Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

ANTIGÉN, ELLENANYAG -immunogenitás, tolerogenitás -antigén fogalma -epitop (B-, T-sejt epitop) -haptén -hordozó -antigén prezentáció -T independens antigének.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "ANTIGÉN, ELLENANYAG -immunogenitás, tolerogenitás -antigén fogalma -epitop (B-, T-sejt epitop) -haptén -hordozó -antigén prezentáció -T independens antigének."— Előadás másolata:

1 ANTIGÉN, ELLENANYAG -immunogenitás, tolerogenitás -antigén fogalma -epitop (B-, T-sejt epitop) -haptén -hordozó -antigén prezentáció -T independens antigének -szuperantigének -immunoglobulinok -ellenanyag szerkezete -izotípusok -ellenanyagok funkciói -poliklonális és monoklonális ellenanyagok -passzív immunizálás -humanizált ellenanyagok -ellenanyagok felhasználása gyakorlat: -monoklonális ellenanyag termelő hibridóma sejt előállítása -sejtszámolás -gyorsklónozás -ellenanyagok tisztítása affinitás oszlopon

2 ANTIGÉN IMMUNOLÓGIAI FOGALOM Az adaptív immunválasz fogalomkörébe tartozik, B-, T-limfociták, antigén receptorok, ellenanyagok kapcsán beszélünk antigénről. Szinte bármilyen kémiai szerkezet ((de olyan anyagok amik képesek fehérjékkel másodlagos kémiai kötést kialakítani!)) Oldott vagy részecske természetű Egyszerű vagy összetett Szervezetben képződő vagy külső környezetből bejutó Genetikailag saját vagy nem saját Természetes vagy mesterséges

3 Definíciók Antigén (Ag) - bármely olyan anyag, amelyet az érett immunrendszer felismer és vele szemben specifikus, fajlagos módon reagál. Antigenitás: immunogenitás – az antigén képessége az (adaptív) immunválasz beindítására tolerogenitás – az antigén képessége az immunológiai tolerancia kiváltására, specifikus „immun-nemválaszolás” Ilyenek pl. a saját fehérjék

4 Az immunogenitást befolyásoló tényezők I. Idegen-saját (immunogén-tolerogén) Méret/komplexitás (nagyobb antigénen több „dolgot” lehet felismerni) Genetikai háttér –faji hovatartozás (filogenetikai távolság: rokon fajoknak hasonlóak a fehérjéi) –egyéni különbségek (pl. MHC molekulák eltérései) Életkor (újszülött – még nincsenek reagáló sejtjei, időskor – nem képződnek új limfociták) Fizikai állapot (pl. immunodefficiencia, éhezés)

5 Az immunogenitást befolyásoló tényezők II. Dózis Bevitel módja és útja –Intradermális/szubkután > intravénás > orális > intranazális (a sorrend függ az antigéntől is!) Adjuvánsok –fokozzák az immunrendszer antigén ingerre adott válaszát pl: aluminiumsók, Freund-adjuváns, TLR ligandumok AZ ADJUVÁNS HATÁS ÖSSZETETT: - depó hatás  az antigén hosszantartó jelenléte - a természetes immunitás aktiválása - járulékos sejtek aktivációja

6 Az antigén fizikai sajátságai - részecske (sejt, kolloid) vagy oldott („hordozó”/méret) - denaturált vagy natív (epitopok) Lebonthatóság - antigén prezentáció APC által Hozzáférhetőség (szemlencse fehérjék elzártak az immunrendszertől) Az immunogenitást befolyásoló tényezők III.

7 Antigén (animált ábra) Antigén: amit az immunrendszer felismer, és vele specifikus módon reagál Antigén determinánsok avagy epitopok: az antigén azon részei amihez az antigén receptorok vagy az antigén specifikus ellenanyagok közvetlenül kötődnek

8 Az antigén azon része, melyet egy meghatározott immunglobulin (B sejt receptor vagy ellenanyag) vagy T sejt receptor ismer fel. Antigén determináns (epitop) Az antigénnek az antigén receptorhoz közvetlenül kapcsolódni tudó része

9 B sejt epitop T sejt epitop (B sejtek ismerik fel) fehérjék szénhidrátok lipidek DNS szteroidok stb. - mesterséges vegyület is lehet! szöveti vagy oldott (T sejtek ismerik fel) peptidek (8-23 aminosav) (szigorú méretbeli kötöttség!) APC által történő bemutatás szükséges (MHC molekulákon) glikolipidek, lipopeptidek - MHC szerű CD1 molekulák segítségével mutatja be az APC. A T sejtek néhány százaléka ismer fel ilyen antigént.

