felismerő ellenanyaggal is megjelölhetők („sejttípus marker” pl. CD4)

20 Eredmény: Megtudható az is belőle, hogy milyen sejttípusok termelték a citokineket! Érzékenysége elérheti a Western blot-ét (pl. hűtött CCD kamerás mikroszkóppal– akár egyetlen sejt is elegendő lehet a vizsgálathoz)

21 Az intracelluláris festés fixált sejtekkel történik. hibrid ellenanyag!!! a 2 Fab rész eltérő specificitású az egyik Fab a sejt valamely jellemző molekulájára specifikus a másik Fab citokinspecifikus csapdaként szolgál a citokint egy jelzett másodlagos ellenanyaggal mutatják ki Kettős specificitású ellenanyag felhasználásával a sejtek által termelt citokinek natív mintákon is vizsgálhatók. (nem elterjedt, körülményes, de szép módszer!)

22 ELISPOT Enzyme Linked Immuno-Spot elve hasonlít az ELISA-hoz eredetileg az ellenanyagot szekretáló B-sejtek számának meghatározására szolgált ma alkalmas egyéb szolubilis effektor molekulák, pl. citokinek, kemokinek, granzim termelő sejtek számának meghatározására is egyaránt alkalmas poliklonális aktivátorok vagy antigén indukálta aktivációt követően az aktivált effektor sejtek számának meghatározására érzékenység: 1/ sejt az első lépéseket aszeptikus körülmények között kell végezni

23 ELISPOT - a capture ellenanyagok kitapasztása - blokkolás - a sejtek hozzáadása - biotinnal konjugált másodlagos ellenanyag hozzáadása - avidin-enzim konjugátum -kromogén szubsztrát hozzáadása (AEC 3-amino-9-etilkarbazol ) (aktiválás, inkubáció) - mosás A citokin termelő sejt helyét mutató folt Az ELISPOT lemez egy lyukának felülnézete a képződött foltokkal A mérés menete

24 Leolvasása mikroszkóppal (lassú, manuális munka) vagy “ELISPOT plate reader” segítségével (gyors + standardizálható spot szám és méret meghatározás)

25 Sejtciklus DNS mennyiség meghatározása (fluoreszcens DNS interkalátorok, 3 H-timidin) - transzkripció kimutatása (RT-PCR) - fehérjék kimutatása (Immunoassay) sejtszám változás meghatározása (CFSE) a sejtciklusba lépő sejtek mérete megnövekszik = blasztos transzformáció

26 G2G2G2G2 M G0G0G0G0 G1G1G1G1 s G0G0G0G0 G1G1G1G1 s G2G2G2G2M DNS analízis (pl.aneuploidia diagnosztikájához) DNS mennyiség sejtszám 2N 4N A sejtciklus vizsgálható a DNS mennyiség alapján, pl. a DNS-be sztöhiometrikus módon interkalálódó fluoreszcens festékekkel (propidium jodid, PI) Egy sejtpopuláció sejtjeinek eloszlása DNS mennyiség alapján (áramlási citometriás ábra)

27 A B-/T-sejt proliferáció mérésére alkalmas módszerek 3 H-jelölt timidin-beépülés a totál DNS-beépülést méri. Nem méri, hogy hány sejt hányszor osztódott (β-bomlás mérése). A timidin-analóg bromodeoxyuridin (BrdU) alkalmazható kísérleti állatokban és sejtkultúrákban is. Az osztódó sejtek BrdU-specifikus ellenanyag felhasználásával kimutathatók (mikroszkópia, FACS). Újabban a karboxifluoreszcein diacetát szukcinimidil észter (CFSE) használata terjedt el.

