Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az elsődleges antigén – ellenanyag kapcsolódáson alapuló preparatív és analitikai módszerek (1.) I mmunoszorbens technikák ELISA.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Az elsődleges antigén – ellenanyag kapcsolódáson alapuló preparatív és analitikai módszerek (1.) I mmunoszorbens technikák ELISA."— Előadás másolata:

1 Az elsődleges antigén – ellenanyag kapcsolódáson alapuló preparatív és analitikai módszerek (1.) I mmunoszorbens technikák ELISA

2 Az immunoesszék érzékenysége

3 Ellenanyag tisztítás antigén immunszorbensen oszlop polimer gyöngyök rákötött antigének oszlop töltelék affinity purifed antibody : a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják.

4 tisztítandó ellenanyagok hozzáadása kötődés elúció mosás Antigén specifikus poliklonális ellenanyag

5 Fehérje(antigén) tisztítás ellenanyag immunszorbensen polimer gyöngy hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok oszlop oszlop töltelék Fordítva is összeállítható a rendszer: Tisztítandó oldat felvitele Kötődés Mosás Elúció Tisztított antigén

6 Immunprecipitáció

7 ELISA ELISA plate (lemez) E nzyme L inked I mmune S orbent A ssay lyuk avagy kút Különböző lemezek – speciális felület kezelés ellenanyag, peptid kötésre

8 enzyme linkedimmune sorbent ellenanyaghoz konjugált enzim enzim felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok

9 Az ELISA vizsgálatban az antigén mennyiségével arányos mértékű az enzimaktivitás Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay

10 Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai (hatékonyság, érzékenység, kényelem, megbízhatóság, ár) Direkt módszer Indirekt módszer Antigén Primer ellenanyag Jelzés Szekunder ellenanyagok

11 Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Enzim-antienzim rendszer PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz Antigén Primer ellenanyag Szekunder ellenanyag (faj v. izotípus specifikus) A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyag Enzimek

12 Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni Egyszerű ABC Antigén Biotinált ellenanyag Avidin Avidin-enzim komplexek Biotin-enzim komplex Avidin Biotin enzimComplexek Jel felerősítése

13 kombinált „szendvics” ELISA Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. liquor). A nem kötődő anyagok kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges fehérjék kimosása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása felesleges ellenanyagok kimosása avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása citokintartalmú minta hozzáadása felesleges konjugátum kimosása

14 Bioaktív anyagok kimutatása hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása szendvics technikával vagy kompetíciós tesztekkel Tumor antigének kimutatása Citokinek, hormonok kimutatása

15 Tumordiagnosztika A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak Tumor antigén (pl. a beteg szérumából) Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor Ag specifikus csapda ellenanyaggal fedett felület (a kit része) Prosztata daganatok prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hiperpláziás és prosztatitiszes páciensekben. A PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával. hasonlóan felhasználható a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

16 Hólyagrák: Az epiteliális sejtek NMP22 nukleáris mátrix proteinje egészséges emberekben csak kis mennyiségben található meg a vizeletben → megemelkedése diagnosztikus marker Pajzsmirigy daganatok: A szérum tiroglobulin (hTG) megemelkedett szintje diagnosztikus marker Alpha Fötoprotein (AFP) : 68kD-os protein, amit az embrionális máj és szikzacskó termel. Megjelenhet az anya szérumában is (transzplacentális transzfer). Születés utáni egy év alatt alacsony szérumszintre csökken le (<9ng/ml). Magasabb koncentrációja hepatómával, ovariális-, tesztikuláris- és preszakrális teratokarcinómákkal, de egyéb daganatokkal is összefüggésben lehet. Carcinoembryonic Antigen (CEA) sejtadhézióban vesz részt. Normális esetben csak az embrionális fejlődés során van jelen. Colorectális és egyéb carcinomát hordozó egyénekben megemelkedik a szérumszintje. Változásának nyomon követésével következtetni lehet a terápia hatékonyságára. Her-2/neu protein: 185 kD-os transzmembrán glikoprotein, tirozin kináz receptor. Az emlődaganatok %-ban a tumorsejtek megemelkedett mértékben expresszálják. Immunterápia során a működése blokkolható specifikus ellenanyaggal (Herceptin), ezért jelenlétét immunhisztokémiával, vagy immunfluoreszcenciás eljárással mutatják ki biopsziás mintákban.