10 Antigén determináns (avagy epitop) az antigén azon része, amelyet egy adott immunglobulin (B-sejt receptor, ill. ellenanyag), vagy T- sejt receptor felismerni képes A KOMPLEX ANTIGÉNEK ELVI FELÉPÍTÉSE Hordozó az immunglobulinnal vagy T- sejt receptorral közvetlenül nem reagáló rész Ezek a fogalmak csak az antigén és egy adott immunglobulin vagy T-sejt receptor viszonylatában értelmezhetők! A hordozó fogalmát főleg vakcinákkal kapcsolatban használják

11 Epitop és „hordozó” Ellenanyag 1. Ellenanyag 2. Epitop 1. „hordozó” (1.) Epitop 2. „hordozó” (2.) Antigén (animált ábra)

12 Az antigén bemutatás vázlatos folyamata APC MHC IMHC II CD8+ Citotoxikus T sejt CD4+ Helper T sejt Endogén fehérjék Exogén fehérjék Az MHC molekulák chaperonnak tekinthetők, amik az antigénből származó (konformáció nélküli) peptid fragmentumot elnyújtott, stabilizált, bemutatható állapotban tartják a prezentáló sejt felszínén. (animált ábra)

13 Ab1 Ab2 rejtett/feltárt determináns denaturáció új/neoantigén determináns konformációs determinánsok hasítás konformációs/lineáris determinánsok AZ ANTIGÉN DETERMINÁNSOK TÍPUSAI lineáris determináns konformációs determináns (TCR, BCR, Ig)(BCR, Ig) sejtfelszíni/hozzáférhető determináns WB  SDS hatására eltűnhet a konformációs determinánsok egy része, de előkerülhetnek rejtett determinánsok

14 Az LPS antigén vagy PAMP/DAMP? Antigén ha antigénreceptor v. ellenanyag ismeri fel PAMP ha mintázat felismerő receptor ismeri fel TLR4 MD2 LPS Fc Az LPS molekula egy glökózamin epitopját specifikusan felismerő ellenanyag Fab

15 A B sejtek antigén általi aktivációja gyakran csak segítő T sejtek jelenlétében lehetséges Vannak olyan antigének (pl. poliszaharidok) amik nem prezentálódnak citokinek Mindkét sejt aktivációjával jár B sejt aktiváció, memória CD40 antigén CD40L

16 B SEJT T INDEPENDENS ANTIGÉN TI-1 T INDEPENDENS ANTIGÉN TI-2 A B SEJTEK AKTIVÁLÁSA A T SEJTEK KÖZREMŰKÖDÉSE NÉLKÜL – „Tímusz independens antigének” Az antigén különböző részei a BCR-hez és más sejtfelszíni receptorokhoz (pl. LPS-kötő receptor /CD14) egyidejűleg kötődnek Sűrűn elhelyezkedő, ismétlődő, azonos epitópok (pl. szénhidrát komponensek a mikroorganizmusok falában) BCR keresztkötéseket hoznak létre B SEJT AKTIVÁCIÓ (extra aktivációs szignál)(extenzív receptor aggregáció)

17 Baktériumok elleni immunizálásnál problémát jelent, hogy a vakcinában felhasználandó tisztított bakteriális poliszaharidok nem aktiválnak T sejteket, így nem jön létre memória B sejt válasz Ezért sok poliszaharid vakcinában a cukorláncokat immunogén fehérjéhez konjugálják, hogy T sejt dependens választ tudjon kiváltani. Egy ilyen célra használt fehérje a CRM197  módosított diftéria toxin (toxoid) (az eredeti fehérje egy aminosavát kicserélték (Glu  Gly) ami így nem toxikus) A toxoid megőrzi az immunogenitását és önmagában is képes lehet toxin ellenes blokkoló antitestek indukciójára. Gyakorlati példa (pl. Prevenar - pneumokokkusz vakcina) pneumokokkuszból származó poliszaharidok toxin Glu  Gly toxoid

18 B sejt poliszaharid segítő T sejt BCR TCRMHCII citokinek, CD40-CD40L toxoid toxoidból származó peptid A poliszaharid epitopot felismerő B sejt képes a hordozó fehérje peptidjeit prezentálni a T sejteknek poliszaharidot felismerő memória B sejtek (  ellenanyag termelő effektor sejtek)

19 hordozó + haptén Kis méretű molekulák, amelyek önmagukban nem képesek immunválaszt indukálni (pl. gyógyszerek, reaktív vegyületek) haptén (i.e. DNP: dinitrofenil) - + HAPTÉNEK haptén immunizált

20 hordozó specifikus haptén specifikus hordozó+haptén specifikus hordozó+haptén ellenanyag/antitest A HORDOZÓHOZ KÖTÖTT HAPTÉNEK ELLEN IRÁNYULÓ ELLENANYAGOK TÍPUSAI

21 SZUPERANTIGÉNEK Olyan mikrobiális fehérjék, melyek APC jelenlétében több – megfelelő TCR-t hordozó – T-sejthez tudnak kötődni és aktiválják azokat, s ezáltal poliklonális aktiválást eredményeznek

