Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

7. hét Gyakorlat ELISA Elsődleges antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "7. hét Gyakorlat ELISA Elsődleges antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek."— Előadás másolata:

1 7. hét Gyakorlat ELISA Elsődleges antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek

2 Mindenki látott már ehhez hasonló diagnosztikai eszközöket, vagy ha nem, találkozni fog velük későbbi pályafutása során pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből (terhességi teszt) Ezek az eszközök is az ELISA esetében már megismert elsődleges antigén-ellenanyag specifikus kapcsolódását kihasználó technikán alapulnak!

3 ELISA alaptípusok (ismétlő áttekintés) egyszerű capture/szendvics antigén Ag specifikus ellenanyag detektor/reporter ellenanyag kompetitív pl. antigén specifikus ellenanyagok kimutatásához antigén Ag specifikus csapda ellenanyag Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag antigének kimutatásához az oldatban jelen van a kimutatandó Ag Ag specifikus ellenanyag antigének kimutatásához, ha csak egyféle specifikus ellenanyagunk van, vagy Ag spec. ellenanyagok kimutatásához az egyszerű módszernél nagyobb érzékenységgel antigén nincs jelen oldott Ag

4 Bioaktív anyagok kimutatása hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása szendvics technikával vagy kompetíciós tesztekkel

5 hCG kimutatása immunkromatográfiás tesztcsíkkal nitrocellulóz membrán jelölt ellenanyagokkal átitatott üvegfilter (A jelzés szabad szemmel is látható!) elölnézet oldalnézet hCG csapda ellenanyag sáv kontroll ellenanyag sáv abszorbciós rész (cellulóz, papír) abszorbciós lap, mintafelviteli rész vizeletminta

6 hCG csapda ellenanyag sáv kontroll ellenanyag sáv jelölt ellenanyagok hCG kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok

7 hCG sáv ( kikötött hCG) kontroll ellenanyag sáv a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG Ugyanez kompetitív rendszerben

8 Az ellenanyagon található jelzés szabad szemmel is megfigyelhető, így nincs szükség enzimes folyamatokra, és egyéb reagensekre: kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek) festékkel töltött latex gyöngyök Pl.: kompetitív immunkromatográfiás tesztcsíkok aflatoxin detektálására Az eljárás szemikvantitatívá tehető Immunkromatográfiás tesztcsík egyéb felhasználási lehetőségei: élelmiszervizsgálat során toxinok kimutatása

9 Vírusfertőzések diagnosztikája Mivel szabad vírus antigének és vírus részecskék nem minden esetben detektálhatóak kellő hatékonysággal (pl. látencia), ezért helyette inkább a szervezetben képződött vírus specifikus ellenanyagokat mutatják ki a fertőzés diagnosztizálásakor. vírus antigénnel fedett ELISA lemezek készen kaphatóak a fertőzött személy szérumában található vírus specifikus ellenanyagok hozzákötnek az antigénhez emberi Ig specifikus jelölt ellenanyagok jelzik a specifikus ellenanyagok jelenlétét ilyen elven működik: Epstein-Barr Virus (EBV) teszt kit → EBNA-1 (EBV nukleáris antigén) segítségével mutatják ki az ellene termelt IgG-t HIV diagnosztikai kitben → rekombináns HIV antigénnel anti-HIV antitestek kimutatása vérből, plazmából, szérumból, vagy akár beszáradt vérfoltból Toxoplazmózis (Toxoplazma gondii – egysejtű parazita) → Toxoplazma elleni IgM kimutatás A toxoplazmózis terhesség során veszélyes, akkor ha az anya elsődleges fertőzésben szenved. Ekkor IgM típusú ellenanyagok termelődnek a fertőzés hatására, melyek transzplacentálisan nem szállítódnak és ezzel nem nyújtanak védelmet a magzat számára.