28 A sejtosztódás meghatározása A „Cell tracer” festékek bediffundálnak a sejtbe, és sokáig megőrződnek. Az apoláros CFSE kovalensen kötődik az intracelluláris fehérjékhez. Amikor az intracelluláris festék a két utódsejtbe szétosztódik, a fluoreszcencia intenzitás felére csökken. sejtosztódások :

29 T-sejtek funkcionális vizsgálata Antigén specifikus T-sejtek azonosítása immunizálás Hasznos lehet pl. immunizálás eredményességének vizsgálatakor antigén specifikus T-sejt Ha a T-sejt receptorok specificitása meghatározható, akkor a felszaporodott antigén specifikus T-sejtek kimutathatóak. T-sejt klónok ugyanolyan T-sejt receptorral

30 De az MHC kötődése a T-sejt receptorhoz kis affinitású egy MHC molekula és T-sejt receptor kölcsönhatása nem elég erős Megjelölt MHC-peptid komplex felhasználható a specifikus T-sejt receptor kimutatására MHC T-sejt receptorok T-sejt

31 Pentamer (vagy tetramer) technika a létrejövő pentamer self assembling coiled-coil-domain MHC peptid fluoreszcens jelzés a pentamer egyik alegysége Multimerizált MHC-peptid komplex aviditása már kellően erős lehet.

32 peptid-specifikus T-sejt MHC pentamer Az MHC pentamer kötődése a T-sejthez Az MHC-peptid oligomer reakciója a specifikus T-sejt receptorokkal nagy aviditású. T-sejt receptorok Ide kattints az animációhoz MHC multimerek segítségével meghatározható az antigén-specifikus T-sejtek száma, értékelhető pl. a vakcinák, vagy egy adott terápiás eljárás hatékonysága.

33 CMV-specifikus T-sejtek normál HLA-A2 donorban EBV BZLF-1 (RAKFKQLL/ HLA-B*0801)-specifikus T-sejtek (a normál populáció 90-95%-a hordozó) Influenza epitóp (GILGFVFTL/ HLA-A0201)-specifikus T-sejtek egészséges donorban Tetramer (pentamer) jelöléses példák A perzisztáló (pl. herpeszvírusok) vagy visszatérő fertőzések miatt a specifikus T-sejtek száma viszonylag magas lehet

34 allélszekvencia Tumor (asszociált) epitop peptid eredete A*0201GVLVGVALICarcinogenic Embryonic Antigen (CEA) A*0201LLGRNSFEVp A*0201LLLLTVLTVMUC A*0201RLLQETELVHER-2/neu A*0201RMFPNAPYLWilm's Tumour (WT1) A*0201SLLMWITQVNY-ESO A*0201STAPPVHNVMUC A*0201VISNDVCAQVProstate Specific Antigen-1 (PSA-1) A*0201VLQELNVTVLeukocyte Proteinase-3 (Wegener's autoantigen) A*0201VLYRYGSFSVgp100 (pmel17) A*0201YLEPGPVTAgp100 (pmel17) A*0201YLSGANLNLCarcinogenic Embryonic Antigen (CEA) A*0201KVLEYVIKVMAGEA A*0201KVAELVHFLMAGEA A*0201KTWGQYWQVgp100 (pmel17) A*0201HLSTAFARVG250 (renal cell carcinoma) A*0201ILAKFLHWLTelomerase A*0201ILHNGAYSLHER-2/neu A*0201IMDQVPFSVgp100 (pmel17) A*0201KIFGSLAFLHER-2/neu A*0201LMLGEFLKLSurvivin A*0201ALQPGTALLProstate Stem Cell Antigen (PSCA) A*0201CMTWNQMNLWilm's Tumour (WT1) A*0201ELAGIGILTVMelanA / MART A*0201FLTPKKLQCVProstate Specific Antigen-1 (PSA-1) A*0201GLYDGMEHLMAGEA A*0301KQSSKALQRbcr-abl 210 kD fusion protein A*0301ATGFKQSSKbcr-abl 210 kD fusion protein A*0301ALLAVGATKgp100 (pmel17) A*2402VYGFVRACLTelomerase reverse transcriptase (hTRT) A*2402TYLPTNASLHER-2/neu A*2402TYACFVSNLCarcinogenic Embryonic Antigen (CEA) A*2402TFPDLESEFMAGEA A*2402EYLQLVFGIMAGEA A*2402CMTWNQMNLWilm's Tumour (WT1) A*2402AFLPWHRLFTyrosinase B*0801GFKQSSKALbcr-abl 210 kD fusion protein allélszekvencia EBV epitop A*0201CLGGLLTMVEBV LMP A*0201GLCTLVAMLEBV BMLF A*1101IVTDFSVIKEBV EBNA A*2402TYGPVFMCLEBV LMP B*0702RPPIFIRRLEBV EBNA-3A B*0801FLRGRAYGLEBV EBNA-3A B*0801RAKFKQLLEBV BZLF B*3501HPVGEADYFEYEBV EBNA allélszekvencia Influenza A epitop A*0101CTELKLSDYInfluenza A (PR8) NP A*0201GILGFVFTLInfluenza A MP A*0301ILRGSVAHKInfluenza A (PR8) NP allélszekvencia HIV epitop A*0201ILKEPVHGVHIV-1 RT A*0201KLTPLCVTLHIV-1 env gp A*0201SLYNTVATLHIV-1 gag p A*0201TLNAWVKVVHIV-1 gag p A*0301QVPLRPMTYKHIV-1 nef A*0301RLRPGGKKKHIV-1 gag p A*2402RYLKDQQLLHIV-1 gag gp B*0702IPRRIRQGLHIV-1 env gp B*0702TPGPGVRYPLHIV-1 nef B*0801FLKEKGGLHIV-1 nef B*0801GEIYKRWIIHIV-1 gag p B*2705KRWIILGLNKHIV-1 gag p H-2KdAMQMLKETIHIV-1 gag p Antigén specifikus T sejtek kimutatására alkalmas MHC-peptid pentamer példák