22 SZUPERANTIGÉNEK OsztályozásForrás Endogén Exogén B sejt 1.Mouse mammary tomor virus (MMTV) 2.Epstein-Barr virus (EBV) 1.Staphylococcal enterotoxins (SEs): A, B, C1 to C3, D, E, G to Q 2.Staphylococcal toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1) 3.Staphylococcal exfoliative toxins: exoliatin A, exfoliatin B 4.Staphylococcal enterotoxin-like toxins formed due to recombination within enterotoxin gene cluster: U2, V 5.Streptococcal pyrogenic exotoxins (SPEs): A1 to A4, C, G to M 6.Streptococcal mitogenic exotoxins: SMEZ 7.Streptococcal superantigen :SSA 8.Yersinia pseudotuberculosis: Yersinia pseudotuberculosis-derived mitogen (YAM) 9.Mycoplasma species: Mycoplasma arthritidis-derived mitogen (MAM) 10.Cholera toxin: subunit A of cholera toxin 11.Prevotella intermedia* 12.Mycobacterium tuberculosis* 13.Viral superantigens: (a) Mouse leukemia virus (b) IDDMK1222- Ppol-ENV-U3 (c) HIV-Nef (d) Rabies virus-nucleoside protein 1.Staphylococcal protein A 2.Protein G 3.Protein Fv (PFv).

23 Szuperantigének Konvencionális Antigén Monoklonális/Oligoklonális T sejt válasz 1: :10 5 (10 7 / Szuperantigén Poliklonális T sejt válasz 1:4 - 1: / ) Fehérjék, melyek több – megfelelő TCR-t hordozó – T- sejthez tudnak kötődni és aktiválják azokat. aktivált T sejt

24 Az immunglobulinok szerkezete és funkciója

25 Immunoglobulinok (glikoproteinek) Mobilitás alapján gamma-globulin Immunológiai funkció alapján antigén-specifikus fehérjék B sejt membránban antigén felismerő receptor BCR – B sejt receptor Testfolyadékokban (pl. szérum) ellenanyagok, antitestek

26 Az immunoglobulin szerkezete Könnyű és nehéz láncok (ember, egér) Diszulfid hidak –láncok közötti –láncon belüli C H1 VLVL CLCL VHVH C H2 C H3 kapocs régió szénhidrát komplement aktiváció Fc receptorhoz kötés Variabilis és konstans régiók Kapocs régió Domének –V L & C L –V H & C H1 - C H3 (C H4 pl. IgM) Oligoszaharid diszulfid híd

27 HIPERVARIÁBILIS RÉGIÓK nehéz lánc hipervariábilis régiója könnyű lánc hipervariábilis régiója nehéz lánc könnyű lánc

28 Ribbon structure of IgG

29 Az immunglobulinok enzimes hasítása segített a szerkezet és funkció sajátságainak vizsgálatában antigén- kötés komplement kötő hely placentális transzfer kötődés az Fc receptorokhoz

30 Immunoglobulin fragmentek: Struktúra/Funkció összefüggések Fab –Ag kötés (valencia=1 monovalens) –Specificitást a V H és a V L domének határozzák meg Papain Fc Fab Fc –Effektor funkciók VHVH VLVL

31 Pepszin Fc peptidek F(ab’) 2 Immunoglobulin fragmentek: Struktúra/Funkció összefüggések F(ab’)2 –Antigén kötés bivalens! valencia=2 + Az effektor funkciók egy részét nem képes indukálni, de képes lehet pl. agglutinációra/precipitációra

32 Miért szükséges az Fc régió? felismerni az antigént precipitálni az antigént (bivalencia!) blokkolni a toxinok vagy patogénnel asszociált molekulák aktív helyét (neutralizáció) blokkolni a gazdasejt és a patogénnek molekulái közötti kölcsönhatásokat (neutralizáció) az F(ab’) 2 fragmentum képes sejtekkel kapcsolatos gyulladásos és effektor funkciókat a komplement rendszer gyulladásos és effektor funkcióit fagocitózist és az azt követő antigén prezentációs folyamatokat de Fc régió hiányában nem képes aktiválni

33 OSZTÁLY/ALOSZTÁLY ANTIGÉNKÖTŐ HELY A H-lánc (nehézlánc) konstans régiójának típusai, eltérő aminosav szekvencia Ig osztályok: IgG, IgA, IgE, IgD, IgM; alosztályok: IgA1-2, IgG1-4 (könnyűlánc izotípusok: κ, λ) A H- és L-lánc variábilis (V) régióinak egyedi szekvencia variabilitása (klón-specifikus) (Ez felel a sokféle antigén specifikus megkötéséért!) A konstans szekvenciákban található allélikus változatok IgG – Gm allélek Egyeden belüli típusok Egyeden belüli különféle antigéneket felismerő változatok Egyedek közötti változatok

34 Humán Immunglobulin Osztályok IgG - gamma (  ) nehézláncok IgM - mü (  ) nehézláncok IgA - alfa (  ) nehézláncok IgD - delta (  ) nehézláncok IgE - epszilon (  ) nehézláncok könnyűlánc típusok kappa (  ) lambda (  ) Izotípusok!

