Animált bemutató, ajánlott bekapcsolni a diavetítést (pl. az F5-öt megnyomni) Utána szóközzel v. PageUp PageDown gombokkal léptetni.

Az előadások a következő témára: "Animált bemutató, ajánlott bekapcsolni a diavetítést (pl. az F5-öt megnyomni) Utána szóközzel v. PageUp PageDown gombokkal léptetni."— Előadás másolata:

1 Animált bemutató, ajánlott bekapcsolni a diavetítést (pl. az F5-öt megnyomni) Utána szóközzel v. PageUp PageDown gombokkal léptetni

2 A koncentráció meghatározása Valamilyen indikátor mennyiségi jellemzője utal a koncentrációra pl:  szín (abszorbancia, optikai denzitás)  fluoreszcencia  sejtszám (pl. növekedési hormon koncentráció meghatározása) Számszerűsíthető értéket ismert koncentrációjú mintával való összehasonlítás segítségével kaphatunk (standard) A sztenderddel összehasonlítás alapja: Ha két minta abszorbanciája azonos  koncentrációjuk is azonos DE EZ CSAK RÉSZBEN IGAZ!!!!

3 koncentráció 1000 500250125 623116 7.83.91.9 0.970.490.240.12 0.0300.0610.0070.0150.004 0 Ismeretlen koncentrációjú minta OD A standard hígítási sora (szigmoid görbe) Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne ? Az összehasonlíthatósághoz az ismeretlen mintából is hígításokat kell csinálni! Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani.

4 OD Becslés „vonalzóval” standard koncentráció (µg/ml) (felező hígítás (log)) Az a tartomány, ahol az abszorbancia arányos a koncentrációval 2X4X8X16X32X64X128X256X Ismeretlen minta hígításai 1000 500250125 623116 7.83.91.9 0.970.490.240.12 0.0300.0610.0070.0150.0040.002 azonos OD-hoz tartozó pontok A két csőben azonos a koncentráció Az 1.9μg/ml-re hígított standard megfelel a… … 128-szorosra hígított ismeretlen mintának Tehát az (eredeti hígítatlan) ismeretlen minta koncentrációja: 1.9x128 = 243.2μg/ml

5 OD standard koncentráció (µg/ml) (felező hígítás (log)) 2X4X8X16X32X64X128X256X Ismeretlen minta hígításai 1000 500250125 623116 7.83.91.9 0.970.490.240.12 0.0300.0610.0070.0150.0040.002 Ha felírjuk az egyenes szakaszok egyenleteit, eltehetjük a vonalzót, és elővehetjük a számítógépet y std =mx+b Y minta =mx+b Vegyük észre, hogy az x tenglyek eltérő skálázása miatt (piros ill. kék feliratok), a két egyenes nem párhuzamos egymással!

6 Durva hibák Tudatában kell lenni, hogy milyen abszorbancia érték tartományban használhajuk fel az OD értéket, ha egy egyenletbe szeretnénk visszahelyettesíteni, és az alapján koncentrációt számolni! Hígítási görbe Illeszett egyenes, egyenlettel y=mx+b  OD=m(koncentráció)+b OD koncentráció Bármely töménységű oldat kellően nagy hígításának OD-je erre a részre fog esni. Az egyenletbe ezt az OD értéket behelyettesítve, és ez alapján a hígítást is figyelembevéve (visszaszorozva), óriási – hamis! – koncentációt kapunk eredményül Hasonló mondható erről az értékről is A felhasználható OD értékek ebbe a tartományba esnek

7 Hígítási görbe OD koncentráció A felhasználható OD értékek ebbe a tartományba esnek Ne erőltessük az egyenes illesztést ott ahol felesleges hibásan illesztett egyenes Az egyenest is ezekre a pontokra kell illeszteni

8 Vegyük észre, hogy a hígítás/koncentráció tengelye a korábbi ábrákon logaritmikus ábrázolású volt! Ugyanannak a sorozathígítással kapott mérésnek az ábrázolása: Normál (lineáris) hígítási tengellyelLogaritmikus hígítási tengellyel A jó ábrázolás segít a kiértékelésben, segíti megtalálni azokat a pontokat, amikre egyenes illeszthető!

9 124816326412825651210242048 hígítás: 01234567891011 hígítás 2 x : =

10 A jó ábrázolás segít a kiértékelésben Próbáljuk meg meglátni a hígítási sorozatokban a „szigmoid görbe” megfelelő részeit, és ennek megfelelően illeszteni az egyenest

11 A gyakorlatban csak ritkán adatik meg, hogy szép sztenderd hígítási görbével dolgozhassunk. Az ismeretlen mintából sem szokás teljes szigmoid görbét kiadó hígítási sorozatot készíteni. Általában csak 2-3 féle hígítást készítünk belőle. 1x2x4x8x16x32x64x128x OD 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 standard (1x: 100  g/ml) hígítás az ismeretlen minta hígításai hígítás1x10x100x OD4.02.11.1 érzékenységi küszöb körüli érték 2.1 kb. 5 (a pontos érték kiszámításához pl. a két pont közti egyenes egyenletét lehetne felhasználni) 100/5 = 20  g/ml az ismeretlen 20x10 = 200  g/ml

12 Ebben a példában a hígítatlan (1x) ismeretlen minta OD értéke valószínűleg nem lett volna használható. 1x2x4x8x16x32x64x128x OD 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 standard (1x: 100mg/ml) hígítás az ismeretlen minta hígításai hígítás1x10x100x OD4.02.11.1 4.0 A 4.0 OD érték körüli érték a legtöményebb sztenderd hígítási pont! Lehet, hogy a sztenderd hígítási görbe valójában más lefutású! pl. ha a hiányzó 2x hígítás ide esik Ez a szigmoid görbe felső plató része! Felhasználjuk-e a megmaradt adatpontot?