17 Her-2/neu receptor szerepe az emlőrákban és a monoklonális Herceptin terápia mechanizmusa

18 egyszerű indirekt ELISA lépései Antigén specifikus ellenanyag, vagy az antigén egyszerű kimutatásához az antigén kitapasztása (coating avagy fedés) felesleges antigén kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges fehérjék kimosása specifikus ellenanyagok hozzáadása Enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása felesleges ellenanyagok kimosása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával - rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid segítségével HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid

19 Fertőzések diagnosztikája Mivel szabad vírus antigének és vírus részecskék nem minden esetben detektálhatóak kellő hatékonysággal (pl. látencia), ezért helyette inkább a szervezetben képződött vírus specifikus ellenanyagokat mutatják ki a fertőzés diagnosztizálásakor. vírus antigénnel fedett ELISA lemezek készen kaphatóak a fertőzött személy szérumában található vírus specifikus ellenanyagok hozzákötnek az antigénhez emberi Ig specifikus jelölt ellenanyagok jelzik a specifikus ellenanyagok jelenlétét ilyen elven működik: Epstein-Barr Virus (EBV) teszt kit → EBNA-1 (EBV nukleáris antigén) segítségével mutatják ki az ellene termelt IgG-t HIV diagnosztikai kitben → rekombináns HIV antigénnel anti-HIV antitestek kimutatása vérből, plazmából, szérumból vagy akár beszáradt vérfoltból Toxoplazmózis (Toxoplazma gondii – egysejtű parazita) → Toxoplazma elleni IgM kimutatás A toxoplazmózis terhesség során veszélyes akkor, ha az anya elsődleges fertőzésben szenved. Ekkor IgM típusú ellenanyagok termelődnek a fertőzés hatására, melyek transzplacentálisan nem szállítódnak és ezzel nem nyújtanak védelmet a magzat számára.

20 Autoimmunitás A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is hasonló módszerekkel detektálják Pl. SLE (szisztémás lupus erythematosus): Immunkomplex betegség, melyben számos autoantigén ellen kimutathatóak autoantitestek. A leggyakoribb anitest a kettős szálú DNS elleni antitest (az SLE-ben szenvedő betegek 60%-ában kimutatható). I típusú (autoimmun) diabetesz diagnosztikája a sziget sejt antigének elleni autoantitestek kimutatásával ELISA vizsgálat segítségével: glutaminsav dekarboxiláz (GAD65): a prediabetikus személyek 70-90% - ban és a diabetikus betegekben specifikus ellenanyagot találni ellene IA-2 (tirosine foszfatáz-szerű protein): az I típusú diabeteszes betegek % -ban és közvetlenül a betegség megjelenése előtti állapotban specifikus ellenanyagot találni. Ilyen ellenanyagok megtalálhatóak egyes GAD ellenanyag negatív személyekben is, ezért független diabetesz markernek tekinthető. inzulin: a legfőképp de nem kizárólagosan autoimmun diabeteszes fiatal gyermekekben (<5 éves) találni ellenanyagot, (megemlítendő, hogy ezek az ellenanyagok nem megkülönböztethetőek azoktól, melyek az inzulin terápia során a szervezetben termelődnek)

21 Szérum ellenanyag izotípusok meghatározása A szervezetben jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok utalnak az antigén jelenlétére (lásd pl. vírusfertőzések diagnosztikájánál). Az így kimutatott ellenanyagok izotípusa utalhat arra, hogy friss, perzisztáló fetőzésről (IgM ellenanyag dominancia), vagy korábbi fertőzést követő memória válasz eredményéről van-e szó (IgG ellenanyag dominancia). Anti-izotípus specifikus ellenanyagokkal ez eldönthető. Antigén IgM IgG anti-IgM anti-IgG Memória válasz Megemelkedett szérum IgE szintet tapasztalni atópia esetén, bizonyos autoimmun betegségekben, és egyes parazita fertőzések esetében Egyes immundeficienciákban az ellenanyag alosztályok koncentrációja eltér a normálistól (hiper IgM szindróma) (lásd a korábbi mielóma multiplex esettanulmányt is) ellenanyag capture-ellenanyag a szérum ellenanyaga izotípus specifikus ellenanyag

22 kompetitív ELISA Érzékenysége miatt szolubilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez. - A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás - Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása - Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés - Mosás - Kromogén anyagok hozzáadása

23 Aspecifikus kitapadásból eredő hiba A fehérjék aspecifikus kitapadása csökkenthető: telítéssel/blokkolással detergens alkalmazásával ELISA hibák Az antigén mellett a plasztik felületre kitapadhatnak maguk az ellenanyagok is - akár közvetlenül - akár indirekten a színreakció ugyan az

24 Elkészült ELISA lemezek

25 Mindenki látott már ehhez hasonló diagnosztikai eszközöket, vagy ha nem, találkozni fog velük későbbi pályafutása során pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből (terhességi teszt) Ezek az eszközök is az ELISA esetében már megismert elsődleges antigén-ellenanyag specifikus kapcsolódását kihasználó technikán alapulnak!