35 Szabad IgM pentamer (”csillag”) Antigénhez kötött IgM (”rák”)

36 ELLENANYAGOK IZOTÍPUSAINAK JELLEMZÉSE 2.

37 szekunder válasz az A antigénnel szemben primer válasz az A antigénnel szemben ellenanyagszint napok primer válasz a B antigénnel szemben Izotípusok a primer és szekunder immunválasz során

38 Az ellenanyag termelés az első és a második immunválasz során növekvő szérum ellenanyag titer hetek X-antigén első X-ellenes válasz X-antigén második X-ellenes válasz alacsony magas antigénfüggő x erősebb az első válasznál A B-sejt antigénnel való találkozásáig eltelt idő Az antigénnel való találkozás és a válasz csúcspontja között eltelt idő Az ellenanyagtermelés mértéke A termelt izotípusok Ellenanyag affinitás B-sejt típus Tulajdonság első válasz második válasz

39 Izotípusváltás a B-sejt fejlődése során

40 ANTIGÉNKÖTÉS

41 Az antigén determináns és az ellenenyag antigénkötő ”zsebe” közötti kölcsönhatás elve

42 Az „Fab-lizozim” komplex röntgenkrisztallográfiás képe A különválasztott komponensek felszíni képe. Piros Piros szín jelzi az Fab-lizozim komplex kölcsönhatásban résztvevő oldalláncait.

43 HIPERVARIÁBILIS RÉGIÓK nehéz lánc hipervariábilis régiója könnyű lánc hipervariábilis régiója nehéz lánc könnyű lánc

44 Complementary Determining Region (CDR) aminosav pozíció az Ig-lánc szekvenciájában Variábilitás (a különböző aminosavak száma)

45 Valencia: az antitestnek az antigénnel kialakított kapcsolatainak száma Affinitás: egy adott antigén és antigénkötő hely kapcsolatának erőssége Aviditás: az adott antitest összes kötőhelye affinitásainak „eredője” (nem az összege) sztérikus hatás Az ellenanyag-antitest kötődés jellemzése

46 Az antigén kötés önmagában védő funkciót láthat el: NEUTRALIZÁCIÓ sejtkárosodás sejtvédelem vírusok, baktériumok, toxinok (bakteriális, rovar v. kígyóméreg)

47 KÖTŐDÉS AZ Fc-RECEPTOROKHOZ

48 komplex antigén ellenanyag kötődve a komplex antigénhez ellenanyag Effektor sejt aktiválás Effektor sejt aktiválás (A) A nagy affinitású Fc-receptor a sejt felszínén monomer Ig-t köt, mielőtt az az antigénhez kapcsolódna. (A) A nagy affinitású Fc-receptor a sejt felszínén monomer Ig-t köt, mielőtt az az antigénhez kapcsolódna. (pl. Fc  R – IgE) kis affinitású Fc-receptor (B) A kis affinitású Fc-receptor a már multivalens antigénhez kapcsolódó Ig-kat köti meg. (pl. Fc γ R – IgG) Fc  R – IgE Fc  R – IgG+Ag

49 OPSZONIZÁLÁS OPSZONIN NÉLKÜL OPSZONINNAL IDŐ fagocitózis FAGOCITÓZIS

50 (NK SEJT DEGRANULÁCIÓ) Az ellenanyag kötődis a sejtfelszíni antigénhez Az NK sejtek receptorai érzkelik a kötött ellenanyagokat Az Fc-receptor keresztkötések aktiválják az NK sejt ölőmechanizmusait A célsejt apoptózissal elhal nagyméretű patogén ellenanyaggal borítva Citotixikus granulumok tartalmának ürítése membránkárosodás és nekrózis a patogén puszulásához vezet - Komplement aktiváció (következő alkalommal) - Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC)

51 HÍZÓSEJT DEGRANULÁCIÓ ellenanyaggal „felfegyverzett” hízósejt IgE-k keresztkötése a kapcsolódó patogénen/allergénen keresztül patogén eliminálása (allergiás tünetek) degranuláció

52 összefoglalva AZ ELLENANYAGOK EFFEKTOR FUNKCIÓI OPSZONIZÁCIÓ - FcR mediált funkciók - komplement aktiválás NEUTRALIZÁCIÓ !!!

53 MONOKLONÁLIS ELLENANYAGOK és POLIKLONÁLIS ELLENANYAGOK

54 A TERMÉSZETES ELLENANYAG VÁLASZ POLIKLONÁLIS Ag Immunszérum Poliklonális ellenanyag Ag B-sejt készlet Aktivált B-sejtek Ellenanyag termelő plazmasejtek Antigén-specifikus ellenanyagok (Több klón termékei, különféle epitopokat ismerhetnek fel)

55 Antigén specifikus ellenanyagokhoz legegyszerűbben immunizált élőlények szérumából juthatunk. Hosszú távon újabb és újabb immunizálást igényel. - Nehezen standardizálható - Limitált mennyiségben áll rendelkezésre (lásd a táblázatot hátrébb) Ha fel tudnánk szaporítani valamelyik B sejtet, ami „felismeri” az antigént (az anigén valamelyik részéhez kötődő ellenanyagot termel), sokkal egyszerűbb volna a helyzet. Monoklonális ellenanyagok előállítása Georges J.F. Koehler és Cesar Milstein (Nobel díj 1984-ben)