35 Esettanulmány Helen Burns a család második gyermekeként született. 6 hónapos koráig normálisan fejlődött, ekkor azonban mindkét tüdőfélre kiterjedő tüdőgyulladás fejlődött ki nála, amelyet súlyos köhögés és láz kísért. A vérből és a köpetből készített baktériumtenyészetek negatívak voltak, a légcsőből nyert aspirátum azonban nagy mennyiségű Pneumocystis carinii jelenlétét mutatta ki. Pneumocystis elleni pentamidin kezelést követően állapota javult, majd teljesen felépült. Mivel a tüdőgyulladást az opportunista kórokozó, Pneumocystis carinii okozta, fennállt a gyanúja, hogy Helen súlyos kombinált immunhiányos betegségben szenved. Az eddig szerzett ismeretek alapján milyen vizsgálatokat lehetne elvégezni a betegség kizárása vagy igazolása érdekében?

36 Vérmintát vettek tőle, és perifériás mononukleáris sejtjeit fitohemagglutininnel (PHA) stimulálták, hogy [ 3 H]-timidin DNS-be való beépülésének mérésével képet kapjanak a T-sejtek működéséről. A proliferációs T-sejt válasz normális volt, a [ 3 H]-timidin beépülésének értéke cpm volt (normális kontroll: cpm). Helen megkapta a szokásos védőoltásokat, az orálisan adott poliovakcinát és kéthónapos korában a DPT- (diftéria, pertusszisz, tetanusz) vakcinát. További vizsgálatok során azonban T-sejtjei nem adtak választ a tetanusztoxinra in vitro, allogén B-sejtekkel való stimulációkor azonban a [ 3 H]-timidin beépülési tesztben a válasz normális volt (6730 cpm, szemben a stimulálatlan a sejtekben mért 783 cpm-mel). Miután felismerték, hogy Helen T-sejtjei specifikus antigénstimulussal szemben válaszképtelenek, megmérték szérum-immunglobulinjainak a szintjét és azokat rendkívül alacsonynak találták: IgG szint: 96 mg/dl (normális: g/dl) IgA szint: 6 mg/dl (normális: mg/dl) IgM szint: 30 mg/dl (normális: mg/dl)