26 hCG kimutatása immunkromatográfiás tesztcsíkkal nitrocellulóz membrán jelölt ellenanyagokkal átitatott üvegfilter (A jelzés szabad szemmel is látható!) elölnézet oldalnézet hCG csapda ellenanyag sáv kontroll ellenanyag sáv abszorbciós rész (cellulóz, papír) abszorbciós lap, mintafelviteli rész vizeletminta

27 hCG csapda ellenanyag sáv kontroll ellenanyag sáv jelölt ellenanyagok hCG kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok Analóg a szendvics ELISÁval

28 hCG sáv ( kikötött hCG) kontroll ellenanyag sáv a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG Ugyanez kompetitív rendszerben Analóg a kompetitív ELISÁval

29 Az ellenanyagon található jelzés szabad szemmel is megfigyelhető, így nincs szükség enzimes folyamatokra, és egyéb reagensekre: kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek) festékkel töltött latex gyöngyök Pl.: kompetitív immunkromatográfiás tesztcsíkok aflatoxin detektálására Az eljárás szemikvantitatívá tehető Immunkromatográfiás tesztcsík egyéb felhasználási lehetőségei: élelmiszervizsgálat során toxinok kimutatása

30 Gyakorlati rész:

31 A koncentráció meghatározása Valamilyen indikátor mennyiségi jellemzője utal a koncentrációra pl:  szín (abszorbancia, optikai denzitás)  fluoreszcencia  sejtszám (pl. növekedési hormon koncentráció meghatározása) Számszerűsíthető értéket ismert koncentrációjú mintával való összehasonlítás segítségével kaphatunk (standard) A sztenderddel összehasonlítás alapja: Ha két minta abszorbanciája azonos  koncentrációjuk is azonos DE EZ CSAK RÉSZBEN IGAZ!!!!

32 koncentráció Ismeretlen koncentrációjú minta OD A standard hígítási sora Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne ? Az összehasonlíthatósághoz az ismeretlen mintából is hígításokat kell csinálni! Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani.

33 OD Becslés „vonalzóval” standard koncentráció (µg/ml) (felező hígítás (log)) Az a tartomány, ahol az abszorbancia arányos a koncentrációval 2X4X8X16X32X64X128X256X Ismeretlen minta hígításai azonos OD-hoz tartozó pontok A két csőben azonos a koncentráció Az 1.9μg/ml-re hígított standard megfelel a… … 128-szorosra hígított ismeretlen mintának Tehát az (eredeti hígítatlan) ismeretlen minta koncentrációja: 1.9x128 = 243.2μg/ml

34 OD standard koncentráció (µg/ml) (felező hígítás (log)) 2X4X8X16X32X64X128X256X Ismeretlen minta hígításai Ha felírjuk az egyenes szakaszok egyenleteit, eltehetjük a vonalzót, és elővehetjük a számítógépet y std =mx+b Y minta =mx+b

35 Durva hibák Tudatában kell lenni, hogy milyen abszorbancia érték tartományban használhajuk fel az OD értéket, ha egy egyenletbe szeretnénk visszahelyettesíteni, és az alapján koncentrációt számolni! Hígítási görbe Illeszett egyenes, egyenlettel y=mx+b  OD=m(koncentráció)+b OD koncentráció Bármely töménységű oldat kellően nagy hígításának OD-je erre a részre fog esni. Az egyenletbe ezt az OD értéket behelyettesítve, és ez alapján a hígítást is figyelembevéve (visszaszorozva), óriási – hamis! – koncentációt kapunk eredményül Hasonló mondható erről az értékről is A felhasználható OD értékek ebbe a tartományba esnek

36 Bemutatás ELISA plate-ek IFN γ standard, és T sejt kultúrák felülúszójának hígítási soraival Melyik a töményebb minta? Próbáld meg kiszámolni a koncentrációt a kiosztott ELISA adatokból otthon! számolj a 3 párhuzamos adat átlagával használd a hígítás logaritmusát a hígítási görbe ábrázolásánál próbálj táblázatkezelő programot használni a feladat megoldásához (egy példa megoldását megtalálod az intézet honlapján a gyakorlatok között)


Letölteni ppt "Az elsődleges antigén – ellenanyag kapcsolódáson alapuló preparatív és analitikai módszerek (1.) I mmunoszorbens technikák ELISA."

Hasonló előadás


Google Hirdetések