56 Antigén Poliklonális ellenanyagok Monoklonális ellenanyagok (animált ábra)

57 Monoklonális ellenanyagok  egyetlen B-limfocita klón termékei  homogének (antigénspecifitás, affinitás, izotípus)  előnye a poliklonális ellenanyaggal szemben, hogy a meghatározott specificitású és izotípusú ellenanyagok nagy mennyiségben és azonos minőségben állíthatók elő - „in vivo” patológiás körülmények között is előfordulhat pl. mieloma multiplex esetében egy B sejt klón malignus szaporulata miatt nagy mennyiségű monoklonális ellenanyag lehet jelen („gammopátia” – rendelleneség a gamma globulin szérum frakcióban) osztódóképes – tenyészthető, egyféle ellenanyag termelő sejteket kellene előállítani

58 A szérum elektroforézise monoklonális fehérje jelenlétét mutatja ki, amely további vizsgálattal lambda-könnyűláncú IgG-nek bizonyult. normál szérum a beteg széruma Myeloma multiplex

59 Lehetőségek? Transzformáció vírussal-A vírus ott lesz a termékben is Fúzió immortális sejtvonallal -Kevés jó fúziós partner létezik

60  számunkra értékes tulajdonsággal rendelkező, de korlátozott élettartamú immunsejtet kiválasszuk, és korlátlan ideig fenntarthatóvá, szaporíthatóvá tegyük.  lényege, hogy antigén specifikus immunsejteket fuzionáltatunk korlátlanul szaporodó tumorsejtekkel. A kapott hibridek közül számunkra azok értékesek, amelyek kromoszomálisan stabilak, rendelkeznek az adott immunsejt tulajdonságaival (ellenanyag- vagy citokin-termelő* képesség) és korlátlanul szaporodnak. ( * pl. antigén specifikus, citokin termelő, T sejt hibridómák is létrehozhatóak)  A megfelelő hibrid sejteket többlépéses szelekció végeredményeként, sejtklónok formájában kapjuk meg. Monoklonális ellenanyagok előállítása (Több módszer is létezik. A leg elterjedtebb: egér SP2 sejtvonallal végzett sejtfúzió alapú „hibridóma” módszert tekintjük át a következőkben) A hibridóma technika lényege

61 Monoklonális ellenanyag előállítás menete Vázlatosan - egér/patkány beoltása antigénnel - a célsejteket tartalmazó lép vagy nyirokcsomók izolálása, homogenizálása - lépből származó plazmasejtek és B-sejt eredetű egér tumorsejtek (plazmacitóma/ mielóma sejtek) fúziója - Az ellenanyag termelő klónok szelekciója/azonosítása (több lépésben) A létrejövő hibridómák folyamatosan szaporodnak és ellenanyagot termelnek, ami a tápoldatukból kinyerhető

62 lépsejtmielómasejt (SP2) Napok alatt maguktól elpusztulnak Szaporodó sejtek Sejtfúzió (animált ábra) PEG, Sendai virus, mikromanipulátor+nagyfrekvenciás elektromágneses mező

63 mielómasejt (SP2) Szaporodó sejtek Szelektív tápfolyadék („HAT”) érzékeny HGPRT + TK + lépsejt 1. szelekciós lépés HGPRT - TK - (animált ábra) a normál sejtek napokon belül elpusztulnak

64 Antigén specifikus ellenanyagot termelő hibridek Nem antigén specifikus ellenanyagot termelő, vagy ellenanyagot nem termelő hibridek 2. Szelekciós lépés: Az ellenanyag termelő sejtek kiválasztása Vannak a sejtkultúrában az antigénnel reagálni képes ellenanyagok. Nincs jelen az antigénnel reagálni képes ellenanyag. Eldobjuk Tovább tenyésztjük, sejtklónozzuk. (animált ábra)

65 A sejtklónozás célja Különféle monoklonális ellenanyagokat termelő B sejt hibridóma klónok közül az antigénre specifikusakra van szükségünk (ellenőrzés pl. ELISA módszerrel – lásd a későbbi gyakorlatokon) (animált ábra) A kapott hibridómák összessége poliklonális ellenanyag keveréket termel, melyek között kevés az antigén specifikus

66 A „HAT” szelekció biokémiája Hipoxantin, Aminopterin, Timidin tartalmú tápfolyadék nukleotid prekurzor gátlószer A szelektív tápfolyadék:

67 ”de novo” útvonal ”salvage” útvonal aminopterin nukleozid trifoszfátok DNS ”elemi” építökövek, egyszerü szerves anyagok, aminosavak, cukrok egyéb enzimek nukleinsav lebontási termékek felhasználása, purinok, hipoxantin, timin HGPRT, TK (hipoxantin guanin foszforibozil transzferáz, timidin kináz) A DNS szintézis két fő útja (animált ábra) Az SP2 mielóma sejtekben csak ez az útvonal működőképes!

