Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Tisztaság kinyerés avagy visszanyerés hatékonysága A számunkra érdekes sejtek fizikai elválasztása a heterogén populációból A különböző sejtek eltérő tulajdonságai.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Tisztaság kinyerés avagy visszanyerés hatékonysága A számunkra érdekes sejtek fizikai elválasztása a heterogén populációból A különböző sejtek eltérő tulajdonságai."— Előadás másolata:

1 tisztaság kinyerés avagy visszanyerés hatékonysága A számunkra érdekes sejtek fizikai elválasztása a heterogén populációból A különböző sejtek eltérő tulajdonságai alapján történik a szétválasztás (már amennyiben az a tulajdonság megragadható – pl. intracelluláris antigének közti különbségekkel nem nagyon lehet mit kezdeni) fizikai – sűrűség, méret sejtbiológiai – adherencia, fagocitózis, érzékenység a közegre immunológiai – eltérő sejtfelszíni antigének Az immunrendszer sejtjeinek elválasztása áramlási citometria Kétféle alap hozzáállás: pozitív szeparáció – a kívánt sejtek megjelölése és elkülönítése a többitől negatív szeparáció – a nemkívánatos sejtek megjelölése, és megszabadulás tőlük

2 Ficoll-Paque sűrűség alapú sejtszeparáció perifériás vér vékony pipettával a sejtek alá töltött Ficoll centrifugálás szeparált, tisztított sejtek plazma ficoll vvt-k mononukleáris sejtek (MNS, PBMC) vérlemezkék granulociták mononukleáris sejteket tartalmazó „gyűrű” átpipettázása

3 Az adherens sejtek kinyerése vagy eltávolítása Olcsó, egyszerű, de csak az adherens sejtek elválasztására alkalmas, és alacsony tisztaságú

4 Ellenanyag ”panning” kitapasztott ellenanyagok

5 Komplement mediált lízis ellenanyagok komplement LÍZIS (A vörösvérsejtek enyhén hipotóniás ammónium-klorid pufferben lizálhatóak)

6 Mágneses sejtszeparálás (MACS) paramágneses szemcse specifikus ellenanyag Egyszerű mágneses sejtszeparálás Fagocita sejtek apró vasszemcséket képesek fagocitálni, ezután egy erős mágnessel elválaszthatóak más sejtektől

7 MACS

8 A sejteket jelölő mágneses részecskék nagyon kicsik, a sejtfunkciókat általában nem befolyásolják CD8+ T cells

9 Mágneses sejtszeparálás (MACS) MÁGNES oszlop Nem jelölt sejtek eltávolítása (negatív szelekció) jelölt sejtek kinyerése (pozitív szelekció) CliniMACS – zárt rendszerű

10 Áramlási/áramlásos citometria A fluoreszcens mikroszkópiához hasonlóan az immunofluoreszcenciai módszerek eszköztárába tartozik, felhasználásuk kiegészíti egymást Rendkívül nagy számú sejt egyedi vizsgálatára alkalmas FELHASZNÁLÁS: Sok sejtes populáció alkotóinak százalékos aránya (statisztikai adatok) Kis százalékban jelenlevő sejtek vizsgálata folyékony közegben, nagy sebességgel áramló egyedi sejteket vizsgál a fluoreszcens festékkel jelölt sejtek által kibocsátott fény intenzitását és a sejtek fényszórását detektálja morfológiai adatokat csak közvetetten szolgáltat (méret, granuláltsági állapot)

11 Áramlási citometria Az immunrendszer sejtjeinek többsége nem vagy csak lazán kötött formában található, ezért pl. sejtszuszpenzióban fluoreszcens antigén specifikus ellenanyagokkal jelölhető és sejtenként vizsgálható A sejtek nagy sebességgel egyenként áramlanak át a fényforrás fényén. A nagy sebességgel áramló nagyszámú sejt fényszórási és immunfluoreszcens sajátságai statisztikailag értékelhetők. Az immunfluoreszcens jellemzők nem csak kvalitatív, hanem kvantitatív eredményekkel is szolgálhatnak – nem csak egy antigén jelenlétére, hanem annak mennyiségére és így egyes kezelések utáni mennyiségi változására is következtethetünk belőle.

12 Az áramlási és az optikai rendszer elvi felépítése PMT 1 PMT 2 PMT 4 dikroikus tükrök sávszűrők Laser áramlási cella PMT 3 minta FSC detektor fotodióda fotoelektron- sokszorozó csövek

13 A citométer hidrodinamikai rendszere Injektor Fluoreszcens szignálok Fókuszált lézer sugár vivő folyadék akár 6-10m/s sebesség minta vivő- vagy köpeny folyadék Áramlási cella

14 Lézer Fluoreszcencia FALS Sensor FSC Fluoreszcencia detektorok (PMT3, PMT4, stb.) autofluoreszcencia - piridinek és flavinok jelenléte miatt

15 Becton Dickinson citométerek a ’80 –as ’90 – es évekből

16 asztali áramlási citométer szorter-áramlási citométer (FACS)