10 A pozitív HIV tesztet megerősítő vizsgálati módszerek: Western-blot: HIV-1 fertőzött CEM ( =T-sejt vonal) sejtvonal antigénjeinek Western-blotja. Az antigéneket tartalmazó blot-membránt a vizsgálandó szérummal inkubálják. A fertőzött személy szérumában található anti-HIV ellenanyag specifikus sávot (sávokat) eredményez a bloton. Legalább két burokfehérjét, vagy egy burokfehérjét és a p24 antigént kimutató sáv jelenléte esetén tekintik pozitívnak. Immunfluoreszcens vizsgálat: A teszt immortalizált, a felszínén HIV-1 antigéneket expresszáló T sejt vonalat használ. A sejteket tárgylemezre fixálják, és a vizsgálandó szérummal inkubálják, majd humán Ig specifikus fluoreszcensen jelölt másodlagos ellenanyagokkal jelölik. Negatív kontrollként nem fertőzött sejtvonalat használnak. A festődés mértékét és mintázatát összevetve a kontrollal erősítik meg a fertőzöttséget.

11 Autoimmunitás A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is hasonló módszerekkel detektálják Pl. SLE (szisztémás lupus erythematosus): Immunkomplex betegség, melyben számos autoantigén ellen kimutathatóak autoantitestek. A leggyakoribb anitest a kettős szálú DNS elleni antitest (az SLE-ben szenvedő betegek 60%-ában kimutatható). I típusú (autoimmun) diabetesz diagnosztikája a sziget sejt antigének elleni autoantitestek kimutatásával ELISA vizsgálat segítségével: glutaminsav dekarboxiláz (GAD65): a prediabetikus személyek 70-90% - ban és a diabetikus betegekben specifikus ellenanyagot találni ellene IA-2 (tirosine foszfatáz-szerű protein): az I típusú diabeteszes betegek % -ban és közvetlenül a betegség megjelenése előtti állapotban specifikus ellenanyagot találni. Ilyen ellenanyagok megtalálhatóak egyes GAD ellenanyag negatív személyekben is, ezért független diabetesz markernek tekinthető. inzulin: a legfőképp de nem kizárólagosan autoimmun diabeteszes fiatal gyermekekben (<5 éves) találni ellenanyagot, (megemlítendő, hogy ezek az ellenanyagok nem megkülönböztethetőek azoktól, melyek az inzulin terápia során a szervezetben termelődnek)

12 Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában (Hep-2), immunofluoreszcencia segítségével (indirekt jelölés)

13 Tumordiagnosztika A tumor specifikus(TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak Tumor antigén (pl. a beteg szérumából) Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor Ag specifikus csapda ellenanyaggal fedett felület (a kit része) Prosztata daganatok prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hipertrófiás és prosztatitiszes páciensekben. A PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával. Hasonlóan használható fel a prostatic acid phosphatase (prosztatinsav foszfatáz?) (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

14 Hólyagrák: Az epiteliális sejtek NMP22 nukleáris mátrix proteinje egészséges emberekben csak kis mennyiségben található meg a vizeletben → megemelkedése diagnosztikus marker Pajzsmirigy daganatok: A szérum tiroglobulin (hTG) megemelkedett szintje diagnosztikus marker Alpha Fetoprotein (AFP) : 68kD-os protein amit az embrionális máj és szikzacskó termel. Megjelenhet az anya szérumában is (transzplacentális transzfer). Születés utáni egy év alatt alacsony szérumszintre csökken le (<9ng/ml). Magasabb koncentrációja hepatómával, ovariális-, tesztikuláris- és preszakrális teratokarcinómákkal, de egyébb daganatokkal is összefüggésben lehet. Carcinoembryonic Antigen (CEA) sejtadhézióban vesz részt. Normális esetben az embrionális fejlődés során van csak jelen. Colorectális és egyéb carcinomát hordozó egyénekben megemelkedik a szérumszintje. Változásának nyomon követésével következtetni lehet a terápia hatékonyságára. Her-2/neu protein: 185 kD-os transzmembrán glikoprotein, tirozin kináz receptor. Az emlődaganatok %-ban a tumorsejtek megemelkedett mértékben expresszálják. Immunterápia során a működése blokkolható specifikus ellenanyaggal (Herceptin), ezért jelenlétét immunhisztokémiával, vagy immunfluoreszcenciás eljárással mutatják ki biopsziás mintákban.