68 A fúziós partner SP2 sejtvonalnak nincs saját ellenanyag termelése, és nincsenek HGPRT és TK enzimei. Ez teszi ideális fúziós partnerré! Technikai nehézségek: A transzformált sejtvonalak sajnos gyakran genetikailag instabilak. Ez a létrehozott hibridómákra is igaz. Rendszeresen ellenőrizni kell az ellenanyag termelésüket és antigénspecificitásukat – adott esetben újraszelektálni/klónozni Megtörténhet, hogy az SP2„magához tér”és aktív HGPRT és TK jelenik meg benne! Az ilyen SP2 sejtektől egy másik fajta szelekcióval szabadulhatunk meg:

69 ”Abortív” hipoxantin és timidin analógokkal HGPRT - és TK - fúziós partner sejtek szelektálhatóak Ezek a pirimidin és purin vegyületek a HGPRT + vagy TK + sejtek esetében osztódáskor a ”salvage” útvonalon az örökítőanyagba épülve a sejtek pusztulásához vezetnek, élve hagyva a HGPRT - TK - sejteket. Hogyan hozható létre/tartható fent a HGPRT -, TK - (defficiens) fúziós partner sejtvonal?

70 Poliklonális ellenanyag Kis affinitású Monoklonális Ea. Nagy affinitású Monoklonális Ea. Felismert antigén determinánsok száma többegy Specificitás (keresztreaktivitás) polispecifikusgyakran polispecifikusmonospecifikus Affinitáskicsi-nagy (keverék) kicsinagy Nem-specifikus immunglobulinok koncentrációja magasalacsony (0) Hozam (koncentráció)magasalacsony Előállítási költségalacsonymagas Standardizálhatóságnem, ill. nehézkesegyszerű Mennyiséglimitáltkorlátlan Gyakorlati felhasználhatóság módszer függőgyengekiváló A poliklonális és monoklonális ellenanyagok összehasonlítása

71 Monoklonális ellenenyagok általános felhasználási lehetőségei - Immundiagnosztika (tumordiagnosztika - tumor spec mEA-gal) - Sejttípusokra jellemző markerek azonosítása (differenciációs, aktivációs markerek) Immunhisztokémia Lymphomák tipizálása CD markerek segítségével - Sejtek elválasztása (pozitív – negatív szelekció –FACS, Panning, vasszemcsék mágneses térben) CD34+ csontvelői őssejtek gyűjtése autológ/allogén transzplantációhoz perifériás vérből - Vércsoport meghatározás (anti-A, anti-B, anti-D ellenanyagokkal) - Komplex antigén keverékek analizálása (Western, ELISA……) - Sejtfelszíni és oldott molekulák funkcionális vizsgálata T-sejt aktiváltsági állapot vizsgálata / gátlása - Célzott kemoterápia CD20+ B-sejtek elleni antitestek B-sejtes Non-Hodgkin lymphomában Szervátültetés utáni kilökődés megakadályozása célzott T-sejt gátlással Kovalensen kapcsolt, liposzómába zárt toxin - Gyógyszer-eliminálás antitestekkel Digoxin-intoxikáció esetén digoxin ellenes antitestek

72 Monoklonális ellenenyagok felhasználási lehetőségei a klinikai gyakorlatban DIAGNOSZTIKA Vércsoport meghatározás (anti-A, anti-B, anti-D ellenanyagokkal) Komplex antigén keverékek analizálása (szérumból, liquorból, …) Sejttípusokra jellemző markerek azonosítása Immunhisztokémia Limfómák tipizálása CD markerek segítségével TERÁPIA Sejtek elválasztása CD34+ csontvelői őssejtek gyűjtése autológ/allogén transzplantációhoz perifériás vérből Sejtfelszíni és oldott molekulák funkcionális vizsgálata Sejt aktiváltsági állapotának vizsgálata Célzott kemoterápia CD20+ B-sejtek elleni antitestek B-sejtes Non-Hodgkin limfómában Szervátültetés utáni kilökődés megakadályozása célzott T-sejt gátlással

73 VÉDETT EGYÉN szérum ellenanyag (pl. véradás  vérkészítmény) Humán immunglobulin transzgenikus egér immunizálás egér monoklonális ellenanyagok immunizálás humán monoklonális ellenanyagok humanizált, egér monoklonális ellenanyagok Passzív immunizálás I. VESZÉLYEZTETETT EGYED Az adaptív immunrendszer nem aktiválódik Azonnal hat Átmeneti védelem/hatás (Immunoglobulin lebomlás!)

74 Passzív immunizálás II. TípusAlkalmazás Intramuszkuláris (kis mennyiségben jut be, kevésbé hatékony) HBV-Ig; Varicella-Zoster-Ig; Anti-D profilaxis Intravénás (IVIG)Humorális immundefektusok (Bruton-féle agammaglobulinaemia; hypogammaglobulinaemiával járó variábilis és kevert immundefektusok ) Méreg elleni ellenanyagok (pl. kígyómarás) Természetes passzív immunizálás: Placentán átjutó IgG – újszülött védelme az első hónapokban Anyatej: IgA – emésztőrendszer és a felső légutak védelme

75 Monoklonális antitestek, mint beadható gyógyszerek? Az egérben termelődő antitestek emberbe oltva - fajidegen fehérjeként - immunválaszt indukálhatnak. (ld. immunogenitást meghatározó tényezők – filogenetikai távolság!) Hogyan kerülhető meg a probléma?