17 Az immunrendszer sejtjeinek jellemzése sejtfelszíni antigének alapján Az egyes sejttípusoknak jellemző sejtfelszíni antigén „mintázata” van. Diagnosztikus értékű lehet: - a sejttípusok jellemző százalékos arányának megváltozása - rendellenes sejtfelszíni markerek megjelenése - egyes markerek mennyiségének megváltozása, eltűnése Példák: - gyulladásos folyamatok – neutrofil granulociták számának növekedése - HIV progresszió, AIDS manifesztáció – CD4+ helper T sejtek számának csökkenése CD4+ : CD8+ = 1.6 Normál CD4+ T-sejt szám = 600 – 1400/  l HIV fertőzés  AIDS = CD4+ T sejt szám <200/  l - CD5+ B sejtek felszaporodása – B sejtes leukémiák egy része

18 WAS: Wiscott-Aldrich Syndrome (WAS protein defektus) XLA: X-linked Agammaglobulinemia (Btk defektus) B-sejtek fejlődésének megrekedése egyik jellemző tünet: CD19+ sejtek hiánya egyik tüneti jellemzője sok közül: CD43 expresszió csökkent v. hiányzik

19 CD antigénsejttípusfunkcióligand CD3T sejtek T sejt antigén receptor jelátvivő része (Intracelluláris kináz, foszfatáz) CD4helper T sejtek, (monociták, pDC) T sejt antigénreceptor koreceptora, (HIV receptor) MHC- II, HIV CD5T sejtek, (B sejt alpopuláció: B1) sejt adhézió, jelátvitel (kostimuláció) CD72 CD8citotoxikus T sejtek, (NK,  T sejt alpopuláció) T sejt antigénreceptor koreceptora MHC I CD14Monociták, makrofágok, granulociták egy része LPS receptor része LPS, LBP CD19B sejtek CR2 része, B sejt antigénreceptor koreceptora C3d, C3b CD28T sejtek kostimuláció (B7-1, B7-2) CD80, CD86 CD34hematopoietikus progenitor sejt (endotheliális sejtek) sejt adhézió CD62L (L-szelektin) CD56NK sejtek, (T és B sejt alpopuláció) homoadhézió (N-CAM izoform) CD80, CD86 (B7-1, -2) professzionális APC: DC, B, monocita, makrofág kostimuláció, sejt adhézió CD28, CD152

20 A különböző sejttípusoknak jellegzetes fényszórásuk van előre irányuló fényszórás (FSC) („méret”) oldal irányú fényszórás (SSC) (pl.granuláltság) granulociták monociták limfociták

21 A vérminta vörösvérsejt mentesítéséhez használt módszer befolyásolja a megmaradó sejtek százalékos összetételét az eritrociták lizálásával kapott eredmény sűrűség alapú elválasztással kapott eredmény (Ficoll) hiányzó granulociták

22 összes sejt granulociták monociták limfociták A ”kapuzás” segítségével az egyes populációk külön-külön jellemezhetők (gating) granulocita „kapu” monocita „kapu” limfocita „kapu”

23 B A jelölés az elsődleges antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul NK Th Tc A mérés elve egy példán keresztül: A CD4+ (helper) és a CD8+ (citotoxikus) T sejtek arányának Meghatározása perifériás vérben (pl. AIDS progresszió nyomon követése) Jelölő anyagok: FITC jelzéssel ellátott anti-CD4 ellenanyag (α-CD4-FITC) PE jelzéssel ellátott anti-CD8 ellenanyag (α-CD8-PE) A perifériás vérben jelenlévő limfociták

24 Fókuszált lézernyaláb Th nagy sebességű folyadékáram (küvettában, vagy szabadon) CD4 FITC CD8 PE detektor A CD4-FITC jelölt (T H ) sejt detektálása jelfeldolgozó egység Képernyő A CD4+ CD8- sejtet szimbolizáló pont növekvő fényintenzitás

25 Tc detektor A CD8- PE jelölt (T c ) sejt detektálása CD8 PE CD4 FITC jelfeldolgozó egység növekvő fényintenzitás

26 B detektor A jelöletlenül maradt sejtek detektálása (pl.B sejtek) CD8 PE CD4 FITC jelfeldolgozó egység növekvő fényintenzitás

27 kvadráns statisztika CD8 PE CD4 FITC 38% 0% 44% 18%

28 Ábrázolásmódok 1. dot-plot contour- plot density- plot

29 Ábrázolásmódok 2. Hisztogramm

30 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) kapuzással elvileg bármely detektálható populáció kiválasztható, és elkülöníthető PMT 1 PMT 2 PMT 4 Laser Áramlási cella PMT 3 Minta fényszórás alapján specifikus fluoreszcencia alapján

31 Például: B1 sejtek elválasztása (CD19/CD5) NKT sejtek elválasztása (CD3/CD56) NK sejtek NKT sejtek limfociták

32 Az áramlási cella vibrációjának hatására folyadéksugár a frekvenciától függően, adott stabil helyen cseppekre bomlik breakoff point

33 Lézer vibráció Ha a szeparálandó sejt eléri a csepp-képződési pontot, a folyadéksugárra arra az időre elektromos töltés kapcsolódik, így a leváló csepp töltötté válik. Elektromosan töltött eltérítő lemezek Gyűjtőcső


Letölteni ppt "Tisztaság kinyerés avagy visszanyerés hatékonysága A számunkra érdekes sejtek fizikai elválasztása a heterogén populációból A különböző sejtek eltérő tulajdonságai."

Hasonló előadás


Google Hirdetések