37 Helen fehérvérsejtszáma sejt/μl volt, ami magas (normális érték: μl). Ezekből 82 % volt neutrofil, 10 % limfocita, 6 % monocita és 2 % eozinofil. A fentiekből kiszámítható 2000 limfocita/ μl a korának megfelelő várható értékhez (> 3000 μl) hasonlítva alacsony volt. Limfocitáinak 7 %-a volt B-sejt (CD20 + ) (normális érték: %), és 57 % reagált a CD3 T-sejt markerrel. A CD8 + T-sejtjeinek száma (388 sejt/μl) a normális határokon belül volt, a CD4 + T- sejtek száma azonban (228 sejt/μl) a normálisnál sokkal alacsonyabb volt (a normális érték általában a CD8 + T-sejtek számának a kétszerese). A T-sejtek viszonylag nagy száma, és a PHA-ra adott normális immunválasz kizárta a súlyos kombinált immunhiányos állapot (SCID) diagnózisát.

38 Helent gyermekorvosa a diagnózis hiányának ellenére beutalta a kórházba csontvelő-átültetés tervezése céljából. Amikor Helen, édesanyja, édesapja és egészséges 4 éves bátyja szövettipizálására került sor, Helen fehérvérsejtjeiből nem tudtak DR-típust meghatározni. B-sejtjeit in vitro Epstein-Barr vírussal transzformálták, hosszú távú tenyészet nyerése érdekében, s ezeken a sejteken fluoreszcensen jelölt antitestekkel vizsgálták az MHC-I és az MHC-II molekulák expresszióját. A vizsgálatok kimutatták, hogy B-sejtjein sem HLA-DQ, sem HLA- DR molekulák nem voltak, így megállapították az MHC-II hiánybetegség diagnózisát.

39 Mivel Helen testvérének HLA típusa eltérő volt, így az anyát választották csontvelődonornak. Az anyai csontvelőből - amelyet Helen transzfúzióval kapott - a graft versus host reakció megelőzése végett eltávolították a T-sejteket. Az átültetés sikeresnek bizonyult, s az immunfunkció helyreállt. Összefoglalás és kérdések 1. Miért nem voltak Helen vérében CD4 T-sejtek? A CD4 + T-sejtek érése a tímuszban a timociták és a tímusz epitélsejtein levő MHC-II molekulák közötti kölcsönhatástól függ. MHC-II gének genetikai deléciója egerekben szintén a CD4 + T-limfociták hiányát eredményezi. 2. Miért volt Helen vérében az immunglobulin-szint alacsony? A B-sejtek poliklonális expanziójához és immunglobulin-termelődő plazmasejtekké való éréséhez CD4 + T-sejtek által termelt citokinek, mint pl. IL-4 segítsége szükséges. Helen hipogammaglobulinémiája tehát a CD4 + T-limfociták hiányának a következménye.

40 3. SCID-ben a limfociták nem válaszolnak mitogénstimulációra. Bár először úgy gondolták, hogy Helen SCID-ben szenved, a diagnózist megcáfolta a PHA-ra és az allogénstimulációra adott normális válasza. Mi a magyarázata ennek a megfigyelésnek? Helen T-sejtjei kisebb számban vannak ugyan jelen, működésük azonban normális, a probléma ezeket a sejteket nem érinti. Nem specifikus mitogénekre és alloantigénekre, amelyek a normális allogén sejt felszínén levő MHC-molekulák, s így nincs szükség feldolgozásukra és a hibás sejtek általi prezentálásukra, képesek normális választ adni. Limfocitáinak tetanusztoxinra való in vitro válaszképtelensége viszont azzal magyarázható, hogy ebben az esetben nincsenek olyan sejtek jelen, amelyek az antigént prezentálni tudnák az MHC-II molekulákon a T-sejtek felé. 4. Amennyiben Helen alkarjára bőrgraftot ültetnének, kilökődne-e a transzplantátum? Igen. Helen T-sejtjei képesek lennének a transzplantátum sejtjein levő idegen MHC- molekulák felismerésére, s a graft kilökődne.


Letölteni ppt "Az immunkompetens sejtek funkcionális aktivitásának vizsgálata, blasztos transzformáció (LPS és ConA aktiválás), poliklonális B- és T-limfocita aktiválás,"

Hasonló előadás


Google Hirdetések