76 A monoklonális antitestek evolúciója Egér / Patkány Kiméra Humán Humanizált A humanizált ellenanyagok glikozilációja a termelő sejttípus (álalában egér) sajátságainak megfelelő. Létrehozhatók valódi humán monoklonális ellenanyagok humán hibridómák segítségével.

77 - Tumorterápia Lehetővé tették a célzott, szelektív kemoterápia következő lépcsőfokának elérését (Sejttípus-specifikus, de még mindig nem csak a malignus sejtekre specifikus!) -Immunszuppresszió Sejttípusra specifikus immunszuppresszió lehetősége Gyógyszerként alkalmazott monoklonális ellenanyagok

78 Monoklonális ellenanyagok a tumorterápiában 1.„Naked MAb”, nem konjugált antitest Anti-CD20 (rituximab – Mabthera/Rituxan, humanizált): B-sejtes Non-Hodgkin lymphoma Anti-CD52 (alemtuzumab – Mabcampath, humanizált): chronicus lymphoid leukaemia (3. vonalban, chlorambucil és fludara rezisztens esetekben) Anti-ErbB2 (trastuzumab – Herceptin, humanizált): emlőtumor Anti-VEGF (bevacizumab – Avastin, humanizált): colorectalis tu. (+ Lucentis!) Anti-EGFR (cetuximab – Erbitux, kiméra): colorectalis tu. (+ Vectibix, rekomb. humán!) 2.konjugált antitest Anti-CD20 + yttrium-90 izotóp (ibritumomab- Zevalin) Anti-CD20 + jód-131 (tositumomab – Bexxar, kiméra!)

79 Immunszuppresszív ellenanyagok 1. 1.Anti-TNF-α antitestek infliximab (Remicade): 1998 óta, kiméra adalimumab (Humira): 2002, rekombináns humán 2.Etanercept (Enbrel) – dimer fúziós fehérje, TNF-α receptor + Ig Fc-vég (Nem monoklonális antitest, csak Ig Fc-véget tartalmaz!) Anti-TNF-α terápia indikációi: Rheumatoid arthritis Spondylitis ankylopoetica (SPA - M. Bechterew) Plakkos psoriasis, arthritis psoriatica Crohn-betegség, colitis ulcerosa (általában - még - nem 1. vonal!)

80 Terápiás monoklonális antitestek elnevezése A gyógyszerként használt monoklonális antitesteket generikus névvel illetik. A nevezéktan sémáját a WHO határozza meg. A nevezéktan részei: Például:Abciximab  ab- + -ci(r)- + -xi- + -mab, egy kardiovaszkuláris megbetegedésekben használt monoklonális kiméra ellenanyag.Abciximab

81 virus-v(i)--vi(r)- miscellaneous tumor-tu(m)- prostate tumor -pr(o)- melanoma-me(l)- mammary tumor-ma(r)- ovarian tumor-go(v)- testicular tumor-go(t)- colonic tumor -t(u)- -co(l)- toxin-tox(a)--toxa- bone-s(o)--o(s)- rat/mouse hybrid (see trifunctional antibody)trifunctional antibody -axo- nervous system-n(e)-*-ne(u)(r)- chimeric/humanized hybrid-xizu-*musculoskeletal system—-mu(l)- humanized-zu-immune system-l(i)--li(m)- chimericchimeric (human/foreign)-xi-inflammatory lesionslesions—-le(s)- human-u-interleukin-k(i)--ki(n)- mouse-o-fungus-f(u)--fu(ng)- primate-i-circulatory system-c(i)--ci(r)- hamster-e-bacterium-b(a)--ba(c)- rat-a-angiogenesisangiogenesis (inhibitor)—-anibi- variable meaning newold Source substemTarget substemPrefix 'Suffix' (stem) -mab

82 -Muromonab-CD3 (OKT-3) egér IgG2a CD3 pan-T sejt antigén ellen, szervátültetést megelőzően vagy követően alkalmazott immunszupresszív kezelésre; ma már ritkán használják (fajidegen fehérje!); humanizált változatával I-es típusú diabetes mellitusban folynak vizsgálatok -Omalizumab (Xolair): IgE elleni humanizált IgG1k monoklonális antitest Ind.: allergiás asthma, Churg-Strauss szindróma -Daclizumab (Zenapax): IL-2 receptor elleni, humanizált antitest. Ind.: transzplantációt követően kilökődési reakció ellen, T-limfocita aktivitás gátlására -basiliximab (Simulect): mint daclizumab, de kiméra! -efalizumab (Raptiva): anti-CD11a, humanizált, ind.: psoriasis Immunszuppresszív ellenanyagok 2.