15 Szérum ellenanyag izotípusok meghatározása A szervezetben jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok utalnak az antigén jelenlétére (lásd pl. vírusfertőzések diagnosztikájánál) Az így kimutaott ellenanyagok izotípusa utalhat arra, hogy friss, perzisztáló fetőzésről (IgM ellenanyag dominancia), vagy korábbi fertőzést követő memória válasz eredményéről van-e szó (IgG ellenanyag dominancia). Anti-izotípus specifikus ellenanyagokkal ez eldönthető Antigén IgM IgG anti-IgM anti-IgG Memória válasz Megemelkedett szérum IgE szintet tapasztalni atópia esetén, bizonyos autoimmun betegségekben, és egyes parazita fertőzések esetében Egyes immundeficienciákban az ellenanyag alosztályok koncentrációja eltér a normálistól (hiper IgM szindróma) (lásd a korábbi mielóma multiplex esettanulmányt is) ellenanyag capture-ellenanyag a szérum ellenanyaga izotípus specifikus ellenanyag

16 Gyakorlati rész:

17 A koncentráció meghatározása Valamilyen indikátor mennyiségi jellemzője utal a koncentrációra pl:  szín (abszorbancia, optikai denzitás)  fluoreszcencia  sejtszám (pl. növekedési hormon koncentráció meghatározása) Számszerűsíthető értéket ismert koncentrációjú mintával való összehasonlítás segítségével kaphatunk (standard) A sztenderddel összehasonlítás alapja: Ha két minta abszorbanciája azonos  koncentrációjuk is azonos DE EZ CSAK RÉSZBEN IGAZ!!!!

18 koncentráció Ismeretlen koncentrációjú minta OD A standard hígítási sora Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne ? Az összehasonlíthatósághoz az ismeretlen mintából is hígításokat kell csinálni! Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani.

19 OD Becslés „vonalzóval” standard koncentráció (µg/ml) (felező hígítás (log)) Az a tartomány, ahol az abszorbancia arányos a koncentrációval 2X4X8X16X32X64X128X256X Ismeretlen minta hígításai azonos OD-hoz tartozó pontok A két csőben azonos a koncentráció Az 1.9μg/ml-re hígított standard megfelel a… … 128-szorosra hígított ismeretlen mintának Tehát az (eredeti hígítatlan) ismeretlen minta koncentrációja: 1.9x128 = 243.2μg/ml

20 OD standard koncentráció (µg/ml) (felező hígítás (log)) 2X4X8X16X32X64X128X256X Ismeretlen minta hígításai Ha felírjuk az egyenes szakaszok egyenleteit, eltehetjük a vonalzót, és elővehetjük a számítógépet y std =mx+b Y minta =mx+b

21 Durva hibák Tudatában kell lenni, hogy milyen abszorbancia érték tartományban használhajuk fel az OD értéket, ha egy egyenletbe szeretnénk visszahelyettesíteni, és az alapján koncentrációt számolni! Hígítási görbe Illeszett egyenes, egyenlettel y=mx+b  OD=m(koncentráció)+b OD koncentráció Bármely töménységű oldat kellően nagy hígításának OD-je erre a részre fog esni. Az egyenletbe ezt az OD értéket behelyettesítve, és ez alapján a hígítást is figyelembevéve (visszaszorozva), óriási – hamis! – koncentációt kapunk eredményül Hasonló mondható erről az értékről is A felhasználható OD értékek ebbe a tartományba esnek

22 Bemutatás ELISA plate-ek IFN γ standard, és T sejt kultúrák felülúszójának hígítási soraival Melyik a töményebb minta? Próbáld meg kiszámolni a koncentrációt a kiosztott ELISA adatokból otthon! számolj a 3 párhuzamos adat átlagával használd a hígítás logaritmusát a hígítási görbe ábrázolásánál próbálj táblázatkezelő programot használni a feladat megoldásához (egy példa megoldását megtalálod az intézet honlapján a gyakorlatok között)


Letölteni ppt "7. hét Gyakorlat ELISA Elsődleges antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek."

Hasonló előadás


Google Hirdetések