83 Regisztrált molekulárisan irányított szerek NévTípusTámadás- pont Indikáció Alemtuzumab (Mabcampath) Daclizumab (Zenapax) Basiliximab (Simulect) Rituximab (Rituxan/Mabthera) Trastuzumab (Herceptin) Gemtuzumab Ibritumomab (Y 90 ) Edrecolomab Gefitinib Imatinib Monoklonális Ab, humanizált Monoklonális IgG1, kiméra Monoklonális IgG1, humanized Monoklonális IgG4, humanized Calicheamicinnel konjugált Monoklonális IgG1, egér Monoklonális IgG2, egér EGFR-TKI KIT-TKI CD52 IL-2 R CD20 HER2/neu CD33 CD20 EpCAM EGFR TK TK CLL, CML rák, leukémia rák, limfóma emlő-, prosztatarák, NSCLC rák, leukémia rák, limfóma CRC NSCLC GIST, CML

84 Radio-immunotherápia Pl. Zevalin, Bexxar – monoklonális + izotóp Antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) Az antitesthez enzimet kötnek, mely a később szisztémásan bevitt, ártalmatlan prodrug vegyületet lokálisan alakítja a citotoxikus, hatékony metabolittá Immuno-liposzómák Liposzómába csomagolt nukleotidok vagy gyógyszer célzása monoklonális antitestekkel (pl. tumorszuppresszor gének bevitele, szövetspecifikus génbevitel) Nem immunológiai célpontú manipulációk pl. abciximab (ReoPro): thrombocyta-aggregatio gátlása További lehetőségek monoklonális ellenanyagok terápiás felhasználására

85 Ellenanyag tisztítás antigén immunszorbensen (Affinitás kromatográfia) oszlop polimer gyöngyök rákötött antigének oszlop töltelék affinity purifed antibody : a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják.

86 tisztítandó ellenanyagok hozzáadása kötődés elúció mosás Antigén specifikus poliklonális ellenanyag (animált ábra)

87 Fehérje(antigén) tisztítás ellenanyag immunszorbensen polimer gyöngy hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok oszlop oszlop töltelék Fordítva is összeállítható a rendszer: Tisztítandó oldat felvitele Kötődés Mosás Elúció Tisztított antigén (animált ábra)

88 Immunprecipitáció (Nem azonos az antigén- ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos immunológiai reakcióknál tárgyalt precipitációs jelenséggel!!!)

89 gyakorlati rész

90 A POLIKLONÁLIS ELLENANYAG VÁLASZ Ag Immunszérum Poliklonális ellenanyag Ag B-sejt készlet Aktivált B-sejtek Ellenanyag termelő plazmasejtek Antigén-specifikus ellenanyagok

91 Immunoszorbens Oszlop sepharose gyöngyök BSA

92 Tisztítandó nyúl szérum hozzáadása Inkubáció (animált ábra)

93 Coomassie Brillant Blue G250 festék Nem kötődő fehérjék lemosása PBS Ha nem jön le több fehérje (pl. aspecifikus ellenanyag), a Coomassie festék barna marad. (animált ábra)

94 4-5 ml glicin-HCl pufferrel mosni Kötődő ellenanyagok eluálása az oszlopról TRIS-t tartalmazó csövekbe gyűjtjük 9-10 cseppenként a frakciókat, hogy a pH neutralizálódjon Arról, hogy a farkciószedés közben és végén az oszlopról jön-e még le fehérje, egy-egy Coomassie Brillant Blue-t tartalmazó csőbe cseppentéssel győződhetünk meg (animált ábra)

95 Monoklonális ellenanyagokat a sejtkultúra folyadékból („felülúszóból”) Bakteriális protein A v. protein G oszlopokkal lehet hatékonyan tisztítani. Protein A, Protein G  az ellenanyagok Fc részét kötik meg (a baktérium így is védekezik az ellenanyagok általi felismerés ellen: lekötött Fc rész  nincs effektor funkció)

96 Felező hígítások Újra klónozás limitált hígításos módszerrel (gyorsklónozás): 1. a hibridóma sejteket megszámoljuk lyukú szövettenyésztő lemezre lyukanként 100  l tápfolyadékot kimérünk, majd az első lyukába (A1) sejtet 100  l-ben hozzáteszünk. Belőle felező hígításban a szövettenyésztő lemez-en lefelé, majd oldalirányban is hígítást végzünk: 100  l tápfolyadék/lyuk található a szövettenyésztő lemezen; Az első oszlopban a sejteket tartalmazó (A1-es) lyukból kivett 100ul sejtszuszpenziót hígítjuk lépésekben lefelé, majd az első oszlop lukait 200  l-re kiegészítjük. Ezután sokcsatornás pipettával hasonló módon sorozathígítást végzünk oldalirányban is) A szövettenyésztő lemez jobb alsó részén, így nagy valószínűséggel lesznek olyan lukak, amelyekbe csak 1 db sejt került. Felező hígítások

97 a megszámolt sejtek száma × 10 4 × a korábbi hígításokkal =sejtszám/ml 25 négyzet (pirossal jelölve egy példa) vagy a hármas vonalak által a halványpirossal jelölt módon határolt terület nagysága: 1 mm 2 A fedőlemez és a kamra felület távolsága: 0.1 mm Az így kapott térfogat: 0.1 mm 3 = cm 3 (ml) Bürker kamra


Letölteni ppt "ANTIGÉN, ELLENANYAG -immunogenitás, tolerogenitás -antigén fogalma -epitop (B-, T-sejt epitop) -haptén -hordozó -antigén prezentáció -T independens antigének."

Hasonló előadás


Google Hirdetések